Summary
在这项研究中, 我们提出了一个新的和有效的方案, 从 peyer 的补丁 (pp) 的淋巴细胞分离, 随后可用于体内和体外功能分析, 以及流式细胞仪研究的卵泡 t辅助和萌发中心 b 细胞。
Abstract
在肠道黏膜中, 免疫细胞构成了一个独特的免疫实体, 它促进免疫耐受, 同时增强免疫防御病原体。通过承载几个效应 t 和 b 细胞子集, 人们已经很好地证实了 peyer 的贴片 (pp) 在黏膜免疫网络中的重要作用。这些效应细胞、滤泡 t 辅助细胞 (tfh) 和生殖细胞 (gc) b 细胞的一部分在体液免疫调节方面具有专业化功能。因此, 在 pp 内对这些细胞亚群的分化程序和功能特性进行表征可以提供有关黏膜免疫的重要信息。为此, 一种易于应用、高效和可重复的从 pp 中分离淋巴细胞的方法对研究人员具有重要意义。在这项研究中, 我们的目的是建立一个有效的方法来分离淋巴细胞从小鼠 pp 具有高细胞产量。我们的方法表明, 最初的组织处理, 如使用消化试剂和组织搅拌, 以及细胞染色条件和抗体面板的选择, 有很大的影响质量和身份的分离淋巴细胞和实验结果。
在这里, 我们描述了一个协议, 使研究人员能够有效地从 pp 中分离出淋巴细胞群, 从而对 t 和 b 细胞子集进行可重复的流式细胞化评估, 主要侧重于 tfh 和 gc b 亚群。
Introduction
从开始到结束, 整个胃肠道都装饰着广泛的淋巴网络, 其中含有的免疫细胞比人类和小鼠1中的任何其他器官都要多。peyer 的贴片 (pp) 是这个细胞免疫组织的肠道分支的主要组成部分, 即所谓的肠道相关淋巴组织 (galt)2,3。在 pp 中, 成千上万的抗原来自膳食材料、微生物群和病原体, 正在不断取样, 必要时对其进行适当的免疫反应, 从而保持肠道免疫稳态。从这个意义上说, pp 可以被命名为 "小肠扁桃体"。pp 由主要的亚隔组成: 上皮下圆顶 (sed)、大 b 细胞卵泡区;t 细胞所在的上覆卵泡相关上皮 (fae) 和卵泡间区域 (ifr).这种独特的分块的 pp 使不同的效应细胞亚群合作, 从而赋予免疫能力的肠道。
pp 缺乏传入淋巴管, 由于这个原因, 从小肠输送到 pp 的抗原没有通过淋巴管进行, 而不是与大多数其他淋巴器官相比。相反, 位于 fae 的特殊上皮细胞, 即所谓的 m 细胞, 负责将腔内抗原转移到 ppp5中。随后, 被运输的抗原被树突细胞 (dc) 和吞噬细胞所吸收, 这些细胞位于 fae6,7下的上皮圆顶 (sed) 区域。pp 中 dc 的抗原分选过程对于启动自适应免疫反应8和随后产生的 iga 分泌细胞9至关重要。
由于同源植物区系和膳食材料的抗原负担很重, pp 在 tfh和 iga + gc b 细胞10等大量细胞中存在内源激活效应 t 和 b 细胞亚群, 这表明 pp 是活性免疫的部位响应11。在未接种的幼小 c57bl6 小鼠中收集的 pp 中, 可检测到 cd4 + t 细胞室中高达20–25% 的 tfh 细胞, 在总 b 细胞中可检测到高达 10-15%的 gc b 细胞。与其他 t 辅助细胞类型 (即th1、th2、th17 细胞) 不同, tfh 细胞对 b 细胞的独特取向主要是由于 cxcr5 表达, 从而促进 tfh 细胞沿 cxcl13 梯度13归巢。在 pp 的 b 细胞卵泡区, tfh 细胞诱导 iga 类开关重组和体细胞重组在激活的 b 细胞中, 高亲和力 iga 产生细胞从中分化14。随后, 这些抗体分泌的血浆细胞迁移到固有层 (lp), 调节肠道内的免疫稳态 10.
在 pp 中确定和鉴定 tfh 和 gc b 细胞群, 可以使研究人员在稳定状态下研究体液免疫反应的动态, 而无需耗时的免疫模型传统上用于 tfh-gc b 细胞研究 15、16、17、18。分析 pp 中的 tfh 细胞并不像其他细胞子集那么简单。技术挑战包括确定理想的组织制备条件、表面抗体标记组合, 以及选择适当的阳性和阴性对照。tfh 和 pp 研究领域在实验过程方面都表现出很大的差异, 由于几个原因, 它们远远没有就建立标准化协议达成共识。首先, pp 中的每个细胞子集往往受到组织制备条件的不同影响, 需要以特定于细胞的方式进行进一步的修饰。第二, 所报告的方法在 pp 细胞制备细节方面存在显著差异. 第三, 研究理想组织制备技术和实验条件的基于协议的比较研究的数量对于 pp 和 tfh 的研究是相当有限的。
目前基于协议的研究表明, pp 细胞制备19,20,21,22不是 tfh-或 gc b 细胞为导向。此外, 一些组织制备条件推荐的 ppp19,20 , 如基于胶原蛋白的消化被发现影响 tfh 的结果, 流式细胞术对结果进行了否定的18。在此基础上, 我们推断, 一个优化的、标准化的和可重复的协议, 可用于研究 ppp 中的 tfh 和 gc b 细胞动力学, 这对研究这一主题的研究人员将是有价值的。这种需要使我们有动力为 pp 淋巴细胞的分离和表征制定了改进的最新协议, 该协议经过了很好的优化, 可用于细胞恢复、活力和几个 t 和 b 的流式细胞仪表征的效率单元格子集。我们还旨在排除以前的协议中建议的几个费力的制备步骤, 从而减少从 pp 组织和细胞制备所需的操作和时间。
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Protocol
本议定书中描述的所有研究和实验都是根据贝丝以色列执事医疗中心动物护理和使用机构委员会 (iacuc) 的指导方针进行的。
1. 设计实验设置和鼠标组
- (可选)共同容纳实验小鼠, 以促进实验小鼠之间肠道微生物群的水平传递, 并减少 pp 淋巴细胞内的非特异性变异性。此外, 使用相同性别的垃圾配偶控制, 以最大限度地减少变异性。
