Summary
彼らは生きた細胞から分泌される、単一ラベルのない蛋白質のリアルタイム光検出のためのプロトコルを提案します。これは干渉散乱 (iSCAT) 顕微鏡は、様々 な異なる生物学的システムや構成に適用することができますに基づいています。
Abstract
干渉散乱 (iSCAT) 顕微鏡、リアルタイムで個々 の生きている細胞から分泌される単一のラベルのない蛋白質を検出することができる方法を紹介します。このプロトコルでは、iSCAT 顕微鏡を実現し、調査の下で細胞の生存率を監視する追加画像チャンネルとそれを補完する基本的な手順を取り上げます。次に、彼らは我々 を不死化 B 細胞ライン (Laz388) を示す細胞から分泌されるように単一蛋白質のリアルタイム検出メソッドを使用します。顕微鏡やサンプルの準備だけでなく、記録されたデータの分析に関する必要な手順を説明します。ビデオ プロトコルを示しますその iSCAT 顕微鏡単一分子レベルでの分泌を調査する簡単な方法を提供しています。
Introduction
分泌されるタンパク質は、様々 な生理的過程1で重要な役割を果たします。このため、彼らは日常的に集団アンサンブル (プロテオミクス)、または個々 のエンティティ2,3として研究されています。プロテオミクスは伝統的など酵素抗体法 (ELISA), フローサイトメトリー、または質量4,5を経由して特定の生物学的システムで現在の蛋白質の全体のセットを調査します。 6。単一蛋白質、他の一方で、さまざまな蛍光7、8プラズモニクス9,10、または極低温電子11に基づく手法を使用して場合は検出されます一般的に々糸。これらすべての技法は複雑な商品、ラベル、またはその両方を使用して、動的情報に欠ける調査の下でシステムの長期的な情報のみを配信。
ここでサブ秒時間分解能14意味個々 分泌蛋白質 iSCAT12,13顕微鏡を使用します。重要なは、技術は蛋白質12,14日ごとに組み込み弱い散乱信号を検出します。その分極率と小さな bioparticle 散乱光の量をスケーリングします。蛋白質の形によって近似できます、効果的な散乱球14,15,16, と異なると仮定すると蛋白質がある屈折率とよく似て、計測された信号を直接することができます。タンパク質の分子量 (MW) に接続されています。参照による分子量対iSCAT コントラストの経験的な校正サイズの異なる蛋白質を区別することができます。iSCAT 実験は興味14のあらゆる蛋白質の特定の検出を実現する蛍光または散乱のラベルと同様、蛍光顕微鏡17,18、抗体試薬によって容易に補完ことができます。,17,19。
原則として、iSCAT はセカンダリ参照波と干渉の混合による蛋白質の弱い散乱光を増幅することによって機能します。検出された強度 (
)、iSCAT 顕微鏡によって記述されます
どこ
入射強度
参照波の貢献のための係数は、
研究の下でのナノ物質の散乱強度を示すと
、散乱の位相差は、参照波14。いずれか、透過または反射入射光参照波として各場合で用い
それぞれの透過率や反射率サンプル室のアカウントします。言葉
蛋白質の散乱断面に比例しクロスの用語と比較して無視することができます。したがって、設定
完全な破壊的な干渉の検出された光によって与えられる
、
参照強度と
干渉強度です。
iSCAT 顕微鏡では、分子レベルで生物学的過程を研究するための優れた方法を提供しています。Laz388 細胞を調べた例として-エプスタイン ・ バール ウイルス (EBV) 変換 B のリンパ球のセル行20,21 -と彼らは IgG 抗体16等のタンパク質を分泌します。ただし、メソッドは汎用的で、様々 な他の生物系に適用することができます。iSCAT は本質的に特定し、任意のタンパク質を検出することができます。 または特定のまたは多重検出一般的な表面機能化法でナノ粒子またはそれを拡張できます。そのシンプルさと蛍光顕微鏡などの他の光学技術と組み合わせることは、貴重な補完ツール iSCAT を作る、細胞生物学。
Protocol
任意の化学物質を使用する前にお読みください注意: すべての関連化学物質安全性データ シート (MSDS)、すべての適切な安全の実践などを観察し、必要に応じて個人用保護具 (レーザー安全メガネ、眼用保護具、手袋、実験室のコート) を着る。
1. 建物 iSCAT 顕微鏡16,18
注: iSCAT 顕微鏡は通常変更された倒立顕微鏡のセットアップので構成されます。簡単に言うと、レーザーは高開口数 (NA) 目的の後焦点面に焦点を当てて、結像レンズがカメラ チップの上に粒子の後方散乱光を集中する使用されます。一般に、この広視野顕微鏡をゼロから構築または既存の倒立顕微鏡に基づくできます。このプロトコルは、使用されるハードウェアの変更が可能なセットアップを実現するために不可欠な手順をカバーしています。ISCAT 顕微鏡のアセンブリのより詳細な説明は、アロヨらの仕事で見つけることができます。18。
注意: iSCAT 顕微鏡にはクラス IV レーザー光源にクラス IIIB が含まれます。適切な眼の保護は組立、顕微鏡光学系を調整するときに必要です。顕微鏡組立時にレーザービームの経路がストレートのまま、新たな光学部品を追加するとに偏向がないことを確認します。
-
顕微鏡の照明のパスを設定します。
- 高開口数 (NA) 目的を組み込んだ顕微鏡サンプル ステージ18減衰光学テーブル、堅い金属のブロックを使用して構築 (100 X 1.46/NA) とフォーカスの変更と同様、水平サンプル翻訳では、翻訳単位目的の位置。
