Summary
इस अध्ययन में, हम एक उपंयास और Peyer के पैच (पी एस) से लिम्फोसाइटों के अलगाव के लिए प्रभावी प्रोटोकॉल मौजूद है, जो बाद में vivo में और इन विट्रो में के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कार्यात्मक परख के रूप में अच्छी तरह से फुफ्फुसीय टी के प्रवाह cytometric अध्ययन हेल्पर और कीटाणु केंद्र बी कोशिकाओं ।
Abstract
आंत म्यूकोसा में, प्रतिरक्षा कोशिकाओं एक अद्वितीय प्रतिरक्षा इकाई का गठन, जो प्रतिरक्षा सहिष्णुता को बढ़ावा देता है, जबकि समवर्ती रोगजनकों के खिलाफ प्रतिरक्षा रक्षा को प्राथमिकता । यह अच्छी तरह से स्थापित है कि Peyer पैच (पी एस) कई प्रभाव टी और बी सेल सबसेट की मेजबानी से श्लैष्मिक प्रतिरक्षा नेटवर्क में एक अनिवार्य भूमिका है । इन प्रभाव कोशिकाओं के एक निश्चित अंश, फुफ्फुसीय टी सहायक (TFH) और कीटाणु केंद्र (जीसी) बी कोशिकाओं विनोदी प्रतिरक्षा के विनियमन में व्यावसायिक हैं । इसलिए, उनके भेदभाव कार्यक्रम और कार्यात्मक गुण के संदर्भ में पी एस के भीतर इन सेल सबसेट के लक्षण वर्णन श्लैष्मिक उन्मुक्ति के बारे में महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान कर सकते हैं । यह अंत करने के लिए, एक आसानी से लागू, कुशल और पीपीएस से लिम्फोसाइट अलगाव के reproducible विधि शोधकर्ताओं के लिए मूल्यवान होगा । इस अध्ययन में, हम उच्च कोशिका उपज के साथ माउस पीपीएस से लिम्फोसाइटों को अलग करने के लिए एक प्रभावी तरीका उत्पन्न करने के उद्देश्य से. हमारे दृष्टिकोण से पता चला कि इस तरह के पाचन एजेंट और ऊतक आंदोलन के उपयोग के रूप में प्रारंभिक ऊतक प्रसंस्करण, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से सेल धुंधला शर्तों और एंटीबॉडी पैनलों के चयन, गुणवत्ता और अलग लिम्फोसाइटों की पहचान पर बहुत प्रभाव है और पर प्रयोगात्मक परिणाम ।
यहां, हम एक शोधकर्ताओं को सक्षम करने के लिए कुशलता से लिम्फोसाइट आबादी reproducible प्रवाह cytometry टी और बी सेल उपसेट के मूल्यांकन के आधार पर मुख्य रूप से TFH और जीसी बी सेल सबसेट पर ध्यान केंद्रित की अनुमति पीपीएस से अलग करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन ।
Introduction
शुरू से अंत तक पूरे जठरांत्र संबंधी मार्ग एक व्यापक लसीकावत् नेटवर्क है कि प्रतिरक्षा कोशिकाओं को मानव और माउस1में किसी भी अंय अंग से अधिक शामिल है के साथ अलंकार है । है Peyer पैच (पी एस) इस सेलुलर प्रतिरक्षा संगठन की आंतों शाखा का एक प्रमुख घटक का गठन, तथाकथित आंत से जुड़े लसीकावत् ऊतक (GALT)2,3। पीपीएस के भीतर, आहार सामग्री से व्युत्पंन एंटीजन के लाखों लोगों के हजारों, खाना खानेवाला microbiota और रोगजनकों लगातार नमूना लिया जा रहा है, और जब उन की ओर आवश्यक उचित प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं इस प्रकार आंतों प्रतिरक्षा को बनाए रखने बढ़ रहे हैं Homeostasis. इस मायने में, पीपीएस "छोटी आंत के tonsils" के रूप में नामित किया जा सकता है. पीपीएस प्रमुख उप डिब्बों से मिलकर बनता है: subepithelial डोम (SED), बड़े बी सेल कूप क्षेत्रों; फाए (आईएफआर), जहां टी कोशिकाओं4स्थित है झूठ कूप से जुड़े उपकला (और) । पीपीएस की इस अनूठी compartmentalization विभिन्न प्रभाव सेल सबसेट का सहयोग करने के लिए सक्षम बनाता है, इस प्रकार, पेट में immunocompetence प्रदान.
पीपीएस की कमी afferent लसीका, और इस कारण के कारण, छोटी आंत से पीपीएस के लिए ले जाया एंटीजन अंय लसीकावत् अंगों के अधिकांश के विपरीत लसीका वाहिकाओं के माध्यम से आयोजित नहीं किया जा रहा है । इसके बजाय, फाए में स्थित विशेष उपकला कोशिकाओं, तथाकथित एम कोशिकाओं, पी एस5में चमकदार एंटीजन के हस्तांतरण के लिए जिम्मेदार हैं. बाद में, वृक्ष कक्षों (dc) और फाए6,7के नीचे subepithelial डोम (SED) क्षेत्र में स्थित हैं जो फ़ैगोसाइट के द्वारा पहुँचाया प्रतिजनों उठाया जाता है । पीपी में dc द्वारा इस प्रतिजन छंटाई प्रक्रिया अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया8 और IgA स्रावित कोशिकाओं9के बाद की पीढ़ी को शुरू करने के लिए महत्वपूर्ण है ।
खाना खानेवाला वनस्पति और आहार सामग्री से भारी प्रतिजनी बोझ के कारण, पीपीएस मेजबान endogenously इस तरह के TFH और IgA+ GC बी कोशिकाओं10के रूप में महान बहुतायत में प्रभाव टी और बी सेल सबसेट सक्रिय, सुझाव है कि पीपीएस सक्रिय प्रतिरक्षा की एक साइट का प्रतिनिधित्व प्रतिक्रिया११. कुल CD4+ टी सेल डिब्बे के भीतर अप करने के लिए 20-25% TFH कोशिकाओं का पता लगाने और अप करने के लिए 10-15% कुल बी कोशिकाओं के भीतर जीसी बी कोशिकाओं unimmunized युवा C57BL से एकत्र पी एस में संभव है/6 चूहों12. अंय टी सहायक सेल प्रकार (यानी, Th1, Th2, Th17 कोशिकाओं) के विपरीत, TFH कोशिकाओं को बी कोशिका रोम में मुख्य रूप से tropism अभिव्यक्ति है, जो CXCR5 ढाल13TFH के साथ सेल होमिंग को बढ़ावा देता है के कारण अद्वितीय CXCL13 दिखाते हैं । बी पी एस की कोशिका कूप क्षेत्र में, TFH कोशिकाओं IgA वर्ग स्विच पुनर्संयोजन और शारीरिक hypermutation सक्रिय बी कोशिकाओं में से जो उच्च संबंध IgA कोशिकाओं का उत्पादन14अंतर पैदा करते हैं । बाद में, इन एंटीबॉडी-स्रावित प्लाज्मा कोशिकाओं लेमिना propria (एल. पी.) के लिए विस्थापित और आंत में प्रतिरक्षा homeostasis को विनियमित10.