2. 手术切除和组织准备步骤:
- 小肠 (si) 的手术切除
- 使用 co2 窒息或机构动物伦理委员会批准的任何等效方法对小鼠进行安乐死。
- 将鼠标转移到专门的区域进行手术切除。将背部向下放置, 用70% 乙醇对腹部进行消毒。通过切割从中端线从到肋骨笼子的腹部皮肤和腹膜进行剖腹手术 , 从而打开腹腔。
注: 在皮肤相对较小的部位进行第一个切口, 以避免穿透腹腔和损害肠道组织。继续切除, 直到所需的解剖边界。 - 识别盲肠, 这是一个理想的地标, 用于检测回肠末端, 它构成小肠的远端段。
注: 盲肠通常位于小鼠腹部的左下角。 - 确定伊莱卡采岛交界处, 并在这个水平上尽可能远端切割, 以将小肠与盲肠分开。在接下来的步骤中, 避免与肠道壁过度的物理接触, 因为脆弱的 pp 在接触时很容易崩溃。
- 轻轻去除整个小肠, 直到幽门括约肌切割使用剪刀肠系膜。确定幽门和十二指肠之间的交界处, 并在这个级别剪断十二指肠, 这将导致小肠完全脱离腹腔。
注: (i) 避免过度扩张, 因为这可能会导致肠壁破裂。(ii)如果除了 pp 淋巴细胞外, 还需要分离 lp 淋巴细胞, 则需要完全切除肠系膜脂肪。然而, 仅对于 pp 分离, 剩余的肠系膜脂肪可以在进一步的隔离步骤中提供一些好处;因此, 它应该被保存。 - 将分离的小肠放入一个6孔板充满冷 rpmi + 10% 的胎儿牛血清 (fbs), 并轻轻搅拌组织手动, 直到所有肠道段被淹没在冷介质中。在接下来的步骤中, 保持冰上的组织。
- 在解剖所需数量的小鼠小肠后, 从收集到的小肠进行 pp 切除。
- pp 的手术切除和单细胞悬浮液的制备:
- 用钳子抓住肠系膜脂肪, 轻轻地将小肠转移到纸巾上, 并将肠系膜一侧面向纸巾。用冷 rpmi + 10% fbs 滋润整个肠道段, 以避免组织脱水和粘性。
注: 在这一阶段, 仍然存在肠系膜脂肪是有帮助的, 因为 si 肠系膜部位的脂肪组织段将粘附在纸巾上, 使抗肠系膜部位朝上。 - 识别 pp, 它在肠道壁的抗肠系膜一侧呈 "花椰菜状" 形状, 呈白色多叶状集料。
注: 在所有 pp 切除之前, 不建议冲洗出腔内的内容。排空腔内内容可能会导致 pp 崩溃, 并将防止 pp 与肠道壁之间的颜色对比, 这对 p p 的视觉识别非常有帮助。 - 在识别抗肠系膜一侧的 pp 后, 将手术曲线端剪刀放在 pp 上 (曲线应面朝上), 从其远端和近端边界约束 pp。
可选: 用指尖轻轻地将 pp 推向剪刀的刀片。这种机动将导致更好地排除周围的非 pp 组织。轻轻地使用 pp, 不包括周围的肠道组织。
注: (i) 此步骤对于获得最大的 pp 细胞产量, 同时最大限度地减少来自邻近肠道隔间 (如 lp 和肠道上皮) 的细胞污染至关重要, 这些隔间中也含有丰富的 t 细胞。(二) 从 c57bl6 小鼠中切除一种 si, 可收集 5-10 pp (平均大小, 多叶)。通过瞄准更小的 pp (而不是多叶), 使用此协议可以收集每只小鼠多达12-13 个 pp (c57bl6)。 - 将切除的 pp 转移到12井组织培养板, 其中充满了冰凉 rpmi + 10% fbs, 并使用钳子或弯曲的手术剪刀在冰上保持。
注: (i) 在切除 pp 表面的 pp 后, 可以立即在纸巾上轻轻擦拭组织, 以清除 pp 表面的粘液和肠道内容。这一步骤将有助于提高 pp 淋巴细胞的生存能力。(二) 还可以根据总样品数量考虑将 pp 转移到不同的管, 而不是将 pp 转移到一个盘子上。 - 可选: 当 pp 切除并随后放置到井板中时, 可以通过拍摄含有 pp 的组织培养板的照片来记录从不同实验组/小鼠组收集的 pp 的数量和大小。
- 准备一套50毫升锥形管, 充满25毫升的 rpmi + 10% fbs (在37°c 预热)。使用一把剪刀, 从距离上剪下 1, 000μl 尖端的边缘, 使 pp 与1毫升移液器进行抽吸。用1毫升移液器吸吸 pp, 并将其从12孔组织培养板转移到制备的50毫升锥形管。
注: 对每个鼠标样本使用新的提示, 以避免样品之间的交叉污染。 - 将盖子固定, 并在37°c 下将管垂直放置在轨道振动台中, 以125–150转/分的连续搅拌10分钟。同时, 准备一套新的50毫升管, 并在每个管的顶部放置一个40μm 的电池过滤器, 通过它将准备单细胞悬浮液。
注: (i) 搅拌步骤将去除剩余的肠道内容、粘液和细胞碎片, 如果不去除, 这些物质会降低 pp 淋巴细胞的细胞活力和恢复。(ii) 不要在 pp 组织上应用任何类型的消化酶, 因为消化过程会导致细胞表面的 cxcr5 表达大幅丧失。 - 搅拌后, 将 pp 转移到放置在新制备的锥形50毫升管顶部的40μm 电池过滤器上。使用10毫升注射器柱塞的圆形侧面, 通过细胞过滤器轻轻破坏 pp, 产生单细胞悬浮液。用15–20毫升的冷 rpmi + 10% fbs 冲洗过滤器。
注: (i) 在过滤之前, 水平摇晃含有 pp 的管。这种短暂的晃动将有助于将 pp 转移到细胞过滤器中。(二) 建议使用70μm 细胞过滤器分离非淋巴细胞免疫细胞 (例如单核细胞、巨噬细胞、dc)。 - 在4°c 条件下, 以 350–400 x g 离心单细胞悬浮液10分钟。
- 小心丢弃上清液, 以 10 x 106 细胞的浓度重新悬浮细胞。用血细胞仪计数细胞。
注: (i) 在细胞计数之前, 可以使用以下公式大致估计每个小鼠 pp 组的总细胞数: "0.5-1 x106个单元格 x (pp 数目) = 细胞总数"。可能需要进一步稀释色氨酸蓝色的细胞计数。(二) 作为人工计数的替代办法, 可以使用自动单元格计数器。 - 以适当的体积 (例如200μl) 将 2-2.5 x10 6 个细胞转移到96孔圆底板中。