メモ: 単一蛋白質を検出の限界で iSCAT 顕微鏡の操作は外部振動に非常に敏感です。すべての側面からサンプルをサポートする同心円ピエゾ ステージ焦点と横方向の安定性を危険にさらすそれ以外のサンプルの音響振動を制限する勧めします。図 1は、ピエゾの翻訳単位および目的など適切なサンプル ステージを示しています。さらに、次の手順で説明したすべての光学部品用大規模かつ安定したマウントを使用することをお勧めします。このようなコンポーネントは、商用光学サプライヤーから入手。 - 50 cm 焦点距離一重項レンズ (広視野レンズ) と 45 ° (垂直) 対物レンズの後焦点面に波長 445 nm ダイオード レーザーの光を集中するミラーを結合を使用します。これは目的のフォーカス前方に平行光を作成し、iSCAT 光源になります。必要な場合は、30 μ m のピンホールまたはシングル モード光ファイバー経由で 50 cm のレンズの前に空間的レーザーをフィルターします。
- 目的にイマージョン オイルの滴を適用し、顕微鏡ステージのサンプル面にガラス基板を配置します。これはイメージングの目的を途中で反射ビームになります。
注: 反射サンプル coverslip の上面の空気ガラス インターフェイスから発生し、iSCAT 参照光のための基礎となります。残留汚れやほこりが、カバーガラスの表面散乱ポイント ソースは、次の手順で画像の目的の正しい焦点の援助に上昇を与えます。
注意: レーザー光の大半、coverslip を介して送信、目的からまっすぐに移動します。不透明なスペキュラ ディフューザーを配置 (e.g。、紙カード) レーザー光による損傷のリスクを最小限に抑える coverslip の上。
- 高開口数 (NA) 目的を組み込んだ顕微鏡サンプル ステージ18減衰光学テーブル、堅い金属のブロックを使用して構築 (100 X 1.46/NA) とフォーカスの変更と同様、水平サンプル翻訳では、翻訳単位目的の位置。
図 1: iSCAT サンプル ステージ。写真中心の 100 と同様にマウントされているピエゾ翻訳単位 (ブラック) 大規模なアルミ ブロックを示しています x の目的。3 軸ピエゾ ステージの目的の焦点面のサンプルの正確な位置決めが可能です。粗い焦点は (描かれていない) 目的がマウントされているスレッド チューブを回転させることにより行われます。ブロックは、45 ° 鏡の上 4 つの鋼台座と光学テーブルに配置されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
-
顕微鏡のイメージのパスを設定します。
- 反射防止 (AR) をご紹介-広視野レンズの後, 入射と約 10 cm を基準にして 45 ° の角度でビームスプリッター (反射 70%、30% の伝送) をコーティングします。AR コーティングをレーザー光源に向いてください。これは、入射ビームを送信して参照を反映し、入射ビームに対して 90 ° の角度でビームの散乱します。
注: ゴーストとフリンジの影響は、ビーム分割キューブ、またはコーティングされていない平面ビームスプリッターを使用する場合に発生する可能性が、AR コーティングおよび/またはくさびビームスプリッターお勧めします。詳細については、ディスカッションを参照してください。必要な場合、ビームスプリッターの後ろ側から生じるあらゆる不要な反射光は虹彩絞りを使用してブロック可能性があります。 - 厚いビームスプリッターは、レーザーは、目的をまっすぐにもう入ることもありませんので、大きな梁の変位をご紹介いたします。必要な場合は、目的を正しく伝達されるようにビームスプリッター前にレーザービームの経路を再編成します。
メモ: ワイド フィールド レンズの前にビームスプリッターを追加も可能性があり、顕微鏡ステージ配置されます (ステップ 1.1.2) で、ビームは後で変位しないように。 - この時点で干渉計のイメージングの腕に焦点を当てるし、試料面とカメラが同焦点であることを確認します。凹 f の場所 = 入射パスで広視野レンズ後の位置 5 cm-45 cm レンズ。これは目的の背面の開口部に入る平行光になります。
- 干渉計の反射のアームに配置画面で、粗い焦点位置を見つけると垂直方向の目的を移動します。目的は、画面にあたる光を平行光にフォーカスです。
注:図 2は、このプロセスの概略を示します。 - 両方 f を削除 =-45 cm レンズと画面中心に粗が完了。
注: 負の焦点距離のレンズを使用する代わりに広視野レンズ自体に可動式マウント上に配置し、このステップのビーム光路からシフト アウトします。ただし、最も安定した顕微鏡構成を成し遂げるためには、固定位置に広視野レンズを保持する勧めします。 - 2 番目の f を追加 = 50 cm 一重項レンズと CMOS カメラ センサーの上に反射した光をコリメートする散乱光を集中します。レンズが再参照光をコリメートし、散乱光を集中するために対物レンズの後焦点面から 50 cm を置かれることを確認します。
- 場所 CMOS チップ f から 50 cm 50 cm レンズを = し、チップの中央に直接ビームを配置。
注: 次のパラメーターは、イメージングのため通常使用されます。レーザー (波長 445 nm) の出力電力は、100 に設定されて mW。ピンホールとビームスプリッター、目的を入力有効電力が約 9 に透過光を減衰させる mW。サンプル位置でのビーム径は、6 μ m になります。使用するイメージング レンズ システムの有効倍率は約 300 x です。CMOS チップ上のイメージのサイズは約 5 × 5 μ m2の視野の結果、照射領域内の 128 ピクセル 128 × に設定されます。図 3は、完全に組み立てられた iSCAT 顕微鏡の概略を示しています。