पहचान और पीपीएस के भीतर TFH और जीसी बी सेल आबादी के लक्षण वर्णन शोधकर्ताओं समय लेने वाली प्रतिरक्षण मॉडल की आवश्यकता के बिना स्थिर राज्य की स्थितियों के तहत विनोदी प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं की गतिशीलता की जांच करने के लिए सक्षम हो सकता है परंपरागत रूप से TFH में इस्तेमाल किया-जीसी बी सेल अध्ययन15,16,17,18। पीपीएस के भीतर TFH कोशिकाओं का विश्लेषण अन्य सेल उपसमुच्चय के रूप में के रूप में सरल नहीं है. तकनीकी चुनौतियों आदर्श ऊतक तैयारी की स्थिति, सतह एंटीबॉडी-मार्कर संयोजन, साथ ही उचित सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण का चयन की पहचान शामिल है । दोनों TFH और पीपी अनुसंधान क्षेत्र प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं के संदर्भ में महान परिवर्तनशीलता प्रदर्शन और कई कारणों की वजह से मानकीकृत प्रोटोकॉल की स्थापना के लिए एक आम सहमति से दूर हैं । सबसे पहले, पीपीएस के भीतर प्रत्येक सेल सबसेट एक सेल सबसेट विशिष्ट तरीके से आगे संशोधनों की आवश्यकता ऊतक तैयारी शर्तों द्वारा विभेदक रूप से प्रभावित हो जाता है । दूसरा, वहां पीपीएस से सेल की तैयारी के विवरण के बारे में रिपोर्ट तरीकों के बीच एक महत्वपूर्ण विसंगति है । तीसरा, प्रोटोकॉल की संख्या आधारित तुलनात्मक अध्ययन आदर्श ऊतक तैयारी तकनीकों और प्रयोगात्मक शर्तों की जांच पीपी और TFH अनुसंधान के लिए नहीं बल्कि सीमित है ।
वर्तमान प्रोटोकॉल आधारित अध्ययन पीपी सेल की तैयारी के लिए सुझाव दिया19,20,21,22 TFH-या जीसी बी सेल उंमुख नहीं थे । इसके अलावा, कुछ ऊतक तैयारी की स्थिति19पीपीएस के लिए सिफारिश की,20 collagenase आधारित पाचन के रूप में इस तरह के प्रवाह cytometry नकारात्मक18द्वारा TFH पहचान के परिणाम को प्रभावित पाया गया । इस आधार पर, हम एक अनुकूलित, मानकीकृत और reproducible प्रोटोकॉल है कि पीपीएस के भीतर TFH और जीसी बी सेल गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि इस विषय पर काम कर जांचकर्ताओं के लिए मूल्यवान होगा कारण है । यह जरूरत है हमें प्रोत्साहन के लिए एक बेहतर और अप करने के लिए तारीख प्रोटोकॉल उत्पंन करने के लिए दिया अलगाव और पीपी लिम्फोसाइटों कि पतले सेलुलर वसूली, व्यवहार्यता के लिए अनुकूलित है के लक्षण वर्णन, और कई टी और बी के प्रवाह cytometric लक्षण वर्णन के लिए दक्षता कक्ष सबसेट । हम भी पिछले प्रोटोकॉल में सुझाए गए कई श्रमसाध्य तैयारी चरणों को बाहर करने का उद्देश्य है, जिससे, पीपीएस से ऊतक और सेल तैयारी के लिए आवश्यक जोड़तोड़ और समय को कम करने.
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Protocol
इस प्रोटोकॉल में वर्णित सभी अध्ययनों और प्रयोगों का आयोजन संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) के अनुसार Beth इज़राइल Deaconess चिकित्सा केंद्र के दिशानिर्देशों के तहत किया गया था ।
1. डिजाइन प्रयोगात्मक सेट अप और माउस समूहों
- वैकल्पिक सहकारी प्रयोगात्मक चूहों प्रयोगात्मक चूहों के बीच आंत microbiota के क्षैतिज संचरण की सुविधा के लिए और पीपी लिम्फोसाइटों के भीतर गैर विशिष्ट परिवर्तनशीलता को कम करने के लिए घर. साथ ही, परिवर्तनशीलता को कम करने के लिए एक ही लिंग के littermate नियंत्रण का उपयोग करें ।
2. सर्जिकल उत्पाद और ऊतक तैयारी कदम:
- छोटी आंत के सर्जिकल हटाने (एसआई)
- Euthanize चूहों सहकारी2 asphyxiation या किसी भी समकक्ष संस्थागत पशु नैतिकता समिति द्वारा अनुमोदित विधि का उपयोग कर ।
- शल्य चिकित्सा उत्पाद के लिए एक समर्पित क्षेत्र के लिए माउस स्थानांतरण । जगह पीठ नीचे और ७०% इथेनॉल के साथ पेट साफ । इस प्रकार पेरिटोनियल गुहा खोलने रिब पिंजरे के लिए जघनरोम से midline साथ उदर त्वचा और योनि काटने के द्वारा एक laparotomy प्रदर्शन करते हैं ।
नोट: पेरिटोनियल गुहा और हानिकारक आंत्र ऊतक मर्मज्ञ से बचने के लिए त्वचा के एक अपेक्षाकृत छोटे क्षेत्र पर पहला चीरा प्रदर्शन । वांछित संरचनात्मक सीमा तक आबकारी जारी रखें । - caecum की पहचान करें, जो टर्मिनल लघ्वान्त्र का पता लगाने के लिए एक आदर्श मील का पत्थर है, जो छोटी आंत के बाहर के क्षेत्र का गठन करती है ।
नोट: Caecum आमतौर पर माउस पेट के निचले बाईं ओर स्थित है । - ileocaecal जंक्शन तुच्छ और caecum से छोटी आंत को अलग करने के लिए संभव के रूप में बाहर के रूप में इस स्तर पर एक कटौती करते हैं । अगले चरणों के दौरान, आंतों की दीवार के साथ अत्यधिक शारीरिक संपर्क से बचें क्योंकि नाजुक पी एम सी को छूने पर आसानी से पतन ।
- धीरे से पूरी छोटी आंत निकालें जब तक जठरनिर्गम लुगदी कैंची का उपयोग कर अन्त्रपेशी काटने से । जठरनिर्गम और ग्रहणी के बीच जंक्शन की पहचान है, और इस स्तर पर संग्रहणी गोली चलाना, जो उदर गुहा से छोटी आंत की टुकड़ी को पूरा करने के लिए नेतृत्व करेंगे ।
नोट: (i) hyperextension से बचने के रूप में इस आंत्र दीवार का टूटना कारण हो सकता है। (ii) यदि LP लिम्फोसाइट आइसोलेशन पीपी लिम्फोसाइटों के अतिरिक्त वांछित है, तो mesenteric वसा का पूर्ण निष्कासन आवश्यक है । हालांकि, केवल पीपी अलगाव के लिए, शेष mesenteric वसा आगे अलगाव चरणों के दौरान कुछ लाभ प्रदान कर सकता है; इसलिए इसका संरक्षण किया जाना चाहिए । - एक 6-अच्छी तरह से ठंडा RPMI + 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) से भरा थाली में छोटी आंत अलग जगह और धीरे ऊतकों को मैंयुअल रूप से आंदोलन जब तक सभी आंत्र क्षेत्रों ठंड मीडिया में जलमग्न हो रहे हैं । अगले चरणों में बर्फ पर ऊतकों को बनाए रखें ।
- माउस छोटी आंत की वांछित संख्या विदारक के बाद, एकत्र छोटी आंत से पीपी उत्पाद के लिए आगे बढ़ें ।
- पीपीएस के सर्जिकल एक्साइज और सिंगल सेल सस्पेंशन की तैयारी:
- धीरे से एक कागज तौलिया पर छोटी आंत mesenteric वसा मनोरंजक संदंश का उपयोग कर और जगह mesenteric कागज तौलिया का सामना करना पड़ ओर स्थानांतरण । ठंडा RPMI के साथ पूरे आंत्र खंड गीला + 10% FBS ऊतक निर्जलीकरण और चिपचिपाहट से बचने के लिए ।
नोट: शेष mesenteric वसा इस स्तर पर सहायक हो सकता है क्योंकि मोटी ऊतक खंड एसआई के mesenteric साइट पर विरोधी mesenteric साइट का सामना करना पड़ रहा रखने के कागज तौलिया से चिपके रहेंगे । - पीपीएस की पहचान करें, जो आंतों की दीवार के एंटी-mesenteric तरफ एक "फूलगोभी की तरह" आकार में सफेद बहु-lobulated समुच्चय के रूप में दिखाई देते हैं ।
नोट: जब तक सभी पी एस उत्पाद नहीं है चमकदार सामग्री निस्तब्धता की सिफारिश नहीं है । चमकदार सामग्री खाली पीपीएस के पतन का कारण हो सकता है और पीपीएस और आंतों की दीवार है, जो पीपीएस के दृश्य पहचान के लिए बहुत उपयोगी है के बीच रंग कंट्रास्ट को रोकने जाएगा । - एंटी-mesenteric पक्ष पर पीपीएस की पहचान करने के बाद, अपने बाहर और समीपस्थ सीमा से पीपी निरोधक (वक्र का सामना करना चाहिए) पीपीएस पर सर्जिकल घुमावदार अंत कैंची जगह.