注: 对于单色和负对照样本, 0.5-1 x10 6个单元格可能就足够了。 - 在4°c 条件下, 以 350 x g 离心板5分钟。把盘子打开
- 在200μl 染色缓冲液中清洗细胞。
- 用钳子抓住肠系膜脂肪, 轻轻地将小肠转移到纸巾上, 并将肠系膜一侧面向纸巾。用冷 rpmi + 10% fbs 滋润整个肠道段, 以避免组织脱水和粘性。
3. 表面抗体染色
- 可行性染色:
- 最后清洗后, 在 pbs (1:1000) 中稀释的100μl 可固定活力染料中重新悬浮细胞。在冰上或在4°c 的黑暗中孵化30分钟。
注: (i) 用于检测 ffnp3 或 bcl-6 等关键转录因子的细胞内染色需要固定细胞。在这种情况下, 不能使用不可固定的活力染料 (例如, 7-aad、dapi)。(ii) 为稀释可固定的活力染料, 请不要使用任何含有蛋白质的染色缓冲液。此步骤中使用的介质必须不含蛋白质。(三) 使用活度染色排除死细胞至关重要, 因为死细胞会通过发射自身荧光和非具体结合表面抗体, 在流式细胞术分析中造成严重的技术困难, 这可能导致错误积极的结果。 - 用染色缓冲液清洗细胞两次。在4°c 条件下, 以 350 x g 离心5分钟。把盘子打开
- 最后清洗后, 在 pbs (1:1000) 中稀释的100μl 可固定活力染料中重新悬浮细胞。在冰上或在4°c 的黑暗中孵化30分钟。
- fc 块和表面层 i:
- 在染色缓冲液中稀释抗 cc16/32 抗体 (1:200), 制备 fc-阻滞溶液。
- 将细胞重新用于制备的 fc-块溶液的20μl 中。在冰上孵化15分钟。
- 在不清洗的情况下, 加入在适当稀释下制备的80μl 表面抗体鸡尾酒 (抗体摘要见表 1 )。在冰上孵化至少30分钟。
- 加入过多的染色缓冲液清洗两次。在4°c 条件下, 以 350 x g 离心5分钟。把盘子打开
- 表面-第二层:
- 在染色缓冲液中稀释荧光色素共轭链状双白蛋白, 制备链状维丁染色溶液。
- 最后清洗后, 用100μl 的预稀释链霉素 (1:100) 染色溶液重新悬浮细胞。在黑暗中冰上孵化至少15分钟。
- 用染色缓冲液清洗两次。在4°C 以 350 x g 离心5分钟。把盘子打开
可选: 如果不希望细胞内染色的滤泡调节 t 细胞检测, 最后一次清洗后, 重新悬挂细胞在200μl 的染色缓冲液, 并转移到适当的管, 以获取流式细胞仪中的数据。当样品没有固定时, 应在3-4小时内通过流式细胞术采集数据, 以获得准确的结果。
4. 固定细胞
- 使用 fnofp/转录因子染色缓冲液组中的试剂准备固定/渗透剂 (fix/perm) 工作解决方案。将固定-渗透剂的一部分与固定-渗透稀释剂的三部分混合到所需的最终体积。
- 最后清洗后, 在200μl 的 fix/perm 工作溶液中重新悬浮细胞。
- 在冰上或4°c 下将盘子生20分钟。此步骤不要超过20分钟。较长的孵育时间可能会严重降低细胞的恢复。
- 在4°c 条件下, 以 350 x g 离心5分钟。把盘子打开(可选)在这一步之后, 固定细胞可以在4°c 的染色缓冲液中储存几天, 其中含有牛血清白蛋白 (bsa) 或 fbs, 直到随后的细胞内染色或流式细胞仪采集。
- 将细胞重新注入200μl 的渗透性缓冲 (x1), 在纯化的去离子水中进行新的预稀释。
- 在室温 (rt) 下, 以 350 x g 离心5分钟。
- 用200μl 的渗透缓冲液和离心机在 350 x g 下清洗一次, 在 rt 清洗5分钟。
5. 细胞内染色
- 在渗透缓冲液中稀释抗 cc16/32 抗体 (1:200), 制备 fc-块溶液。
注: 固定步骤后, 细胞必须保持在渗透缓冲液中, 直到细胞内染色过程结束。 - 最后清洗后, 在20μl 的 fc 块溶液中重新悬浮细胞。在黑暗中在 rt 中孵化10-15分钟。
- 无需洗涤, 加入80μl 的细胞内抗体鸡尾酒 (100μl 最终体积), 在渗透缓冲液中预稀释。在 rt 孵化30分钟。
- 在 rt 以 350 x g 的速度添加100μl 的 perm 缓冲器和离心机5分钟。
- 用200μl 的渗透缓冲液清洗一次, 离心机以 350 x g 的速度清洗5分钟。
- 最后清洗后, 在200μl 染色缓冲液中重新悬浮细胞, 并将细胞转移到适当的管中 (染色缓冲液中的最终体积为 400μl), 并通过流式细胞术获取数据。如果有带板式读取器选项的流式细胞仪, 则在96孔板中染色的样品也可以在不转移到管道中的情况下运行。此步骤可最大限度地减少细胞转移过程中的细胞丢失。
- 在流式细胞仪上获取至少 5 x10 5个总细胞, 以便能够对 tfh、tfr 以及 gc b 细胞进行重现性分析。
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Representative Results
与以前的协议20不同, 我们观察到 pp 在整个 si 中分布不均匀, 而是更密集地分布在 si 的远端和近端, 如 图 1 a 所示.流式细胞仪分析显示, 如果遵循正确, 我们的协议给出了一个 pp 淋巴细胞群, 显示向前散射分布类似于脾细胞 (图 2a, e , 2A, h) 与 & gt;95% 细胞(图 2F和2f)。与其他继发性淋巴器官 (slo) 相比, c57bl6 小鼠约占 pp 淋巴细胞总数的 70-80%, 由 b 细胞组成, 而 cd4+ t 细胞仅占 pp 淋巴细胞总数的 10–15% (图 2G和2g)。