- 反射防止 (AR) をご紹介-広視野レンズの後, 入射と約 10 cm を基準にして 45 ° の角度でビームスプリッター (反射 70%、30% の伝送) をコーティングします。AR コーティングをレーザー光源に向いてください。これは、入射ビームを送信して参照を反映し、入射ビームに対して 90 ° の角度でビームの散乱します。
図 2: iSCAT 顕微鏡の粗中心します。回路図は、フォーカスにシステムをもたらすために光学系の配置を示しています。ビームスプリッターの AR コーティング裏面 (70/30 BS) 赤で示されます。グリーンは、重要な距離を提供しています。使用レンズの焦点距離 (f) が示されます。手順 1.2.6 - 1.2.7 青い破線のボックス内のコンポーネントが追加されました。凹レンズ (再集束 iSCAT 光をコリメートに使用) と画面は後で削除されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: iSCAT 顕微鏡。回路図は、完全に組み立てられた iSCAT 顕微鏡を示しています。ビームスプリッターの AR コーティング裏面 (70/30 BS) 赤で示されます。グリーンは、重要な距離を提供しています。使用レンズの焦点距離 (f) が示されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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画像の追加チャンネルを設定します。
注: このセクションは、大周辺 iSCAT レーザー明視野顕微鏡と蛍光顕微鏡による細胞生存率を監視するための観察ができる顕微鏡イメージングの別のパスを追加します。- カップルの LED 光源の出力 (約 500 nm < λ < 580 nm) に長い作業距離 20 X/0.4 NA 目的と焦点と LED 出力の横方向位置決めを可能にする上記のサンプル室機械コンポーネントをインストール、サンプルです。
- LED のスペクトルは細胞死のマーカー (ヨウ化 propidium (PI)) の励起範囲をカバーし、その蛍光 (λ > 600 nm) と干渉しない出力することを確認します。必要な場合は、光学フィルターを使用します。
- 上の目的を横方向に移動上 (広域) と下部 (iSCAT) 目標は、共線性がようにします。これは、画面下の低い目標を配置して画面上の送信 LED 光源の強度を最大化することによって決定されます。配置、λ = 550 nm ショートパス ダイクロイック ミラー (アーム) 送信 LED iSCAT レーザーの経路からの光を分割します。
- このビームを 8 %reflective/92% 透過ビーム分割 (BS) と 2 つのチャンネルに分割します。92% のパスは蛍光チャネル、8% パスは明視野イメージングに使用されます。
- 画像の f を使用して CMOS カメラに明るいフィールド チャネル 5 cm 色消しレンズを =。
- 画像の f を使用して別の CMOS カメラに蛍光チャネル 5 cm 色消しレンズと λ を = = 600 の nm ロングパス ・ フィルター励起光を遮断します。図 4 aは、すべての画像チャンネルを含む、完全に組み立てられた顕微鏡の概略を示しています。
- カップルの LED 光源の出力 (約 500 nm < λ < 580 nm) に長い作業距離 20 X/0.4 NA 目的と焦点と LED 出力の横方向位置決めを可能にする上記のサンプル室機械コンポーネントをインストール、サンプルです。
図 4: 単一細胞から分泌されるタンパク質の iSCAT 顕微鏡。(a)プロトコルで説明されている顕微鏡の概略図。詳細については、セクション 1 を参照してください。略語: LED、発光ダイオード。SPF、ショートパス フィルター;obj、目的;アーム、ショートパス ダイクロイック ミラー;BS、ビームスプリッター。ロングパス ・ フィルター LPFBF、明るいフィールド;蛍光、蛍光。C1 C3、カメラ 1-3。単一の(b)明視野イメージ Laz388 細胞 (白い正方形が描かれている) のビュー フィールド iSCAT から約 4 μ m です。C3 は、カメラで撮影した画像スケール バー: 10 μ m (c)蛍光画像とセルの位置 (b) に示すように同じ地域の白い丸でマークします。蛍光性の不在は、実行可能なセルがあることを示します。C2、カメラで撮影した画像スケール バー: 10 μ m (d)生 iSCAT カメラ画像スナップショット 80 μ 秒の露光時間で。C1 のカメラで撮影した画像。時空間背景差分ディスカッション セクションの説明に従って後に同じ領域の(e) iSCAT イメージ。イメージは 1000 連続生フレーム (d) 最後のフレーム時間で 400 ms の上統合されていた、ガラス基板の表面粗さを明らかにします。(f)対応差分 iSCAT イメージです、coverslip の上に 2 つのタンパク質の結合イベントを示しています。画像は、2 つの連続したフィルターが適用されたイメージ (e) を減算することによって建設されました。(D) でバーを拡張 (e) 及び (f): 1 μ m。この図は、マクドナルド、m. p.らから適応されています。16. 著作権 2018年アメリカの化学社会。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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コンピューターとソフトウェアを設定します。
- すべてのカメラをコンピューターに接続します。それぞれのドライバー パッケージをインストールおよびその制御のためのソフトウェアの取得/書き込み。