वैकल्पिक: एक उंगलियों का उपयोग कर कैंची के ब्लेड की ओर धीरे पीपी धक्का. यह पैंतरेबाज़ी आसपास के गैर पीपी ऊतक के बेहतर अपवर्जन के लिए नेतृत्व करेंगे । आबकारी के पी एस धीरे, आसपास के आंत्र ऊतक को छोड़कर ।
नोट: (i) इस कदम के लिए अधिक से अधिक पीपी सेल उपज प्राप्त महत्वपूर्ण है, जबकि इस तरह के एल. पी. और आंत्र उपकला, जो भी टी कोशिकाओं में अमीर है के रूप में पड़ोसी आंत्र डिब्बों से सेल संदूषण को कम करने । (ii) एक एसआई से C57BL/6 माउस से एक्साइज, 5-10 पीपीएस (औसत आकार, मल्टी lobulated) एकत्र किया जा सकता है । लक्ष्य से भी छोटे पीपीएस (नहीं मल्टी lobulated), अप करने के लिए 12-13 पी एस के संग्रह माउस (C57BL/6) इस प्रोटोकॉल का उपयोग संभव है । - एक 12-well टिशू कल्चर बर्फ से भरा प्लेट-शीत RPMI + 10% FBS और संदंश या घुमावदार शल्य कैंची का उपयोग कर बर्फ पर बनाए रखा ।
नोट: (i) पी एच एस के उत्पाद के तुरंत बाद, बलगम और पीपी सतह पर आंत्र सामग्री एक कागज तौलिया पर धीरे से ऊतक रगड़ द्वारा साफ किया जा सकता है । यह कदम पीपी लिम्फोसाइटों की व्यवहार्यता को बेहतर बनाने में मदद करेगा । (ii) के बजाय एक थाली के लिए पीपीएस स्थानांतरित करने के लिए, अलग ट्यूबों को स्थानांतरित भी कुल नमूना संख्या के आधार पर विचार किया जा सकता है । - वैकल्पिक: जब पीपी उत्पाद और अच्छी तरह से थाली में बाद में नियुक्ति पूरा कर रहे हैं, संख्या और पीपीएस के आकार के विभिंन प्रयोगात्मक/माउस समूहों से एकत्र की जा सकती है प्रलेखित ऊतक संस्कृति की थाली युक्त पीपीएस की एक तस्वीर ले ।
- ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूबों का एक सेट तैयार RPMI के 25 मिलीलीटर + 10% FBS (पूर्व ३७ डिग्री सेल्सियस पर गर्म) से भरा । कैंची की एक जोड़ी का उपयोग करना, दूरी है कि 1 मिलीलीटर पिपेट के साथ पीपीएस की आकांक्षा की अनुमति देगा से एक १,००० µ एल टिप के किनारे काट । महाप्राण ने पीपीएस को 1 एमएल पिपेट के साथ और 12-well टिशू कल्चर प्लेट से तैयार ५० एमएल शंकु ट्यूबों में ट्रांसफर किया ।
नोट: नमूने के बीच क्रॉस-संदूषण से बचने के लिए प्रत्येक माउस नमूने के लिए एक नई टिप का उपयोग करें । - सुरक्षित ढक्कन और जगह एक कक्षीय शेखर में खड़ी ट्यूबों ३७ डिग्री सेल्सियस पर, सतत आंदोलन के साथ 125 में-10 मिनट के लिए 150 rpm । इस बीच, ५० मिलीलीटर ट्यूबों का नया सेट तैयार करें और प्रत्येक ट्यूब के ऊपर एक ४० µm सेल छलनी रखें, जिसके माध्यम से सिंगल सेल सस्पेंशन तैयार किया जाएगा ।
नोट: (i) आंदोलन कदम शेष आंत्र सामग्री, बलगम और कोशिका मलबे, जो कोशिका व्यवहार्यता और पीपी लिम्फोसाइटों की वसूली में कमी को दूर अगर नहीं हटा दिया जाएगा । (ii) पीपी ऊतक पर किसी भी तरह के पाचक एंजाइम लागू न करें क्योंकि पाचन प्रक्रिया के कारण कोशिका की सतह से CXCR5 अभिव्यक्ति का नाटकीय नुकसान होता है । - आंदोलन के बाद, पीपीएस को ४० µm सेल में नए तैयार किए गए शंकु ५० एमएल ट्यूबों के शीर्ष पर रखा गया है । एक 10 मिलीलीटर सिरिंज गोताख़ोर के गोल पक्ष का उपयोग करना, धीरे एक सेल निलंबन उत्पन्न करने के लिए सेल छलनी के माध्यम से पीपीएस को बाधित. 15-शीत RPMI के 20 मिलीलीटर + 10% FBS के साथ छलनी कुल्ला ।
नोट: (मैं) छानने से पहले, क्षैतिज पीपीएस युक्त ट्यूबों शेक. इस छोटे से शेक सेल उपभेदों में पी एस के हस्तांतरण की सुविधा होगी । (ii) गैर-लसीकावत् प्रतिरक्षा कोशिकाओं के अलगाव के लिए एक ७० µm सेल छलनी का उपयोग (जैसे, monocytes, मैक्रोफेज, dc) की सिफारिश की है. - 350 पर एक सेल निलंबन केंद्रापसारक-400 x g 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर ।
- ध्यान से supernatant त्यागें और 10 x 106 कोशिकाओं/एमएल की एकाग्रता पर कोशिकाओं resuspend । किसी hemocytometer का उपयोग करके कक्षों की गणना करना.
नोट: (i) कक्ष गणना करने से पहले, प्रत्येक माउस पीपी समूह के लिए कुल कक्ष संख्या लगभग निम्न सूत्र का उपयोग अनुमानित हो सकता है: "0.5-1 x 106 कोशिकाओं (पी एस की संख्या) = कुल सेल गिनती". सेल गिनती के लिए trypan नीले रंग के साथ आगे कमजोर पड़ने आवश्यक हो सकता है । मैनुअल गिनती के लिए एक विकल्प के रूप में (ii), स्वचालित सेल काउंटर इस्तेमाल किया जा सकता है । - स्थानांतरण 2-उचित मात्रा में 2.5 x 106 कोशिकाओं (जैसे, २०० µ एल) एक ९६-अच्छी तरह से गोल नीचे प्लेट में ।
नोट: एकल रंग और नकारात्मक नियंत्रण नमूनों के लिए, 0.5-1 x 106 कोशिकाओं पर्याप्त हो सकता है । - 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ३५० x g पर थाली केंद्रापसारक । थाली झाड़ ।
- धुंधला बफर के २०० µ एल में कोशिकाओं को धो लें ।
- धीरे से एक कागज तौलिया पर छोटी आंत mesenteric वसा मनोरंजक संदंश का उपयोग कर और जगह mesenteric कागज तौलिया का सामना करना पड़ ओर स्थानांतरण । ठंडा RPMI के साथ पूरे आंत्र खंड गीला + 10% FBS ऊतक निर्जलीकरण और चिपचिपाहट से बचने के लिए ।
3. सतह एंटीबॉडी धुंधला
- व्यवहार्यता धुंधला:
- अंतिम धोने के बाद, fixable व्यवहार्यता (1:1000) पंजाब में पतला डाई के १०० μL में कोशिकाओं resuspend । बर्फ पर या अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए मशीन ।
नोट: (i) Intracellular Foxp3 या Bcl-6 के रूप में महत्वपूर्ण प्रतिलेखन कारकों का पता लगाने के लिए धुंधला कोशिकाओं के निर्धारण की आवश्यकता है । उस स्थिति में, गैर-fixable व्यवहार्यता रंजक (उदा., 7-AAD, DAPI) का उपयोग नहीं किया जा सकता । (ii) fixable व्यवहार्यता डाई को पतला करने के लिए, प्रोटीन शामिल है कि किसी भी दाग बफर का उपयोग न करें । इस चरण में इस्तेमाल होने वाले मीडिया में प्रोटीन-फ्री होना जरूरी है । (iii) व्यवहार्यता धुंधला का उपयोग करके मृत कोशिकाओं का अपवर्जन महत्वपूर्ण है क्योंकि मृत कोशिकाओं autofluorescence उत्सर्जन और बाध्यकारी सतह एंटीबॉडी द्वारा विशेष रूप से प्रवाह cytometry विश्लेषण में गंभीर तकनीकी कठिनाइयों का कारण बन सकता है, जो गलत करने के लिए नेतृत्व कर सकते है सकारात्मक परिणाम । - दो बार धुंधला बफ़र के साथ कोशिकाओं को धो लें । 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर ३५० x g पर केंद्रापसारक । थाली झाड़ ।
- अंतिम धोने के बाद, fixable व्यवहार्यता (1:1000) पंजाब में पतला डाई के १०० μL में कोशिकाओं resuspend । बर्फ पर या अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए मशीन ।
- एफसी ब्लॉक और सतह परत मैं:
- कमजोर एंटी-CD16/32 एंटीबॉडी (1:200) द्वारा एफसी-ब्लॉक समाधान धुंधला बफ़र में तैयार करें ।
- तैयार एफसी-ब्लॉक समाधान के 20 μL में कोशिकाओं resuspend । बर्फ पर 15 मिनट के लिए मशीन ।
- धोने के बिना, सतह एंटीबॉडी कॉकटेल के ८० μL जोड़ें (एंटीबॉडी सारांश के लिए तालिका 1 देखें) उपयुक्त कमजोर पड़ने पर तैयार । के लिए बर्फ पर कम से कम 30 मिनट की मशीन ।
- अत्यधिक धुंधला बफर जोड़कर दो बार धोएं । 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर ३५० x g पर केंद्रापसारक । थाली झाड़ ।
- भूतल-परत द्वितीय:
- धुंधला बफर में कमजोर fluorochrome-संयुग्मित Streptavidin द्वारा Streptavidin धुंधला समाधान तैयार करें ।
- अंतिम धोने के बाद, पूर्व के १०० μL के साथ कोशिकाओं resuspend-पतला Streptavidin (1:100) समाधान धुंधला । अंधेरे में बर्फ पर कम से 15 मिनट के लिए मशीन ।
- दो बार धुंधला बफर के साथ धो लो । 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर ३५० x g पर केंद्रापसारक । थाली झाड़ ।
वैकल्पिक: यदि intracellular फुफ्फुसीय विनियामक टी सेल का पता लगाने के लिए धुंधला करना वांछित नहीं है, पिछले धोने के बाद, २०० μL में बफर और स्थानांतरण उचित ट्यूबों में प्रवाह cytometer में डेटा प्राप्त करने के लिए कोशिकाओं को पुनर्स्थगित । जब नमूने ठीक नहीं कर रहे हैं, प्रवाह cytometry द्वारा डेटा का अधिग्रहण किया जाना चाहिए 3 – 4 के भीतर सटीक परिणाम प्राप्त करने के लिए एच.