请注意, cd4 + cd19+双阳性 (dp) 细胞占 pp 淋巴细胞总数的第 1%.在细胞制备过程中采取一定的预防措施, 如对 b 细胞的 fc-bloan 受体进行 fc-blo25, 不包括双细胞, cd4+ cd19 + dp 细胞群可以最小化 (图 3 a和b)。然而, 一小部分没有显示双细胞的正向散射 (fsc) 特性的 dp 是不可避免的, 应该从单个正 t 和 b 细胞门门门 ( 图 3b)。我们的研究结果表明, dp 细胞内的 b 细胞在其表面 (图 3c) 上高度表达 cxcr5, 这可能会导致 tfh门的假阳性结果, tfh 门根据 cxcr5 在 cd4 + t 细胞中的表达进行调整。另一方面, 我们发现, gl7,激活 b 细胞的标记, 也表达在 cd4 + cd19+ dp 细胞 (图 3d),这可能会导致干扰 gc b 细胞门控。
tfh 和 gc b 细胞门控算法的示例如图 4所示.对于 gc b 细胞门控, 我们使用 gl7 标记与 cd38, 它将 gc b 细胞标识为 gl7+ cd38-b 细胞 (图 4a-b)。可以使用 pna 标记代替 gl723,而 cd38 可以替换为以下标记之一: igd、bcl-6 和 cd95。gc b 细胞的替代门控策略如图 s1所示。gc b 细胞比在 pp 中表现出很大的变异性。然而, 与其他 slo 相比, pp 在稳态条件下的 gc b 细胞比明显较高, 占 b 细胞总数的2-10。pp tfh 细胞的起动策略被描述为 cd19-cd4 + pd-1hi cxcr5+ t 细胞 (图 4a, c)."斑马图" 被认为是 tfh 门控的最佳演示方法, 因为与其他地块类型相比, 它更谨慎地描述了 pd-1hi 人群(图 4c)。tfr 是表达 foxp3 的 tfh 细胞的子集, 它被门控为 cd19-cd4 + pd-1 hi cxcr5+ foxp3 + t 细胞 (图 4d). 与 gc b 细胞一样, 未免疫的小鼠体内的 tfh 细胞分数也各不相同, 其范围为 cd19-cd4+ pp 淋巴细胞的 10–20%.tfh 细胞的替代门控算法的详细信息如图 4e、f和图 s1c、d 所示.
为避免因背景染色和自体荧光而产生的伪阳性, 应将同型控制或其他等效对照 (如荧光 minus one (fmo)) 作为 tfh 和 gc b 细胞标记的阴性对照包括在染色面板中 (图 4g-j)。
为了优化 pp 组织制备的条件, 我们开发了一种新的内部控制实验策略, 从一只小鼠身上收集 pp, 并根据其解剖来源 (例如, 十二指肠、十二指肠、回肠)。为了进行实验, 将集合 pp 分配给各个组, 以便每个实验组和对照组包括来自每个解剖区域的相同数量的 pp (图 5a)。通过这种方法, 我们发现, 胶原蛋白为基础的酶消化 (以37.5 毫克的胶原酶 ii 或 iv 为每25毫升的消化混合物 = 1.5 mg/ml), 这是通常用于从各种粘膜组织中分离淋巴细胞, 显著降低了 cxcr5pp 淋巴细胞的表达 (图 5b), 特别是 tfh 细胞的表达(图 5f-i), 而其他表面分子 (如 cd19、cd4) 的表达保持不变 (图 5c-e).cxcr5 检测的减少是突出的, 因此 cxcr5 在胶原酶处理的 tfh 细胞上的表达几乎与同型对照无法区分 (图 5F-I)。进一步的实验表明, 酶消化对 cxcr5 表达的干扰程度取决于所使用的 cxcr5 抗体克隆 (图 6a-f)。具体而言, 在胶原酶 ii 治疗中, 与 cxcr5 抗体克隆 l138d7 (图 6a-d) 相比, cxcr5 抗体克隆2g8 的检测能力受到更明显的损害。
酶消化不仅降低了 cxcr5 的表达, 也降低了由 fsc-sc 特征确定的 pp 细胞中总淋巴细胞的比例, 而从消化的 pp 中分离出的相当一部分细胞表现出正向和相反的比例比 pp 淋巴细胞更强的散射 (图 7a-c).胶原酶对细胞恢复的影响是以剂量依赖性的方式发生的 (图 7a, h-j)。酶消化增加了细胞的活力(图 7d, e)。然而, 这种好处并没有与胶原酶消化有因果关系, 因为在没有胶原酶的搅拌后从 pp 中分离出的细胞也同样受到青睐(图 7f).在 tfh 分离过程中, 通常评估 tfr 细胞, 而在37°c 时, 无论胶原酶消化情况如何, 核转录因子 foxp3 的检测都得到了改善, 因此这一点在这里特别令人感兴趣 (图 7g)).
图 1: 小鼠 pyer 的补丁的宏观结构和解剖分布.(a). 从小肠十二指肠端与胃获得的图像。十二指肠中两个位置紧密的 pp 用黑色箭头表示。从11只 c57bl6 小鼠身上采集的 pp 单独储存在一个12个井板中。(c). 在40μm 电池过滤器上显示的新切除的鼠标 pp 的图像。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: pp 淋巴细胞的流式细胞仪表征和基本门控算法.点图显示了新鲜分离的未固定 pp 淋巴细胞沿 fsc 和 ssc 轴的分布, 这些淋巴细胞与 (d) 中描述的脾细胞表现出很大的相似性。(b). 通过7aad 表达排除死亡细胞。7aad-细胞代表活细胞。(c). 基于 cd19 和 cd4 的 t 和 b 细胞免疫表型。(e-g)。固定 pp 淋巴细胞的代表性流动分析。固定脾细胞的代表性流动特性。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3:cd4+ cd19 + 双阳性 (dp) 细胞在 tfh 和 gc b 细胞门控中产生假阳性. (一)。显示活 pp细胞内的 cd4+ cd19 + dp 淋巴细胞。(b). 基于 fsc 特性的 dp 细胞分离, 如双片和单元。(c,d)。直方图图中描述了 cxcr5 和 gl7 dp 细胞的表达。请点击这里查看此图的较大版本.