注: 適切なハードウェアは高速買収に必要です。最低限、マルチコア プロセッサ、16 GB の RAM、フレームグラバとデータ ストレージのためのソリッドステート ディスクはお勧めします。 - CMOS カメラで iSCAT 画像を観察し、ガラス基板上残留のほこりや汚れの粒子を見つけることによってフォーカスであることを確認します。粒子の画像回転対称の点広がり関数 (PSF) ことを確認します。
注: 非円対称の PSF の主な理由は、レーザー光では、ストレートが光軸に対して小さい角度で目的は入らないです。これが 45 ° 鏡と入射ビームの位置や角度を調整することによって修正します。 - 明視野と蛍光チャンネルのカメラ画像を比較します。両方がフォーカスされていることを確認同じエリアを表示します。ISCAT レーザーの位置は画像の中心部約ことを確認し、後で参照のための位置のメモを取る。典型的なカメラ画像の図 4b-4 階を参照してください。
注: は、2 つのチャネルの焦点を見つけるにセルのサンプルや蛍光ビーズを使用します。システムを調整する蛍光ロングパス ・ フィルターを一時的に削除します。セルの従来のイメージングのための焦点は iSCAT 焦点面よりわずかに高い必要があります。目的を移動せずに、これを補うため、それぞれ 2 つの f のフォーカスの位置からカメラを置き換えません = 5 cm レンズ。 - 必要なカメラのパラメーターを設定します。固定フレーム レートを使用し、ソフトウェアの利得や補正ツールを無効にします。
注: 次のパラメーターを使用: iSCAT カメラは 80 μ 秒の露光時間で 5000 フレーム/秒 (fps) に設定されています。前述のように、イメージのサイズは 128 × 128 ピクセルです。明視野と蛍光カメラは、フルフレーム サイズ (1280 × 1024 ピクセル) で動作します。明視野イメージングは、20 ms の露光時間で行われます。蛍光カメラ 750 ms 露光時間に設定されて、5 連続したフレームは、1 つの最終的なイメージを形成する累積されます。明視野と蛍光画像は、固定の 20 秒ごとに取得されます。
- すべてのカメラをコンピューターに接続します。それぞれのドライバー パッケージをインストールおよびその制御のためのソフトウェアの取得/書き込み。
2. 実験の準備
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ストック顕微鏡媒体の準備。
- HEPES 緩衝液 25 mL を追加 (1 mol/L) を 25 ミリ モル/L HEPES ソリューションの最終的な 1 L RPMI 1640 媒体の 975 mL。また、既に含まれている HEPES をバッファー媒体を使用します。
注: HEPES が周囲条件 (例えばインキュベーター外と一定の CO2供給なし) で測定中に培地の pH 値を維持するために使用されます。 - 実験に必要なソリューションの因数を取る、それは室温まで温。媒体の 2 mL で十分です。4 ° C で残り原液を維持します。
- HEPES 緩衝液 25 mL を追加 (1 mol/L) を 25 ミリ モル/L HEPES ソリューションの最終的な 1 L RPMI 1640 媒体の 975 mL。また、既に含まれている HEPES をバッファー媒体を使用します。
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顕微鏡キュベットを準備します。
注: 次の手順は、アルミニウム ベース プレートと、coverslip の修正し、圧電 3 D ポジショナーにカップルの両方アクリル キュベット料理から成るカスタム サンプル ホルダーに手順をについて説明します。ガラス底の市販の無菌培養皿も使えます。
注:図 5は、特注のサンプル ホルダーの写真を示しています。- 新しい顕微鏡観察を取るし、脱イオン水 (純水) とエタノールそれをすすいでください。空気は窒素と加圧空気スライドを乾燥させます。
- 500 W の高周波電力で 10 分間の酸素プラズマ雰囲気 (0.3 mbar 圧力) の coverslip をきれい。これは表面からすべて有機不純物を取り除きます。
- 0.2 mol/L の DI 水で約 10 分リンスの NaOH 溶液に浸漬することによりアクリル キュベット皿をきれい。
- 試料ホルダーを組み立てる、プラスチック シャーレ実験で必要になるまででそれをカバーします。
図 5: 特注サンプル ホルダー 。(a)サンプル ホルダー コンポーネント: (1) アクリル キュベット皿;(2) アルミニウム ベース プレート;(3) 固定するネジ。(4) シリコン o リング;(5) coverslip。(b)試料ホルダーが完成。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
-
顕微鏡を準備します。
- ISCAT 照明レーザー、明るいフィールド/蛍光照明 LED、カメラ、および取得のコンピューター/ソフトウェアをオンにします。目的の前に、の位置でレーザー ビームをブロックします。
- 100 X 確認/1.46 NA 目的はきれい。該当しない場合は、製造元のガイドラインに従って目的をきれいにするクリーニング ワイプおよびエタノールのレンズを使用します。
- 対物レンズに液浸オイルの滴を適用します。
- (セクション 2.2 で組み立て) サンプル ホルダーを取るし、サンプル coverslip、対物レンズを中心に、慎重に iSCAT 顕微鏡のピエゾ ステージでそれをマウントします。気配りと対物レンズを損傷しないように注意します。メーカー指定の規定最大トルクを超えないことを確保しながら親指ネジで圧電ポジショナにユニットを固定します。