4. कक्ष निर्धारण
- तैयार निर्धारण/permeabilization (फिक्स/Foxp3/प्रतिलेखन फैक्टर धुंधला बफर सेट से रिएजेंट का उपयोग कर समाधान काम कर । permeabilization निर्धारण/permeabilization मंदक के तीन भागों से वांछित अंतिम मात्रा को ध्यान में रखना एक-भाग का मिश्रण ।
- अंतिम धोने के बाद, फिक्स/पर्म काम समाधान के २०० μL में कोशिकाओं को पुनर्निलंबित ।
- बर्फ पर या 20 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर थाली मशीन । इस चरण के लिए 20 मिनट से अधिक न हो । अब मशीन समय गंभीर सेल वसूली में कमी हो सकती है ।
- 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर ३५० x g पर केंद्रापसारक । थाली झाड़ । (वैकल्पिक) इस कदम के बाद, फिक्स्ड कोशिकाओं में 4 ° c पर कई दिनों के लिए संग्रहीत किया जा सकता है धुंधला हो जाना बफर जिसमें गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA) या FBS बाद intracellular धुंधला या प्रवाह cytometry अधिग्रहण जब तक ।
- permeabilization बफर के २०० μL में कोशिकाओं resuspend (x1) हौसले से पहले-शुद्ध में पानी पतला ।
- 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान (आरटी) में ३५० x g पर केंद्रापसारक ।
- permeabilization बफर के २०० μL के साथ एक बार धो और आरटी में 5 मिनट के लिए ३५० x g पर केंद्रापसारक ।
5. Intracellular धुंधलाना
- कमजोर विरोधी CD16/32 एंटीबॉडी (1:200) द्वारा एफसी ब्लॉक समाधान तैयार permeabilization बफर में ।
नोट: निर्धारण चरण के बाद, कोशिकाओं intracellular धुंधला प्रक्रिया के अंत तक permeabilization बफर में बनाए रखा जाना चाहिए । - अंतिम धोने के बाद, एफसी के 20 μL में कोशिकाओं resuspend-समाधान ब्लॉक । 10 के लिए मशीन-अंधेरे में आरटी पर 15 मिनट ।
- धोने के बिना, intracellular एंटीबॉडी कॉकटेल के ८० μL जोड़ें (१०० μL अंतिम मात्रा) पूर्व permeabilization बफर में पतला । आरटी पर 30 मिनट के लिए मशीन ।
- पर्म बफर के १०० μL जोड़ें, और आरटी पर 5 मिनट के लिए ३५० x g पर केंद्रापसारक ।
- permeabilization बफर के २०० μL के साथ एक बार धो, आरटी में 5 मिनट के लिए ३५० x g पर केंद्रापसारक ।
- अंतिम धोने के बाद, बफर धुंधला के २०० μL में कोशिकाओं resuspend और उपयुक्त ट्यूबों में स्थानांतरण कोशिकाओं (धुंधला बफर में ४०० μL के अंतिम मात्रा) और प्रवाह cytometry द्वारा डेटा प्राप्त । ९६ में सना हुआ नमूने प्लेट रीडर विकल्प के साथ एक प्रवाह cytometer उपलब्ध है, तो अच्छी तरह से थाली भी ट्यूबों में स्थानांतरित किए बिना चलाया जा सकता है. यह चरण कक्ष स्थानांतरण के दौरान कक्ष हानि को छोटा करता है ।
- प्रवाह cytometer पर 5 x 105 कुल कोशिकाओं की एक ंयूनतम प्राप्त करने के लिए TFH, टीएफआर के रूप में के रूप में अच्छी तरह से जीसी बी कोशिकाओं के reproducible विश्लेषण प्रदर्शन कर सकता है ।
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Representative Results
एक पिछले प्रोटोकॉल20के विपरीत, हमने देखा है कि पीपीएस एसआई भर में समान रूप से वितरित नहीं कर रहे हैं, लेकिन चित्र 1aमें दिखाए गए के रूप में एसआई के बाहर और समीपस्थ सिरों की ओर अधिक घनी स्थानीयकृत रहे हैं। प्रवाह cytometric विश्लेषण से पता चला है कि, अगर सही ढंग से पीछा किया, हमारे प्रोटोकॉल एक पीपी लिम्फोसाइट जनसंख्या है कि आगे की ओर तितर बितर वितरण प्रदर्शित करता है splenocytes के समान (चित्रा 2a, ई, और 2d, एच) के साथ > 95% सेल देता है व्यवहार्यता (चित्रा बी और 2F) । अन्य माध्यमिक लसीकावत् अंगों (SLOs) के विपरीत, C57BL/6 चूहों में लगभग 70 – कुल पीपी लिम्फोसाइटों के 80% बी कोशिकाओं से मिलकर बनता है, जबकि CD4+ टी कोशिकाओं का गठन केवल 10 – कुल पीपी लिम्फोसाइटों का 15% (चित्रा 2c और 2 जी).