图 4: tfh 代表和 gc b 细胞门控策略.从3个月大的小鼠身上收集了 pp, 并按照《议定书》部分所述分离了淋巴细胞。 (a) 描述了活 pp 淋巴细胞的 cd19 和 cd4 标记。(b) cd38logl7 hicd19+ b 细胞被门控为 gc b 细胞.(c) tfh 细胞被门控为 cxcr5+pd-1hi cd4+细胞。(d) tfr 细胞是 tfh 细胞的一部分, 表达了调节细胞特异性转录因子 foxp3和tfh 标记, 并作为 cxcr5 + pd-1hi foxp3+ cd4+ t 细胞门控。(e-f)利用 bcl-6 表达法, 在从 np-ova 免疫小鼠中分离出的脾细胞中证实 tfh 表面标记的键化策略。(g-j)描述了关键 tfh-tfr 和 gc 细胞标记的荧光小物一 (fmo) 控制。请点击这里查看此图的较大版本.
图 5: 基于胶原酶的酶消化导致 cxcr5 检测量大幅减少.(a) 分别收集和汇集位于十二指肠 (近端)、空肠 (中) 和回肠 (远端) 的2个月大的小鼠的 pp。集合的 pp 平均分配给实验组。在37°c 时, 以 1.5 mgml 浓度的胶原酶 ii 或 iv 进行酶消化, 搅拌10分钟。(b-e)直方图图, 描绘从 pp 中分离出的细胞的表面分子 (cxcr5、cd19、pd-1、cd4) 的表达, 这些细胞经过胶原蛋白的消化。(f-i)在斑马地块中, 在胶原酶管理的组和对照组内显示 tfh 门控。数据代表三个独立的实验。请点击这里查看此图的较大版本.
图 6: 根据抗 cxcr5 抗体克隆的不同, 胶原酶对 cxcr5 表达的影响有很大差异.从6个月大的小鼠中收集的 pp 淋巴细胞, 结合使用的抗体克隆和酶消化应用, 汇集并分离成不同的组。(a-f)tfh 细胞的比例描述在斑马地块内的前门控活, cd19-cd4+ t 细胞. (a、c和e) pp 细胞被生物素共轭抗小鼠 cxcr5 抗体 (2g8 克隆) 和链旋替维丁与 bv421 氟铬结合。 (b、d和f) pp 细胞用主要共轭抗小鼠抗 xcr5 抗体 (l138d7 克隆) 染色。 (a-b) tfh 门控图从未消化的 pp 淋巴细胞。 (c-d) ppp 在37°c 下用胶原酶 ii (消化混合物的 20 mg ml) 消化并搅拌10分钟。数据代表两个独立的实验。请点击这里查看此图的较大版本.
图 7: 在37°c 下, 基于胶原蛋白的消化和搅拌会影响细胞活力、恢复和细胞内染色效率.牺牲了3个月大的 c57bl6 小鼠;如图 5a所示, 收集和汇集了 pp。(a) 收集 pp 后, 在胶原酶 ii (37.5 mg/25 ml) 存在的情况下, 组织被搅动 10分钟, 固定 pp 细胞的 fsc 和 ssc 特性在 (a) 中描述, 可行性染色图 (d). (b, e) 收集 pp 后, 组织被保存在冰上, 没有搅拌或酶消化;在 (b) 中描述了固定 pp 细胞的 fsc 和 ssc 特征, 并在 (e) 中描述了活力染色。(c, f)收集 pp 后, 在没有胶原酶的情况下, 在37°C 时, 组织在125-150 转/分处搅拌 10分钟;分别描述了固定 pp 细胞的 fsc 和 ssc 特征及活力染色 (c, f)。(g) 直方图图中描述了从不使用胶原酶的激动和不激动的 pp 分离出的调节 t 细胞中 foxp3 表达的比较。(h-j)从6个月大的 c57bl6 小鼠收集的 pp, 并使用不同浓度的胶原酶 ii/25 毫克, 每25毫升消化混合物15毫克, 或无胶原酶。介绍了 fsc 和 ssc 图, 揭示了酶消化对聚丙烯细胞恢复和产量的影响。请点击这里查看此图的较大版本.
图 8: cxcr5 的分子模型和完整氨基酸序列.(a) 建立了 cxcr5 的七通跨膜蛋白结构。 (b) 证明了 cxcr5 的完整氨基酸序列。细胞外区域的序列用红色表示, 细胞外氨基酸与可能的胶原酶敏感化学键被证明在黄色。请点击这里查看此图的较大版本.
| 抗原 | 克隆 | 氟铬 | 稀释 |
| cd4 | gk1.5 rm4-5 | apc, pecy7, perccy5.5, fitc | 1: 100 |
| cd19 | 6d5 | fitc, apccy7 | 1: 100 |
| pd-1 | j43 | pe f 610 (得克萨斯红) | 1: 100 |
| icos | 15 f9, 7e.17g9 | 体育 | 1: 100 |
| gl7 | gl7 | percp/cy5。5 | 1:75 |
| cxcr5 | 2g8,l138d7 * | 素 | 1:50 |
| bcl-6 | 7d1 | pecy7 | 1:50 |
| foxp3 | fjk-16 | apc, pe | 1: 100 |
| 斯特雷普塔维丁 | - | bv421, pe | 1: 100 |
| 固定性染料 | - | bv 510(AQUA) | 1:1000 |
| 7aad | - | percp/cy5。5 | 1: 500 |
| fcblock (cc16/32) | 2.4 g2 | - | 1: 200 |
表 1: 抗体摘要.指出了相关抗体和活力染料的稀释、克隆和荧光铬共轭。最佳稀释可能因实验条件和产品的批量生产质量而异。主要 bv421 共轭 l138d7 克隆在1:20 稀释时显示 cxcr5 检测能力与生物素共轭2g8 克隆在1:50 稀释时相当。因此, 初级共轭 l138d7 可作为生物素共轭2g8 克隆的替代品。
图补充 1 (s1): tfh 和 gc b 单元的替代门控策略.(a) 描述了 c57bl6 背景下3个月大的小鼠的活 pp 淋巴细胞。(b-c)gc b 细胞被门控为 cd38-gl7+ (b) 和 bcl-6 + gl7+ b细胞(c)。(d-e)tfh 细胞被描述为 pd-1hi cxcr5+ (d) 和 icos+cxcr5+ cd4+ t 细胞 (e)。请点击此处下载此文件.