- キュヴェットにストック顕微鏡媒体 (セクション 2.1 の準備) の 1 つの mL を追加します。
- 細胞死のマーカー16,22としてメディアに propidium ヨウ化染色の 2 滴を追加します。
- レーザーのブロックを解除しにフォーカス システムをもたらします。まず、目的が 1.2.3 の手順を繰り返すことによって、coverslip から適切な距離で配置されていることを確認します。-1.2.5。(図 2)。その後、ピエゾ ステージの z 軸でフォーカスを微調整します。
- 光源、カメラ、およびソフトウェアのすべての設定が正しく設定されていることを確認します。これは、レーザー出力、LED 強度、カメラ フレーム レート、カメラの露出時間やパスを保存ソフトウェアなどのパラメーターが含まれています。
注: ファイル サイズの大きいを作り出すことができる高フレーム レートで動画を保存します。コンピューターに十分な空きディスク領域ことを確認します。 - 再びレーザー ビームをブロックします。顕微鏡は、実験の準備が整いました。
-
セルを準備します。
注: Laz388 セル20 10% 牛胎児血清 (FCS)、アミノ酸、ピルビン酸、および抗生物質添加 RPMI 1640 培地で培養しています。セルが分割し、提供新鮮な培地ですべての 2-3 日2337 ° C、5% CO2でいます。- 細胞培養用フラスコをインキュベーターから取り出して約 1 x 10 の6セルを含む培地を吸引します。適切なボリュームを決定するには、診断法による培養細胞の濃度を定量化します。
- 携帯ソリューションを混ぜて室温で RPMI 1640 媒体の 10 mL とは 7 分間 300 x g でサンプルを遠心分離します。
- 慎重に抽出し、濃縮細胞のペレットの平静を保持しながら上澄みを廃棄します。
- 2.4.2 の手順を繰り返します。-2.4.3。細胞の集中ペレット。
- 再 0.5 mL 在庫顕微鏡媒体 (セクション 2.1 の準備) のセルを中断し、すぐに実験で使用します。
3. iSCAT 分泌細胞の顕微鏡観察
- セルの iSCAT レーザー光に直接さらされることを防ぐためにレーザー光線がブロックされていることを確認します。
- サンプル キュベットにセルを挿入します。
- サンプル キュベットにセルのサンプル (の準備セクション 2.4) 少し中心の約 3 μ L を注入します。そっと触れる、coverslip のピペット チップ、細胞液をゆっくりと注入します。上、解決するためのセルを許可します。
注: は、少量ピペット チップ (10 μ L) または長い、柔軟なゲルの読み込みヒントを使用します。 - 単一セル測定 iSCAT レーザー周辺の複数のセルに影響されないように、細胞密度 500 µm² あたり約 1 セルの下にあるを確認します。
- 細胞数は低すぎる、もう一度手順 3.2.1 だ場合まで十分な数は、利用可能なです。
- 細胞の適用範囲の密度が高すぎる場合、coverslip 細胞を分散させる追加顕微鏡の中の約 20 μ l 注入を使用します。
- サンプル キュベットにセルのサンプル (の準備セクション 2.4) 少し中心の約 3 μ L を注入します。そっと触れる、coverslip のピペット チップ、細胞液をゆっくりと注入します。上、解決するためのセルを許可します。
- ピエゾ ポジショナを使用すると、すぐ (約 10 μ m) にセル iSCAT 視野の位置に横方向にサンプルに移動します。445 nm レーザー光を直接浴びるはセルの有害であるかもしれないとセルは iSCAT 視野に入らないことを確認します。
- 明視野/蛍光画像を使用して見つけ、細胞の生存率25を確認します。
注: 実行可能なセル丸い形は、明視野像と細胞死、細胞22内 propidium ヨウ化の存在から生じる強い蛍光信号によって示されるに対し、蛍光ではないです。 - ISCAT レーザー ビームをブロック解除し、coverslip 表面がフォーカスまだことを確認します。ドリフトや周囲の環境からの音響結合を最小限に抑える免震テーブルを囲みます。
注: 後者は、重光カーテンまたは光学テーブルを囲むアクリル パネルします。 - ISCAT、明視野と蛍光のカメラから画像を取得して、測定を開始します。自動化および実験効率を最大化するソフトウェアを通じてプロセスを制御します。細胞の生存率およびシステムの焦点を定期的にチェックします。
注: レーザー強度、光学部品、カメラの露出時間の設定、に応じて iSCAT レーザー蛍光カメラと干渉する可能性があります。この現象が発生した場合は、iSCAT レーザーを蛍光画像集録中に一時的に閉鎖することを検討してください。
4. データ解析
注: 実験データは本質的にノイズの多い、iSCAT イメージは異なっています。入射光源、表面粗さの観察とカメラのノイズで波面歪みを含む典型的な iSCAT 測定におけるノイズのいくつかのソースがあります。以下のセクションでは、これらの騒音源が後処理によって改善がいくつかの方法を示します。また、セットアップの機械的不安定性横ノイズの多いデータを引き起こす、したがって、以下の説明に対処する必要があります。カスタムの MATLAB スクリプト記述の解析が実行されます。
- 高い空間周波数を除外する二次元フーリエ フィルターと raw データをフィルタ リングによってカメラのノイズを最小限に抑えます。フィルターのサイズは、特定の実験的構成 (主システムの開口によって決まります) に合わせて調整する必要があります。