कृपया ध्यान दें कि CD4+ CD19+ डबल पॉजिटिव (डीपी) कोशिकाएं कुल पीपी लिम्फोसाइटों के ≈ 1% का गठन करती हैं । इस तरह के प्रदर्शन के रूप में सेल की तैयारी के दौरान कुछ सावधानियों के साथ एफसी-बी कोशिकाओं के एफसी रिसेप्टर्स के खिलाफ ब्लॉक और दोहरी को छोड़कर, CD4+ CD19+ डीपी सेल जनसंख्या कम किया जा सकता है (3 ए और बीआंकड़ा ) । हालांकि, डीपीएस के एक अंश है कि आगे तितर बितर (FSC) दोहरी के लक्षण प्रदर्शित नहीं करता अपरिहार्य है और एक सकारात्मक टी और बी सेल गेट्स (चित्र बी) से बाहर gated होना चाहिए । हमारे परिणाम से पता चला है कि डी पी कोशिकाओं के भीतर कोशिकाओं को अत्यधिक उनकी सतह (चित्रा 3सी) है कि TFH गेट जो CD4+ टी कोशिकाओं में CXCR5 अभिव्यक्ति के आधार पर समायोजित किया जाता है में झूठी सकारात्मक परिणाम के लिए ले सकता है पर CXCR5 व्यक्त करते हैं । दूसरी ओर, हमने पाया है कि GL7, सक्रिय बी कोशिकाओं के एक मार्कर, भी CD4+ CD19+ डी पी कोशिकाओं (चित्रा 3 डी), जो GC बी सेल गेटिंग के साथ हस्तक्षेप का कारण हो सकता है में व्यक्त की है ।
TFH और GC B कक्ष गेटिंग एल्गोरिदम के उदाहरण चित्रा 4में चित्रित कर रहे हैं. gc b सेल गेटिंग के लिए, हम GL7 लेबलिंग बनाम CD38 का उपयोग करते हैं, जो GL7+ CD38- बी कोशिकाओं (फिगर 4a-b) के रूप में जीसी बी कोशिकाओं को पहचानता है । ॄणा लेबलिंग के बजाय GL723 का उपयोग किया जा सकता है जबकि CD38 निंन मार्करों में से किसी एक के द्वारा प्रतिस्थापित किया जा सकता है: IgD, Bcl-6, और CD95 । GC B कोशिकाओं के लिए वैकल्पिक गेटिंग रणनीतियों चित्र एस में प्रदर्शन कर रहे हैं । पी एम सी में बी सेल अनुपात C57BL/6 चूहों में महान परिवर्तनशीलता से पता चलता है । हालांकि, अंय SLOs की तुलना में, पी एस एफ स्थिर राज्य स्थितियों के तहत कुल बी कोशिकाओं के 2-10% की एक सीमा के साथ काफी उच्च जीसी बी सेल अनुपात है । पीपी TFH कोशिकाओं के लिए गेटिंग रणनीति CD19- CD4+ पीडी-1हाय CXCR5+ टी कोशिकाओं (चित्रा 4a, सी) के रूप में वर्णित है । "ज़ेबरा प्लॉट" TFH गेटिंग के लिए एक इष्टतम प्रदर्शन पद्धति के रूप में यह पीडी-1उच्च जनसंख्या और अधिक कड़ाई से अंय साजिश प्रकार (चित्र 4c) की तुलना में चित्रित किया गया था पाया गया । टीएफआर, Foxp3 व्यक्त TFH कोशिकाओं का एक सबसेट, CD19- CD4+ पीडी-1हाय CXCR5+ Foxp3+ टी कोशिकाओं (चित्रा 4d) के रूप में gated कर रहे हैं. GC B कोशिकाओं की तरह, TFH कोशिका अंश भी unimmunized माउस व्यक्तियों में 10 की एक सीमा के साथ बदलता है – कुल CD19 के 20%- CD4+ पीपी लिम्फोसाइटों. TFH कोशिकाओं के लिए वैकल्पिक गेटिंग एल्गोरिदम का विवरण चित्रा 4E, एफ और चित्रा S1C, डी में वर्णित हैं.
झूठी सकारात्मकता पृष्ठभूमि धुंधला और autofluorescence, isotype नियंत्रण या ऐसे प्रतिदीप्ति ऋण एक (FMO) के रूप में वैकल्पिक समकक्ष नियंत्रण के कारण से बचने के लिए TFH और जीसी बी सेल मार्करों के लिए एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में धुंधला पैनल में शामिल किया जाना चाहिए ( चित्रा 4g-J).
पीपी ऊतक तैयार करने के लिए शर्तों का अनुकूलन करने के लिए, हम एक उपंयास आंतरिक रूप से नियंत्रित प्रयोगात्मक रणनीति है, जिसमें पीपीएस एक व्यक्ति माउस से एकत्र किए गए थे और अलग से उनके संरचनात्मक मूल (जैसे, ग्रहणी के आधार पर परित विकसित, श्रोणि) । प्रयोगों के प्रदर्शन के लिए, परित पीपीएस को व्यक्तिगत समूहों को सौंपा गया ताकि प्रत्येक प्रायोगिक और नियंत्रण समूह में प्रत्येक संरचनात्मक क्षेत्र (आंकड़ा 5) से पीपीएस की बराबर संख्या शामिल रहे । इस दृष्टिकोण से, हमने पाया है कि collagenase आधारित एंजाइमी पाचन (collagenase द्वितीय या पाचन के 25 मिलीलीटर = १.५ मिलीग्राम/एमएल), जो आमतौर पर विभिंन श्लैष्मिक ऊतकों से लिम्फोसाइट अलगाव के लिए प्रयोग किया जाता है के प्रति ३७.५ मिलीग्राम में परीक्षण, काफी कम CXCR5 पीपी लिम्फोसाइटों (चित्रा 5B) में अभिव्यक्ति, विशेष रूप से TFH कोशिकाओं (चित्रा 5F-I) में, जबकि अन्य सतह के अणुओं की अभिव्यक्ति (जैसे, CD19, CD4) बरकरार रहे (चित्रा 5C-ई). CXCR5 का पता लगाने में कमी प्रमुख थी ताकि collagenase पर CXCR5 की अभिव्यक्ति TFH कोशिकाओं को isotype कंट्रोल (फिगर 5F-I) से लगभग अलग किया जा सके. इसके अलावा प्रयोगों से पता चला कि CXCR5 अभिव्यक्ति के साथ एंजाइमी पाचन का हस्तक्षेप स्तर CXCR5 एंटीबॉडी क्लोन इस्तेमाल किया (चित्रा 6A-एफ) पर निर्भर था. विशेष रूप से, collagenase द्वितीय उपचार पर, CXCR5 एंटीबॉडी क्लोन 2G8 का पता लगाने की क्षमता और अधिक काफी ख़राब था, CXCR5 एंटीबॉडी क्लोन L138D7 (चित्रा 6A-डी) की खोज क्षमता से ।
एंजाइमी पाचन न केवल CXCR5 की अभिव्यक्ति पर भी FSC-एसएससी विशेषताओं द्वारा निर्धारित के रूप में पीपी कोशिकाओं के भीतर कुल लिम्फोसाइटों के अनुपात में कमी आई है, जबकि पच पीपीएस से अलग कोशिकाओं का एक काफी अंश आगे और पक्ष प्रदर्शित पीपी लिम्फोसाइटों (फिगर 7A-सी) की तुलना में अधिक तीव्रता का बिखराव । सेल वसूली पर collagenase के प्रभाव एक खुराक पर निर्भर तरीके से हुई (चित्रा 7A, एच-जे). एंजाइमी पाचन सेल व्यवहार्यता वृद्धि हुई (आंकड़ा 7d, ई)। हालांकि, यह लाभ collagenase पाचन से जुड़ा causatively नहीं था क्योंकि collagenase बिना आंदोलन के बाद पीपीएस से अलग कोशिकाओं को इसी तरह इष्ट (चित्रा 7F) थे । परमाणु प्रतिलेखन कारक Foxp3, जो विशेष रुचि के यहां है, क्योंकि यह आमतौर पर TFH अलगाव के दौरान टीएफआर कोशिकाओं की पहचान करने के लिए मूल्यांकन किया जाता है का पता लगाने, ३७ डिग्री सेल्सियस पर आंदोलन द्वारा सुधार हुआ था collagenase पाचन की परवाह किए बिना (चित्रा 7G ).