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Discussion
在这里, 我们描述了一个优化的协议流式细胞仪表征 tfh 和 gc b 细胞。我们的协议的主要优点之一是, 它能够从单个小鼠 (c57bl6 菌株) 中分离出多达 107 (平均 4-5 x 10 6 细胞) 的总 pp 细胞, 而无需任何消化过程。我们观察到, 细胞总产量与 pp 的数量呈正相关, 可以从以下简单的方程中估计出来, 这对实验规划很有帮助: "每只小鼠的总 pp 细胞计数 = 0.5–1 x (每只切除 pp 的数量鼠标) x 106 "。这种高细胞产量得到了增强细胞活力 (gt;95) 的补充。通过改善细胞恢复和活力, 可以同时使用各种抗体染色板对 pp 中的各种淋巴细胞亚群进行流式细胞化分析。
与德赫苏斯等人最近公布的 pp 隔离协议相比。20和以前的报告 19,21, 我们的协议给出了相当高的细胞总产量和生存能力, 尽管没有消化胶原酶。尽管对首次调查的人员来说, p p 的识别可能 "很棘手", 但这一协议的学习曲线相当陡峭, 如果掌握了, 我们的技术可以在短时间内识别小肠中的 p p 并进行手术切除时间。如果第一次尝试后没有达到所需的 pp 号, 我们建议重复以 si 远端和近端为重点的 pp 识别步骤。在我们的实践中, 几乎在每只老鼠身上, 可检测到十二指肠末端的两个紧密位置的 pp (图 1a) 和回肠最后5厘米内至少2-3 个 pp。
与 pp 内的其他细胞子集相比, tfh 染色的要求更高, 因此需要额外的注意18。如果在组织处理和细胞分离过程中错过了某些步骤, 结果可能会产生相当大的误导性。因此, 我们建议研究人员注意以下实验 "提示"。由于关键的 tfh 和 gc b 细胞标记 (如 cxcr5 和 gl7) 可以在 b 和 t 细胞中表达, 因此在抗体面板中加入 b 细胞标记以避免因污染 cd19+cd4+ dp 细胞24而产生假阳性结果至关重要 (图 2)。请注意, 基于 t 细胞标记的门控策略仅为25个提供足够的 dp 细胞排除, 因为这些细胞也高度表达 t 细胞标记, 包括 cd3 (未显示数据) 和 cd4。除了排除 dp 细胞外, 流式细胞仪检查结果还应通过使用适当的阴性对照 (例如, 同型对照、fmo) 进行验证和确认。不仅是假阳性, 而且错放 tfh 门也会导致错误的结果和结论。tfh 门的调整有时可能具有挑战性, 特别是在 tfh 细胞群不丰富的情况下, 因此在流式细胞术中不会出现离散群体。为了规避这一限制, 在抗体面板中添加多个 tfh 标记 (例如, bcl-6、pd-1、icos) 可能会提供其他门控机会, 并提高准确性26。由于实际原因, bcl-6 被认为是替代 tfh 门控的理想共染色标记, 因为它可用于同时对 gc b 细胞进行门控 16 (图 s1c)。
此外, 有一个包含高 tfh 比例的阳性对照样本可以为研究人员正确放置 tfh 门提供良好的导航。在我们的实验中, 我们使用老年小鼠 (6个月以上) 的 pp 样本作为阳性对照, 因为我们发现衰老会导致 pp 内 tfh 细胞在稳定状态下增强 tfh 细胞, 最高可达 cd4+ t 细胞总数的 40% (数据未显示)。我们还鼓励对 tfh 染色的技术细节有进一步兴趣的研究人员查看已出版的 tfh 细胞染色18协议书中的方法。
测试 pp 中的实验假设可能比较具有挑战性, 并且可能需要非常多的小鼠每组达到统计意义21。利用协议的高细胞产率, 我们通过以下实验策略规避了这一障碍。首先, 我们切除 pp, 并根据其解剖来源 (例如, 十二指肠、空肠和回肠) 对其进行分类。然后, 我们将这些集合 pp 均匀地分配到不同的实验组和对照组。这种内部控制的实验策略使我们能够最大限度地减少小鼠的个体间差异, 而所有细胞都是从一只老鼠获得的。
此外, 由于实验组和对照组由相同数量的 pp 组成, 防止了不同肠道隔间 (如十二指肠与回肠 ) 之间的变异性 (以前报告的显著为 2)。解剖区域 (图 5a).通过使用相同的方法执行独立实验的复制, 我们提高了结果的可靠性和意义。除了消除非特异性的变化, 这种方法还有助于备用小鼠, 试剂和时间。
在我们协议的开发和优化过程中, 我们的结果显示, 胶原酶 ii 和 iv 基消化显著降低了 cxcr5 的表达 (图 5b), 而用于检测 tfh 和 gc b 细胞的其他表面分子保持不变 (图 5 c-e).在最近报告的 jove 协议19中, 胶原酶 ii 被证明对从 pp 和 lp 中分离淋巴细胞非常有效。然而, 胶原酶 ii 此前曾被报道具有较高的胰蛋白酶活性, 这导致几个表面分子的裂解。鉴于其表面分子友好性质 27由于较低的色氨酸活性和更常见的用法, 在文献28,29, 30 中, 胶原酶 iv 还包括在胶原酶 ii 之外。我们的研究和使用的浓度, 在这些前报告中建议。胶原酶和等效酶的使用一直是黏膜免疫学中的一个矛盾问题, 因为消化对免疫细胞的有害影响, 如表面分子表达改变 31,27。
此前有报道称, 使用不同类型的胶原酶可能会干扰人肠道32和扁桃体样本18内的流式细胞仪 cxcr5 检测. 相反, 其他研究表明, tfh 和 gc b 细胞与 pp 分离, 而不使用胶原酶24,33。然而, 到目前为止, 还没有采取比较方法来评估纳入或排除胶原酶消化是否构成从小鼠 pp 中分离 cxcr5 表达 tfh 细胞的最佳条件。与其他跨膜蛋白 (如 cd4、cd19) 相比, 具有相对较短的细胞外区域的长七通膜蛋白, 这些蛋白在 pp 中的淋巴细胞中得到大量表达 (数据来自 unprot)。在图 8a-b中, 用基于胶原酶的消化的假定目标序列描述了小鼠 cxcr5 的分子模型和总氨基酸序列, 该序列倾向于在甘氨酸 (gly) 和中性氨基酸之间分离化学键酸34。七通跨膜分子结构导致细胞外域短可能是导致 cxcr5 分子易受到酶消化的影响 (图 8a)。有趣的是, 我们发现胶原酶治疗后 cxcr5 表达的检测取决于所使用的抗体克隆。虽然2g8 和 l138d7 克隆在未消化 pp 组表现出类似的性能, 这是由可比较的 tfh 组分检测确定的, 但在消化 pp 组中, l138d7 克隆在 cd4 + 范围内显示出约 3倍 (约 9%) 的 tfh 细胞分数t 细胞比2g8 克隆 (3%)(图 6)。这一发现表明, 减少 cxcr5 染色可能是次要的修改三维表位配置的酶活性的胶原酶酶。我们的研究结果表明, 在聚丙烯制备过程中, 必须避免基于胶原蛋白的消化。
通过排除消化步骤, 规避了胶原酶离解对 cxcr5 分子检测的干扰。然而, 应当指出的是, 对于 lp 等一些组织, 机械干扰不足以分离细胞, 对于此类组织, 需要19酶消化。在未来, 它将是必要的测试替代消化条件, 以及消化兼容的抗体克隆, 以绕过这种技术限制的组织需要酶消化过程。在此之前, 成像技术, 如免疫荧光显微镜将继续作为 tfh 检测的首选方法, 在这些组织。除了分离 lp 细胞外, 从 pp 中分离某些造血细胞亚群 (如 dc 和血浆细胞) 还需要酶消化35。在使用我们的协议时, 希望从 pp 中分离这些细胞亚群的研究人员应包括适当的酶消化步骤20。应考虑酶消化对 dc 标记表达的可能干扰, 并根据需要优化消化条件。当需要分离 tfh 和 gc b 细胞, 除了需要胶原酶消化36的细胞子集时, 从每只小鼠收集的 pp 可以分成两组, 在平行面板中进行处理, 并在平行面板中进行处理。