注: 光学系より高い空間周波数のイメージ内の機能 (カメラの読み出しノイズ) などの外部ソースから、無視することができます。 - ISCAT は対照的にカメラの raw 数から画像に変換します。
注: カメラによって検出された信号は、
。iSCAT コントラストとして定義されている
、
部分が、coverslip によって反映されるこの場合参照光の強さと
間の干渉は、と散乱強度 (
)。- 別の信号をとの興味の粒子が存在しない特定のフレームの時間の平均を計算することによって。結果のイメージは、参照信号を提供します。
注: また、アクティブな背景減算手順可能性があります実行する以下の説明で説明したよう。 - よるとコントラストを計算
12,14,16。
- 別の信号を
- その後継者からそれぞれの連続したフレームを引いてローリング差分イメージを作成します。
注: 残留信号、カバーガラスの表面粗さから、彼らは連続したフレーム内で一定、波面の歪みは効果的にこの手順で削除されます。ローリングの差分は、1 つのフレームから次に発生するタンパク質バインドのみを残して、これらの残差信号を削除します。この動的な背景差分は、長期的なサンプルのドリフトに敏感だから、有益です。 - 検出とフレームごとに 1 つの粒子をインデックスし、彼らの特定のコントラストと位置を決定ピークを求めるアルゴリズムを適用します。
- タンパク質結合イベントのヒストグラムを作成し、その抽出したコントラストを知られていた蛋白質のサンプル14,24からコンパイルされた校正曲線を介してタンパク質質量に関連付ける手順 4.4 で収集した情報を使用します。
。iSCAT コントラストとして定義されている
、
部分が、coverslip によって反映されるこの場合参照光の強さと
間の干渉は、
)。
12,14,16。Representative Results
ISCAT 顕微鏡の模式図を図 4 aに示します。代表的な明るいフィールド、蛍光、および raw iSCAT 画像、図 4 b 4 c 4 d、それぞれ16のとおりです。図 4 eと4 階背景除去と差分のポスト処理の結果を表示します。2 つの吸着タンパク質が図 4 階で回折限界のスポットとして表示されます。図 6 125 にわたって検出された蛋白質のヒストグラムを示しています s。これらのデータは、ピークを求めるアルゴリズムをバインディング イベントをカウントし、そのコントラスト16のカタログ撮影した画像に適用することによって得られました。総数 503 タンパク質が検出されました。
次に、分泌された種は精製タンパク質溶液、または機能性ガラス面14,16追加測定実施参照の測定との比較による識別されます。ISCAT データしたがって、直接サブ スケール16細胞分泌動態を可視化します。例としては、以前、IgG 抗体 Laz388 secretome の主要な一部分であるし、2 番目16あたり約 100 分子の割合で細胞から解放されることを発見しました。さらに、100 kDa - 1000 kDa の範囲にわたる他の粒子は16セルによって分泌されます。説明メソッドのさらに採用など分泌物、16セルの周囲の空間の濃度勾配を調査したり細胞換散16のダイナミクスを確認できます。
図 6: 単一 Laz388 細胞から分泌されるタンパク質の定量化します。ヒストグラムは、125 s. コントラスト値は 1 × 10-4コントラスト箱 (青い棒) の蓄積の期間中に検出された蛋白質を示しています。503 個々 の蛋白質の合計は、この測定値の中に数えられました。実験と同様の結果 10 回を繰り返した。この図は、マクドナルド、m. p.らから適応されています。16. 著作権 2018年アメリカの化学社会。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
Discussion
役に立つ iSCAT データを入手する最も重要な側面の 1 つは coverslip 表面と、さらに正しい焦点位置を見つけることができる時間の長い期間のためのこの位置を保持します。これを行うに失敗した拡大 Psf、弱い iSCAT 信号および動力学解析にドリフト関連成果物になります。きれいな、裸 coverslip の焦点面を見つけること表面がない簡単な作業表面の特徴は大規模な参照ビーム背景表示されないが分かった (図 4 dを参照)。
生 iSCAT 画像は、励起ソースの波面不純物から生じる、正しい画像平面を見つけるための能力を妨げることができるバック グラウンド信号によってしばしば隠されています。アクティブな波面減算は、この問題を回避し、その後測定16中 iSCAT フォーカスを監視する便利な方法です。これを実現する方法の 1 つは、spatial サンプル変調を通じてです。簡単に言えば、関数発生器は、50 Hz の方形波を適用周波数 (290 nm 振幅) で空間サンプルの変調の結果、ピエゾ ステージの外部制御ポートに適用されます。同期カメラ買収は、同じソースからと、ロックの原理、波面補償画像14,16の結果を組み合わせる場合にトリガーされます。結果のイメージは、通常カバーガラス (図 4e) の表面粗さを示しています。洗浄後のガラスに残って小さな機能を使用して、焦点に顕微鏡を持って来ることができます。このアクティブな背景減算ステップに使用されるパラメーターは、フレーム レート、露出時間、またはハードウェアにより変更もあり。