चित्रा 1: Macroscopic संरचना और murine Peyer के पैच के संरचनात्मक वितरण । (क). एक ग्रहणी से प्राप्त एक छवि पेट के साथ छोटी आंत के अंत में । ग्रहणी में दो निकट स्थित पीपीएस काले तीर के साथ संकेत दिया जाता है । (ख). पीपीएस ग्यारह C57BL/6 चूहों से एकत्र एक 12 अच्छी तरह से प्लेट में व्यक्तिगत रूप से संग्रहीत किया गया । (ग). हौसले से उत्पादेड माउस पीपीएस की छवि एक ४० µm सेल छलनी पर प्रदर्शित । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 2: पीपी लिम्फोसाइटों के लिए प्रवाह cytometric लक्षण वर्णन और बुनियादी गेटिंग एल्गोरिथ्म । (क). डॉट भूखंडों FSC और एसएससी कुल्हाड़ियों जो splenocytes में चित्रित (डी) के लिए महान समानता का प्रदर्शन के साथ हौसले से पृथक अनस्थिर पीपी लिम्फोसाइटों के वितरण का प्रदर्शन । (ख). 7AAD अभिव्यक्ति के माध्यम से मृत कोशिकाओं का बहिष्करण. 7AAD- कक्ष लाइव कक्षों का प्रतिनिधित्व करते हैं । (ग). CD19 और CD4-आधारित immunophenotyping टी और बी कोशिकाओं के बीच प्री-gated लाइव पीपी कोशिकाओं. (ई जी) । फिक्स्ड पीपी लिम्फोसाइटों के प्रतिनिधि प्रवाह विश्लेषण । (ज). निश्चित splenocytes के प्रतिनिधि प्रवाह विशेषताओं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 3: CD4+ CD19+ डबल पॉजिटिव (डीपी) कोशिकाओं TFH और जीसी बी सेल गेटिंग में झूठी धनात्मकता का कारण है । (क). CD4+CD19+ डीपी लिम्फोसाइटों भीतर रहते पीपी कोशिकाओं का प्रदर्शन कर रहे हैं । (ख) दोहरी और singlets के रूप में FSC विशेषताओं पर आधारित डीपी कोशिकाओं का पृथक्करण. (C,D). CXCR5 और डीपी कोशिकाओं के GL7 अभिव्यक्ति हिस्टोग्राम भूखंडों में चित्रित कर रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 4: प्रतिनिधि TFH और जीसी बी सेल गेटिंग रणनीति । पीपीएस एक 3 महीने पुराने माउस से एकत्र किए गए थे और लिम्फोसाइटों प्रोटोकॉल अनुभाग में वर्णित के रूप में अलग-थलग थे । (क) CD19 और CD4 लेबलिंग के रहते पीपी लिम्फोसाइटों को दर्शाया गया है. (b) CD38lo GL7hiCD19+ b कोशिकाओं को GC b कोशिकाओं के रूप में gated गया. (ग) TFH कोशिकाओं को CXCR5+पीडी-१हाय CD4+ कोशिकाओं के रूप में gated गया. (घ) टीएफआर कोशिकाएँ TFH मार्करों के साथ मिलकर विनियामक कोशिका-विशिष्ट प्रतिलेखन कारक Foxp3 व्यक्त करने वाली TFH कोशिकाओं का अंश हैं और gated+ पीडी-१हाय CXCR5+ Foxp3 + टी कोशिकाओं के रूप में CD4 हैं. (E-F) TFH सतह मार्करों के लिए गेटिंग रणनीति BCL-6 अभिव्यक्ति के माध्यम से एनपी-ओवा-प्रतिरक्षित माउस से अलग splenocytes में पुष्टि की । (G-J) कुंजी TFH-टीएफआर और GC सेल मार्कर के लिए प्रतिदीप्ति ऋण एक (FMO) नियंत्रण चित्रित कर रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 5: Collagenase-आधारित एंजाइमी पाचन CXCR5 का पता लगाने के लिए एक बड़े पैमाने पर कमी की ओर जाता है । (क) एक 2 महीने पुराने ग्रहणी में स्थित माउस से पीपीएस (≈ 1/3 समीपस्थ), jejunum (≈ 1/3 मध्य) और लघ्वान्त्र (≈ 1/3 बाहर) एकत्र किए गए थे और अलग से परित । परित पीपीएस समान रूप से प्रायोगिक समूहों को वितरित किए गए । collagenase द्वितीय या चतुर्थ के साथ एंजाइमी पाचन पर १.५ मिलीग्राम/एमएल एकाग्रता 10 मिनट के लिए आंदोलन के साथ ३७ डिग्री सेल्सियस पर किया गया था । (बी-ई) हिस्टोग्राम भूखंडों (CXCR5, CD19, पीडी-1, CD4) की सतह अणुओं की अभिव्यक्ति का चित्रण है कि पीपीएस से पृथक collagenase-आधारित पाचन के अधीन थे कोशिकाओं की । (एफ-आई) collagenase प्रशासित और नियंत्रण समूहों के भीतर TFH गेटिंग ज़ेबरा भूखंडों में प्रदर्शन किया है. डेटा तीन स्वतंत्र प्रयोगों का प्रतिनिधित्व करते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 6: CXCR5 अभिव्यक्ति पर collagenase के प्रभाव विरोधी CXCR5 एंटीबॉडी क्लोन पर निर्भर करता है महान अंतर दिखाई दिया । पीपी लिम्फोसाइटों एक 6 महीने पुराने माउस से एकत्र, परित और एंटीबॉडी क्लोन इस्तेमाल किया और एंजाइमी पाचन आवेदन के बारे में विभिंन समूहों में अलग । (क-च) TFH कोशिकाओं का अनुपात पूर्व gated लाइव, CD19- CD4+ टी कोशिकाओं के भीतर ज़ेबरा भूखंडों में दर्शाया गया है. (ए, सी और ई) पीपी कोशिकाओं के साथ दाग थे बायोटिन-संयुग्मित एंटी-माउस CXCR5 एंटीबॉडी (2G8 क्लोन), और Streptavidin संयुग्मित के साथ BV421 fluorochrome । (बी, डी और एफ) पीपी कोशिकाओं एक प्राथमिक संयुग्मित विरोधी माउस CXCR5 एंटीबॉडी (L138D7 क्लोन) के साथ दाग थे । (A-B) TFH गेटिंग भूखंडों से अजीर्ण पीपी लिम्फोसाइटों. (सी डी) collagenase द्वितीय के साथ पच पीपीएस (20 मिलीग्राम/पाचन मिश्रण के 25 मिलीलीटर) और ३७ डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए उत्तेजित । डेटा दो स्वतंत्र प्रयोगों का प्रतिनिधित्व करते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 7: Collagenase आधारित पाचन और ३७ डिग्री सेल्सियस प्रभाव सेल व्यवहार्यता, वसूली और intracellular धुंधला क्षमता पर आंदोलन । एक 3 महीने की उंर के C57BL/ पीपीएस एकत्र और चित्र 5में वर्णित के रूप में परित थे । (ए) पी एस के संग्रह के बाद, ऊतकों collagenase द्वितीय की उपस्थिति में आंदोलन किया गया (३७.५ mg/पाचन मिश्रण की 25 मिलीलीटर) 10 मिनट के लिए, FSC और एसएससी फिक्स्ड पीपी कोशिकाओं की विशेषताओं में चित्रित कर रहे हैं (क) और व्यवहार्यता साजिश धुंधला में दिखाया गया है ( घ). (ख, ङ) पी एस के संग्रह के बाद, ऊतकों को आंदोलन या एंजाइमी पाचन के बिना बर्फ पर रखा गया था; FSC और एसएससी फिक्स्ड पीपीएस कोशिकाओं के लक्षण (ख) में चित्रित कर रहे है और व्यवहार्यता धुंधला (ई) में चित्रित किया है । (सी, एफ) पीपीएस के संग्रह के बाद, ऊतकों collagenase के अभाव में 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 125-150 rpm पर उत्तेजित हो गए थे; FSC और एसएससी विशेषताओं और व्यवहार्यता फिक्स्ड पीपी कोशिकाओं की धुंधला (सी, एफ), क्रमशः चित्रित कर रहे हैं । (छ) collagenase प्रशासन के बिना उत्तेजित और उत्तेजित पीपीएस से पृथक विनियामक टी कोशिकाओं में Foxp3 अभिव्यक्ति की तुलना हिस्टोग्राम भूखंड में दर्शाई गई है. (H-J) पीपीएस एक 6 महीने पुराने C57BL/6 माउस से एकत्र की और collagenase द्वितीय के विभिंन सांद्रता के साथ इलाज किया गया: 25 मिलीलीटर पाचन मिश्रण, प्रति 15 मिलीग्राम 25 मिलीलीटर पाचन मिश्रण या कोई collagenase । FSC और एसएससी भूखंड जो पीपी सेल वसूली और उपज पर एंजाइमी पाचन के प्रभाव का पता चलता है चित्रित कर रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 8: आणविक मॉडल और CXCR5 के पूर्ण एमिनो एसिड अनुक्रम । (क) CXCR5 की सात-पास transmembrane प्रोटीन संरचना मॉडलिंग की है. (ख) CXCR5 के पूर्ण अमीनो अम्ल अनुक्रम का प्रदर्शन किया जाता है. extracellular क्षेत्रों के अनुक्रम लाल और extracellular अमीनो में संकेत दिया जाता है-संभवतः collagenase संवेदनशील रासायनिक बांड के साथ एसिड पीले रंग में प्रदर्शन कर रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