胶原酶对 pp 淋巴细胞的影响并不局限于表面分子的表达。我们的结果显示, 酶消化导致在 pp 细胞内的淋巴细胞比例相对下降, 以剂量依赖性的方式 (图 7)。淋巴细胞分数的减少可能是胶原酶介导的其他类型造血细胞亚群 (如来自 pp 的吞噬细胞和 dc) 释放的结果, 这些亚群比淋巴细胞大、颗粒更大。胶原酶消化介导的细胞从邻近的 lp 和上皮内隔间的释放也有可能导致 fsc-sc 谱的变化。这种来自其他肠道隔间的细胞污染也可能对 pp 淋巴细胞的流动分析造成干扰。在此基础上, 为了最大限度地提高细胞纯度, 我们还避免添加 edta 或 dtt 等试剂, 这些试剂被广泛用于提取上皮细胞和粘液20, 从而使组织制备条件尽可能保持生理和不受操纵。尽管酶消化有这些不利影响, 但也发现了对 pp 淋巴细胞的有益影响, 如改善细胞内染色和细胞活力 (图 7d-f, g)。然而, 进一步的分析显示, 这些影响归因于在37°c 的搅拌过程独立于酶消化, 因为细胞活力和细胞内 ffp3 染色在细胞搅拌时处于相当的有利程度。胶原酶的缺失。在机械上, 搅拌的有益作用可能是由于改善了从 pp 中去除肠道内容和粘液的作用。
总之, 我们已经描述了从 pp 中分离淋巴细胞的简化协议. 分离的细胞可以被染色, 以进行流式细胞测量, 从而对几个细胞亚群进行流式细胞学表征, 也可以对细胞进行分类, 然后用于各种细胞。体外和体内功能检测。
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Disclosures
未申报利益冲突。
Acknowledgments
我们要感谢劳拉·施特劳斯和彼得·萨奇对流式细胞术分析的有益讨论和支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-mouse CD4 antibody | eBioscience, Biolegend* | 17-0041-81 ,10054* | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse CD19 antibody | eBioscience | MA5-16536 | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse PD-1 antibody | eBioscience | 61-9985-82 | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse ICOS antibody | eBioscience | 12-9942-82 | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse GL7 antibody | Biolegend | 144610 | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse CXCR5 antibody | Biolegend*, BD Bioscience | 145512*, 551960 | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse BCL-6 antibody | Biolegend | 358512 | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse Foxp3 antibody | eBioscience | 17-5773-82 | For detailed information see Table 1 |
| Streptavidin-BV421 | BD Bioscience | 563259 | For detailed information see Table 1 |
| FixableViability Dye | eBioscience | L34957 | For detailed information see Table 1 |
| 7AAD | Biolegend | 420404 | For detailed information see Table 1 |
| FcBlock (CD16/32) | BD Bioscience | 553141 | For detailed information see Table 1 |
| Collagenase II | Worthington | LS004176 | |
| Collagenase IV | Worthington | LS004188 | |
| Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set | eBioscience | 00-5523-00 | |
| 6-well,12-well & 96-well plates | Falcon/Corning | 353046,353043/3596 | |
| 50 mL conical tubes | Falcon | 3520 | |
| 40 µm cell strainer | Falcon | 352340 | |
| 10 mL syringe-plunger | Exel INT | 26265 | |
| RPMI | Corning | 15-040-CV | |
| PBS | Corning | 21-040-CM | |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Orbital shaker | VWR | Model 200 | |
| Curved-end scissor | |||
| Fine Serrated Forceps | |||
| Small curved scissor |
References
- van den Berg, T. K., van der Schoot, C. E. Innate immune ‘self’ recognition: a role for CD47-SIRPα interactions in hematopoietic stem cell transplantation. Trends in Immunology. 29 (5), 203-206 (2008).
- Mowat, A. M., Agace, W. W. Regional specialization within the intestinal immune system. Nature Reviews Immunology. 14 (10), 667-685 (2014).
- Reboldi, A., Cyster, J. G. Peyer’s patches: Organizing B-cell responses at the intestinal frontier. Immunological Reviews. 271 (1), 230-245 (2016).
- Heel, K. A., McCauley, R. D., Papadimitriou, J. M., Hall, J. C. Review: Peyer’s patches. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 12 (2), 122-136 (1997).