前述のように、iSCAT セットアップ (ステップ 1.2.1。) の高品質ビーム ・ スプリッターの使用を推奨すると、ゴーストのような工芸品を画像としてまたは薄い平面ビームスプリッターから生じる干渉が画像に影響を与えるし、測定を妨げます。高品質と低品質のビームスプリッターの比較を図 7に示します。両方生 iSCAT 画像は、いくつかの残留粒子を含む coverslip の同じ領域を示しています。両方の画像をキャプチャする使用された同じ iSCAT セットアップ、ビームスプリッターのみが交換されました。図 7aはカメラの厚い (5 mm) の使用によって形成されたイメージを示しています AR コーティングとくさびのビームスプリッター。くさびの設計のためにビームスプリッターの裏面からの反射光は反射面に起因する反平行と客観的に入ることはありません。工芸品の干渉は発生しません。図 7 bのサンプルにビューの同じフィールドを示していますが、この時間薄く (1 mm) 平面ビームスプリッターを使用しました。ビームスプリッターの前面と背面の面から 2 つの反射は平行し、カメラに伝達します。干渉の工芸品が明確に表示されます。
図 7: iSCAT 画像の比較生産高と低品質のビームスプリッター 。(a) 5 mm 厚、AR コーティングおよびくさびのビーム ・ スプリッターを使用しての結果生 iSCAT イメージ。(b)結果生 iSCAT 画像 1 mm 厚い平面のビームスプリッターを使用して同じ領域の。両方のビームスプリッター同じ分割比率 (50% 反射、50% 透過) があります。フレネル反射に起因する干渉の工芸品が 1 mm 厚い平面ビームスプリッターで生成したイメージにはっきりしています。スケール バー: 2 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
このプロトコルでは、実現するために簡単に高速広域14上並列センシングが可能と、iSCAT の広視野照明スキームをについて説明します。音響光学偏向器 (AODs) を使用してサンプル12,17間で共焦点のビームをスキャンする一般的な方法です。この方法は高品質波面の必要があるが、従来の広視野イメージングよりもっと実験的複雑。さらに、共焦点光の速度は、AODs のによって制限されます。目的の実験的パラメーターに応じてどちら共焦点または広視野照明方式、原則として、利用できる生きている細胞から分泌される単一のタンパク質を検出します。
プロトコルで説明したように、顕微鏡の試料ステージで横方向の機械的変動を最小限に抑えることが不可欠です。サンプルの位置でもナノメートル偏差は、連続カメラ フレームの変化につながるし、差分画像で重要な余分なノイズを誘発することができます。したがって、機械的に安定したステージと減衰光学テーブル (手順 1.1.1。) を使用して (手順 3.5。) 実験中に光のカーテンやパネルを使用してセットアップをカバーするために勧めはします。
長期的な測定のため、アクティブなフォーカス安定化スキームが考え。このアプローチで 2 番目のレーザーは内部全反射 (TIR) 配置で顕微鏡に組み込まれて、その後象限フォト ダイオード上にイメージを作成します。システムのフォーカスの変更は、ピエゾ ステージ26の z 軸を制御するアクティブなフィードバック ループに使用することができるは、象限ダイオード上のスポットの TIR レーザーの水平変位に変換します。長期的な垂直ドリフト効果は従って除去します。
いくつかの変更と拡張機能は、アドレス特定実験ニーズに紹介したテクニックに適用できます。たとえば、商業顕微鏡ステージ インキュベーターがありますそれは iSCAT 顕微鏡細胞の長期的なイメージングのために容易に組み込むことが。ISCAT イメージングなどを補完するために他の技術を実装することも共焦点または TIR 蛍光顕微鏡17。ISCAT 分泌測定はを DMEM など DPBS、他の携帯メディアで実施することができる調査の下でシステムに適応するには、ただし、pH インジケーター フェノールレッド避けるべきであるそれはレーザ光の吸収による実験を邪魔することができます。さらに、牛胎児血清 (FCS) やひと血小板ライセート (hPL) のようなサプリメントは、iSCAT 検出と干渉するかもしれない蛋白質を含んでいます。実験の目的の感度に応じて、これらのサプリメントは、顕微鏡媒体から除外すべき。
iSCAT は散乱光に検体の能力に依存している-すべての蛋白質に本質的なプロパティ-はこうして本質的に非特異的なと。それにもかかわらず、特異性のある程度はタンパク質質量14,27,28直線 iSCAT 信号スケールとして可能です。ウシ血清アルブミン (BSA)、フィブリノーゲン14,27,28などの標準的なタンパク質試料を用いた iSCAT システムの校正が可能になります。実際には、非常に最近、若いら28 Piliarik & に対する14の仕事が拡張されていてその iSCAT はストレプトアビジン (53 kDa) のような小さなタンパク質の分子量 19 kDa の質量分解能と約 5 kDa の精度を決定する使用ことができますを示しています。いくつかの従来のアプローチは、特異性の余分なレベルを提供することによって iSCAT をさらに補完できます。例、酵素抗体法 (ELISA)、他の表面改質と標的タンパク質のみが検出された16タンパク質バインディング イベントを制限します。
このプロトコルで iSCAT 顕微鏡を使用してサブ時間分解能16タンパク質 1 分子レベルで細胞の分泌物を調査する方法について述べる。技術は一般的であり、任意の商用または自作顕微鏡に実装できます。単一分子蛍光のアプローチと対照をなして退色からメソッドを受けないまたは点滅効果が、それまだ単一蛋白質の感度を実現します。これらの機能は、iSCAT バイオセンシングと顕微鏡の分野で強力なツールを作る。将来のアプリケーションは免疫反応の刺激や細胞間コミュニケーションなど複雑な細胞間相互作用の解明に焦点を当てます。
Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