| Antigen | क्लोन | Fluourochrome | पतलापन |
| CD4 | gk 1.5, RM4-5 | APC, PECy7, percpcy 5.5, FITC | 1:100 |
| CD19 | 6D5 | FITC, APC Cy7/ | 1:100 |
| पीडी-1 | J43 | PE ef ६१० (टेक्सास लाल) | 1:100 |
| ICOS | 15 F9, 7E. 17G9 | पीई | 1:100 |
| GL7 | GL7 | PerCp/cy 5.5 | 1:75 |
| CXCR5 | 2G8,L138D7 * | बायोटिन | 1:50 |
| BCL-6 | 7D1 | पीई Cy7/ | 1:50 |
| FOXP3 | FJK-16 | APC, पीई | 1:100 |
| Streptavidin | - | BV421, पे | 1:100 |
| FixableViability डाई | - | वी. बी. 510 (एक्वा) | 1:1000 |
| 7AAD | - | PerCp/cy 5.5 | 1:500 |
| FcBlock (CD16 32/ | 2.4 g2 | - | 1:200 |
तालिका 1: एंटीबॉडी सारांश । प्रासंगिक एंटीबॉडी और व्यवहार्यता रंजक के लिए कमजोर पड़ने, क्लोन और fluorochrome conjugations संकेत कर रहे हैं । इष्टतम कमजोर पड़ने प्रयोगात्मक शर्तों और उत्पाद की बहुत गुणवत्ता के आधार पर भिंन हो सकते हैं । प्राथमिक BV421-1:20 कमजोर पड़ने पर संयुग्मित L138D7 क्लोन 1:50 कमजोर पड़ने पर बायोटिन-संयुग्मित 2G8 क्लोन के साथ तुलनीय CXCR5 पता लगाने की क्षमता दिखाई । इसलिए, प्राथमिक-संयुग्मित L138D7 को बायोटिन-संयुग्मित 2G8 क्लोन के विकल्प के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है ।
चित्र अनुपूरक 1 (s): वैकल्पिक गेटिंग रणनीतियां TFH और GC B कोशिकाओं के लिए । (क) C57BL/6 पृष्ठभूमि पर एक 3 महीने के पुराने माउस से लाइव पीपी लिम्फोसाइटों चित्रित कर रहे हैं । (बी-सी) जीसी बी कोशिकाओं को CD38- GL7+ (b) और BCL-6+ GL7+ बी कोशिकाओं (C) के रूप में gated हैं । (डी ई) TFH कोशिकाओं को पीडी-1hi CXCR5+ (D) के रूप में दर्शाया गया है और ICOS+CXCR5+ CD4 + टी कोशिकाओं (E) के रूप में । कृपया यहां क्लिक करें इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए ।
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Discussion
यहां, हम एक TFH और जीसी बी कोशिकाओं के प्रवाह cytometric लक्षण वर्णन के लिए अनुकूलित प्रोटोकॉल का वर्णन । हमारे प्रोटोकॉल का प्रमुख लाभ में से एक यह है कि यह 107 (औसत 4-5 x 106 कोशिकाओं) किसी भी पाचन प्रक्रिया के बिना एक ही माउस (C57BL/6 तनाव) से कुल पीपी कोशिकाओं के अलगाव को सक्षम बनाता है । हमने देखा है कि कुल सेल उपज को सकारात्मक पीपीएस की संख्या के साथ संबद्ध किया गया था और निंनलिखित सरल समीकरण है जो प्रयोगात्मक योजना के लिए उपयोगी है से अनुमान लगाया जा सकता है: "कुल पीपी प्रति माउस सेल गणना = 0.5 – 1 x (प्रति एक्साइज पीपी की संख्या माउस) x 106"। इस उच्च कोशिका उपज बढ़ाया सेल व्यवहार्यता के साथ पूरित किया गया था (> 95%) । बेहतर सेल वसूली और व्यवहार्यता के समानांतर में विविध एंटीबॉडी धुंधला पैनलों का उपयोग कर पीपीएस में विभिन्न लिम्फोसाइट उपसेट के प्रवाह cytometric विश्लेषण प्रदर्शन की अनुमति दी.
एक हाल ही में पीपी अलगाव डी यीशु एट अलद्वारा प्रकाशित प्रोटोकॉल की तुलना में । 20 और पिछले19,21रिपोर्ट, हमारे प्रोटोकॉल काफी उच्च कुल सेल उपज और व्यवहार्यता दिया, collagenase के साथ पाचन के अभाव के बावजूद । हालांकि पीपीएस की पहचान "पहली बार जांचकर्ताओं के लिए मुश्किल" हो सकता है, इस प्रोटोकॉल के लिए सीखने की अवस्था बहुत तेजी से है, और अगर महारत हासिल है, हमारी तकनीक छोटी आंत से पी एम सी की पहचान और शल्य चिकित्सा उत्पाद की अनुमति देता है एक छोटी समय. प्रथम प्रयास के बाद वांछित पीपी संख्या तक पहुँच नहीं है, तो हम एसआई के बाहर और समीपस्थ छोर पर ध्यान केंद्रित पीपी पहचान कदम दोहराने का सुझाव देते हैं । हमारे अभ्यास में, लगभग हर माउस में, ग्रहणी अंत में दो बारीकी से स्थित पीपीएस (आंकड़ा 1a) और लघ्वान्त्र के पिछले 5 सेमी के भीतर कम से कम 2-3 पीपीएस का पता लगाया गया ।
TFH धुंधला पीपीएस के भीतर अन्य सेल सबसेट की तुलना में अधिक मांग हो सकता है, इस प्रकार अतिरिक्त ध्यान18की आवश्यकता होती है. यदि कुछ कदम ऊतक प्रसंस्करण और सेल अलगाव के दौरान याद किया जाता है, परिणाम काफी भ्रामक हो सकता है । इसलिए, हम शोधकर्ताओं का सुझाव है कि निंनलिखित प्रयोगात्मक "युक्तियां" पर ध्यान देना । के बाद से प्रमुख TFH और GC बी सेल मार्करों जैसे CXCR5 और GL7 दोनों बी और टी कोशिकाओं में व्यक्त किया जा सकता है, यह एंटीबॉडी पैनलों में एक बी सेल मार्कर शामिल करने के लिए दूषित CD19 के कारण झूठी सकारात्मक परिणाम से बचने के लिए महत्वपूर्ण है+CD4+ डीपी कोशिकाओं24 ( चित्रा 2) । कृपया ध्यान दें कि गेटिंग रणनीति टी सेल मार्करों पर आधारित केवल25 इन कोशिकाओं को भी अत्यधिक CD3 सहित टी सेल मार्कर (डेटा नहीं दिखाया गया है) और CD4 के बाद से डी पी कोशिकाओं के पर्याप्त अपवर्जन प्रदान नहीं करेगा । डीपी कोशिकाओं के बहिष्कार के अलावा, प्रवाह cytometry परिणाम मांय किया जाना चाहिए और उचित नकारात्मक नियंत्रण (जैसे, isotype नियंत्रण, FMOs) को रोजगार द्वारा पुष्टि की । न केवल झूठी सकारात्मकता पर भी गलत TFH गेट झूठी परिणाम और निष्कर्ष के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । TFH गेट का समायोजन कभी-कभार चुनौतीपूर्ण हो सकता है अगर TFH सेल की आबादी प्रचुर मात्रा में नहीं है, जिससे प्रवाह cytometry में एक असतत जनसंख्या के रूप में दिखाई नहीं दे रहा है । इस सीमा को दरकिनार करने के लिए, कई TFH मार्करों के अलावा (जैसे, BCL-6, पीडी-1, ICOS) एंटीबॉडी पैनल में वैकल्पिक गेटिंग अवसर प्रदान और सटीकता में वृद्धि हो सकती है26. व्यावहारिक कारणों के लिए, BCL-6 वैकल्पिक TFH गेटिंग के लिए एक आदर्श सह दाग मार्कर होना पाया गया के रूप में यह गेटिंग जीसी बी कोशिकाओं समवर्ती16 (चित्रा S1C) के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
इसके अलावा, एक सकारात्मक नियंत्रण एक उच्च TFH अनुपात युक्त नमूना TFH गेट सही ढंग से रखने के लिए शोधकर्ताओं अच्छा नेविगेशन प्रदान कर सकता है । हमारे प्रयोगों में, हम एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में वृद्ध चूहों से (पुराने 6-महीने) से पीपी नमूने का इस्तेमाल किया है कि उंर बढ़ने के कारण पी एम एस के भीतर TFH कोशिकाओं की वृद्धि कुल CD4 के ४०% तक स्थिर राज्य में+ टी कोशिकाओं (डेटा नहीं दिखाया गया है) । हम यह भी शोधकर्ताओं कि TFH धुंधला के तकनीकी विवरण में आगे ब्याज TFH सेल धुंधला18के लिए प्रकाशित प्रोटोकॉल पुस्तक में तरीकों को देखने के लिए प्रोत्साहित करते हैं ।