- Fagarasan, S., Kinoshita, K., Muramatsu, M., Ikuta, K., Honjo, T. In situ class switching and differentiation to IgA-producing cells in the gut lamina propria. Nature. 413 (6856), 639-643 (2001).
- Hopkins, S. A., Niedergang, F., Corthesy-Theulaz, I. E., Kraehenbuhl, J. P. A recombinant Salmonella typhimurium vaccine strain is taken up and survives within murine Peyer’s patch dendritic cells. Cellular Microbiology. 2 (1), 59-68 (2000).
- Shreedhar, V. K., Kelsall, B. L., Neutra, M. R. Cholera toxin induces migration of dendritic cells from the subepithelial dome region to T- and B-cell areas of Peyer's patches. Infection and Immunity. 71 (1), 504-509 (2003).
- Sato, A., Iwasaki, A. Peyer’s patch dendritic cells as regulators of mucosal adaptive immunity. Cellular and Molecular Life Sciences. 62 (12), 1333-1338 (2005).
- Bemark, M., Boysen, P., Lycke, N. Y. Induction of gut IgA production through T cell-dependent and T cell-independent pathways. Annals of the New York Academy of Sciences. 1247 (1), 97-116 (2012).
- Fagarasan, S., Kawamoto, S., Kanagawa, O., Suzuki, K. Adaptive Immune Regulation in the Gut: T Cell-Dependent and T Cell-Independent IgA Synthesis. Annual Review of Immunology. 28, 243-273 (2010).
- Hase, K., et al. Uptake through glycoprotein 2 of FimH + bacteria by M cells initiates mucosal immune response. Nature. 462 (7270), 226-230 (2009).
- Wu, H., et al. An Inhibitory Role for the Transcription Factor Stat3 in Controlling IL-4 and Bcl6 Expression in Follicular Helper T Cells. Journal of Immunology. 195 (5), 2080-2089 (2015).
- Vinuesa, C. G., Tangye, S. G., Moser, B., Mackay, C. R. Follicular B helper T cells in antibody responses and autoimmunity. Nature Reviews Immunology. 5 (11), 853-865 (2005).
- Victora, G. D., Nussenzweig, M. C. Germinal Centers. Annual Review of Immunology. 30, 429-457 (2012).
- Vaeth, M., et al. Store-Operated Ca2+Entry in Follicular T Cells Controls Humoral Immune Responses and Autoimmunity. Immunity. 44 (6), 1350-1364 (2016).
- Meli, A. P., et al. The Integrin LFA-1 Controls T Follicular Helper Cell Generation and Maintenance. Immunity. 45 (4), 831-846 (2016).
- Fu, W., et al. Deficiency in T follicular regulatory cells promotes autoimmunity. Journal of Experimental Medicine. 215 (3), 815-825 (2018).
- Espéli, M., Walker, J. M. T follicular helper cells - Methods and Protocols. , (2015).
- Couter, C. J., Surana, N. K. Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes. Journal of Visual Experiments. (111), e54114 (2016).
- De Jesus, M., Ahlawat, S., Mantis, N. J. Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer’s Patches. Journal of Visual Experiments. (73), e50167 (2013).
- Pastori, C., Lopalco, L. Isolation and in vitro Activation of Mouse Peyer’s Patch Cells from Small Intestine Tissue. Bio-protocol. 4 (21), e1282 (2014).
- Fukuda, S., Hase, K., Ohno, H. Application of a Mouse Ligated Peyer’s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells. Journal of Visual Experiments. (58), 3225 (2011).
- Naito, Y., et al. Germinal Center Marker GL7 Probes Activation-Dependent Repression of N-Glycolylneuraminic Acid, a Sialic Acid Species Involved in the Negative Modulation of B-Cell Activation. Molecular and Cellular Biology. 27 (8), 3008-3022 (2007).
- Bollig, N., et al. Transcription factor {IRF4} determines germinal center formation through follicular T-helper cell differentiation. Proceedings of the National Academy of Science of U. S. A. 109 (22), 8664-8669 (2012).
- Pérez-Mazliah, D., et al. Follicular Helper T Cells are Essential for the Elimination of Plasmodium Infection. EBioMedicine. 24, 216-230 (2017).
- Sage, P. T., Sharpe, A. H. T follicular regulatory cells in the regulation of B cell responses. Trends Immunology. 36 (7), 410-418 (2015).
- Van Damme, N., et al. Chemical agents and enzymes used for the extraction of gut lymphocytes influence flow cytometric detection of T cell surface markers. Journal of Immunological Methods. 236 (1-2), 27-35 (2000).
- Meenan, J., et al. Altered expression of alpha 4 beta 7, a gut homing integrin, by circulating and mucosal T cells in colonic mucosal inflammation. Gut. 40 (2), 241-246 (1997).
- Cao, A. T., et al. Interleukin (IL) -21 promotes intestinal IgA response to microbiota. Mucosal Immunology. 8 (5), 1072-1082 (2015).
- Wei, J., et al. Autophagy enforces functional integrity of regulatory T cells by coupling environmental cues and metabolic homeostasis. Nature Immunology. 17 (3), 277-285 (2016).
- Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function. European Journal of Microbiology & Immunology. 2 (2), 112-120 (2012).
- Trapecar, M., et al. An Optimized and Validated Method for Isolation and Characterization of Lymphocytes from HIV+ Human Gut Biopsies. AIDS Research and Human Retroviruses. 33 (S1), (2017).
- Bergqvist, P., Gardby, E., Stensson, A., Bemark, M., Lycke, N. Y. Gut IgA Class Switch Recombination in the Absence of CD40 Does Not Occur in the Lamina Propria and Is Independent of Germinal Centers. Journal of Immunology. 177 (11), 7772-7783 (2006).
- Keil, B., Gilles, A. M., Lecroisey, A., Hurion, N., Tong, N. T. Specificity of collagenase from Achromobacter iophagus. FEBS Letters. 56 (2), 292-296 (1975).
- Mora, J. R., et al. Selective imprinting of gut-homing T cells by Peyer’s patch dendritic cells. Nature. 424 (6944), 88-93 (2003).
- Reboldi, A., et al. Mucosal immunology: IgA production requires B cell interaction with subepithelial dendritic cells in Peyer’s patches. Science. 352 (6287), (2016).