この作品は、ドイツ研究振興協会 (CRC 1181)、アレクサンダー ・ フォン ・ フンボルト教授、マックス ・ プランク協会によって支えられました。Laz388 細胞を提供して役に立つ議論のため Universitätsklinikum エアランゲン ステファニー · シェーファーに感謝しますテクニカル サポート、MPL でシモーネ ・ Ihloff とマクシム ・ シュワブに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Item/Device | |||
| 100x / 1.46 NA objective | Zeiss | 420792-9800-000 | alpha Plan Apochromat oil immersion |
| 20x / 0.4 NA objective | Leica | 566049 | N Plan |
| Piezo Stage | PI | P-517k020 | 3-axis stage with 100x100x10µm range |
| Diode laser (445 nm) | Lasertack | PD-01236 | |
| Optics/Optomechanics | Thorlabs/Newport | - | lenses, mirrors, posts, mounts |
| Pinhole | Thorlabs | P30H | |
| LED light source | Thorlabs | MCWHL5 | |
| Shortpass filter (580 nm) | Omega Optical | 580SP | to modify the spectrum of the LED for fluorescence excitation |
| Longpass filter (500 nm) | Thorlabs | FEL0500 | to modify the spectrum of the LED for fluorescence excitation |
| 70R/30T beam splitter | Newport | 20Q20BS.1 | |
| Economy beam splitter | Thorlabs | EBS1 | used for the comparison of fringe effects |
| Wedged plate beam splitter | Thorlabs | BSW26 | used for the comparison of fringe effects |
| Shortpass dichroic mirror (550 nm) | Edmund Optics | 66249 | |
| 8R/92T beam splitter | Thorlabs | BP108 | |
| CMOS camera | Photonfocus | MV1-D1024E-160-CL | for iSCAT aquisition |
| CMOS cameras | Mightex | SCE-B013-U | for bright field / fluorescence aquisition |
| Longpass filter (600 nm) | Thorlabs | FELH0600 | |
| Computer | Fujitsu Siemens | - | Core i7 Processor, 16 GB RAM, SSD |
| Acquisition Software | LabVIEW | - | LabVIEW 2016 Suite |
| Analysis Software | Matlab | - | Matlab 2014 Suite |
| Plasma Cleaner | Diener | Diener pico | |
| Incubator | Binder | Model CB | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Reagent/Material | |||
| RPMI 1640 medium | Gibco | 11835063 | without phenol red |
| HEPES Buffer Solution (1M) | Sigma Aldrich | 59205C | |
| Cover slides | Marienfeld | 107052 | |
| Glass bottom culture dishes | ibidi | 81158 | |
| Fluorescent Microspheres | Invitrogen | F8821 | used for calibration |
| Immersol immersion oil | Zeiss | 444960 | |
| Propidium iodide stain | Invitrogen | R37108 | |
| Small pipette tips | Eppendorf | 30075005 | |
| Flexible pipette tips | Eppendorf | 5242956003 | |
| Ethanol, 99.8% | Fisher Scientific | E/0650DF/15 | |
| Sodium hydroxide, pellets | Sigma Aldrich | 221465 | for preparing 0.2M NaOH solution |
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