पीपी में प्रायोगिक परिकल्पनाओं का परीक्षण अपेक्षाकृत चुनौतीपूर्ण हो सकता है और सांख्यिकीय महत्व21तक पहुंचने के लिए प्रति समूह चूहों की एक बहुत अधिक संख्या की आवश्यकता हो सकती है । हमारे प्रोटोकॉल के उच्च कोशिका उपज का लाभ लेने के द्वारा, हम निंनलिखित प्रयोगात्मक रणनीतियों के साथ इस बाधा को दरकिनार । सबसे पहले, हम पीपीएस उत्पादेड और उंहें अलग से उनके संरचनात्मक मूल (जैसे, ग्रहणी, jejunal और श्रोणि) के आधार पर हल । फिर, हम समान रूप से अलग प्रयोगात्मक और नियंत्रण समूहों में इन परित पीपीएस वितरित । यह आंतरिक रूप से नियंत्रित प्रयोगात्मक रणनीति हमें अंतर व्यक्तिगत चूहों में अंतर को कम करने के लिए सक्षम है, जबकि सभी कोशिकाओं को एक ही माउस से प्राप्त किया गया ।
इसके अलावा, विभिंन आंत्र डिब्बों के बीच परिवर्तनशीलता (जैसे, ग्रहणी बनामलघ्वान्त्र)-पहले महत्वपूर्ण होने की सूचना दी2 -प्रायोगिक और नियंत्रण के रूप में रोका गया था पीपीएस के बराबर संख्या से शामिल समूहों प्रति संरचनात्मक क्षेत्र (आंकड़ा 5 ए)। एक ही दृष्टिकोण का उपयोग स्वतंत्र प्रयोगों की प्रतिकृति प्रदर्शन करके, हम विश्वसनीयता और हमारे परिणामों के महत्व में सुधार. विशिष्ट विविधताओं को नष्ट करने के अलावा, इस पद्धति भी स्पेयर चूहों, रिएजेंट और समय में मदद करता है ।
विकास और हमारे प्रोटोकॉल के अनुकूलन के दौरान, हमारे परिणामों से पता चला है कि collagenase द्वितीय और चतुर्थ आधारित पाचन स्पष्ट रूप से कम CXCR5 अभिव्यक्ति (चित्रा 5B), जबकि अंय खोज TFH और जीसी बी कोशिकाओं के लिए सतह अणुओं बरकरार रहे ( चित्रा 5C -इ) . हाल ही में एक रिपोर्ट जौव प्रोटोकॉल19में, collagenase द्वितीय पीपीएस और एलपीएस से लिम्फोसाइट अलगाव के लिए बहुत प्रभावी होना दिखाया गया था । हालांकि, collagenase द्वितीय पहले एक उच्च tryptic गतिविधि है, जो कई सतह अणुओं के दरार में परिणाम की सूचना दी गई है । इसकी सतह अणु अनुकूल प्रकृति को देखते हुए27 कम tryptic गतिविधि और साहित्य में अधिक आम उपयोग के कारण28,29,30, Collagenase चतुर्थ में Collagenase द्वितीय के अलावा भी शामिल किया गया था हमारे अध्ययन और इन पिछले रिपोर्टों में सिफारिश के रूप में सांद्रता में इस्तेमाल किया । collagenase और समकक्ष एंजाइमों का उपयोग प्रतिरक्षा कोशिकाओं पर पाचन के अवांछित प्रभाव जैसे बदल सतह अणु अभिव्यक्ति31,27के कारण श्लैष्मिक इम्यूनोलॉजी में एक विरोधाभासी मुद्दा रहा है ।
यह पहले बताया गया था कि collagenase के विभिंन प्रकार के उपयोग मानव आंत३२ और tonsil नमूने18के भीतर प्रवाह cytometric CXCR5 का पता लगाने के साथ हस्तक्षेप सकता है । इसके विपरीत, अंय अध्ययनों collagenases24,३३के उपयोग के बिना पीपीएस से TFH और जीसी बी कोशिकाओं के अलगाव का प्रदर्शन किया । हालांकि, अब तक कोई तुलनात्मक दृष्टिकोण का आकलन है कि शामिल किए जाने या collagenase पाचन के अपवर्जन murine पीपीएस से CXCR5-व्यक्त TFH कोशिकाओं के अलगाव के लिए इष्टतम स्थिति का प्रतिनिधित्व करेंगे करने के लिए किया गया था । माउस CXCR5 एक ३७४ एमिनो एसिड है लंबे समय से सात-पास झिल्ली प्रोटीन के साथ अपेक्षाकृत कम extracellular क्षेत्रों जैसे अंय transmembrane प्रोटीन की तुलना में CD4, CD19 कि प्रचुर मात्रा में लसीकावत् कोशिकाओं में व्यक्त कर रहे है पीपीएस (UniProt से प्राप्त डेटा) । चित्रा 8A-बीमें, एक आणविक मॉडल और माउस CXCR5 के कुल एमिनो एसिड अनुक्रम collagenase आधारित पाचन के माना लक्ष्य दृश्यों के साथ चित्रित कर रहे हैं, जो अलग कर देना (glycine) और तटस्थ अमीनो के बीच रासायनिक बांड Gly करने के लिए जाता है एसिड३४। सात-पास transmembrane आणविक संरचना कम extracellular डोमेन जिसके परिणामस्वरूप CXCR5 अणु एंजाइमी पाचन (चित्रा 8A) को कमजोर बनाने के लिए जिंमेदार हो सकता है । साज़िश, हमने पाया है कि collagenase उपचार के बाद CXCR5 अभिव्यक्ति का पता लगाने का इस्तेमाल किया एंटीबॉडी क्लोन पर निर्भर है । हालांकि 2G8 और L138D7 क्लोनों में इसी तरह के प्रदर्शन से पता चला अपच पीपी समूह, के रूप में तुलनीय TFH अंश का पता लगाने के द्वारा निर्धारित, पचा पीपी समूह में, L138D7 क्लोन लगभग 3x (≈ 9%) TFH कोशिकाओं के उच्च अंश CD4 के भीतर से पता चला+ 2G8 क्लोन से टी कोशिकाओं (≈ 3%) (चित्रा 6). यह खोज कि कम CXCR5 धुंधला collagenase के एंजाइमी गतिविधि द्वारा संशोधित तीन आयामी epitope विंयास के लिए माध्यमिक हो सकता है पता चलता है । हमारे परिणामों से संकेत मिलता है कि पीपी तैयारी के दौरान collagenase-आधारित पाचन से बचना चाहिए ।
CXCR5 अणु का पता लगाने के साथ collagenase पृथक्करण के हस्तक्षेप पाचन कदम को छोड़कर द्वारा दरकिनार किया गया था । हालांकि, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि कुछ ऊतकों के लिए जैसे एल. पी., यांत्रिक व्यवधान पर्याप्त नहीं है कोशिकाओं को अलग करने के लिए और ऐसे ऊतकों के लिए, एंजाइमी पाचन19आवश्यक होगा. भविष्य में, यह आवश्यक हो जाएगा वैकल्पिक पाचन शर्तों के साथ ही पाचन-संगत एंटीबॉडी क्लोनों का परीक्षण करने के लिए एंजाइमी पाचन प्रक्रिया की आवश्यकता ऊतकों के लिए इस तकनीकी सीमा बाईपास । तब तक, ऐसी प्रतिरक्षा प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के रूप में इमेजिंग तकनीक इन ऊतकों में TFH का पता लगाने के लिए पसंद की विधि के रूप में रहना होगा । एल. ए. कोशिकाओं को अलग करने के अलावा, कुछ टेम सेल सबसेट की अलगाव जैसे dc और प्लाज्मा कोशिकाओं पीपीएस से एंजाइमी पाचन३५की आवश्यकता होती है । जब हमारे प्रोटोकॉल को रोजगार, शोधकर्ताओं जो पीपीएस से इन सेल सबसेट को अलग करने की इच्छा उचित एंजाइमी पाचन कदम20शामिल करना चाहिए । डीसी मार्कर की अभिव्यक्ति के साथ एंजाइमी पाचन के संभावित हस्तक्षेप को ध्यान में रखा जाना चाहिए और पाचन की स्थिति की जरूरत के रूप में अनुकूलित किया जाना चाहिए । जब TFH और GC बी कोशिकाओं का अलगाव एक सेल सबसेट है कि collagenase पाचन३६की आवश्यकता के अलावा वांछित है, पी एस प्रत्येक माउस से एकत्र पीपीएस के साथ और समानांतर पैनलों में collagenase उपचार के बिना प्रसंस्करण के लिए दो समूहों में अलग किया जा सकता है ।
पीपी लिम्फोसाइटों पर collagenase के प्रभाव सतह अणु अभिव्यक्ति के लिए प्रतिबंधित नहीं थे । हमारे परिणामों से पता चला कि एंजाइमी पाचन एक खुराक पर निर्भर तरीके से पीपी कोशिकाओं के भीतर लिम्फोसाइट अनुपात में एक रिश्तेदार कमी (चित्रा 7) का कारण बना । लिम्फोसाइट भिन्न की कमी collagenase-मध्यस्थ की अन्य प्रकार की रिलीज़ का परिणाम हो सकता है टेम सेल सबसेट जैसे फ़ैगोसाइट और dc पी एस से बड़ा और अधिक लसीकावत् कक्षों से दानेदार हैं । यह भी संभव है कि collagenase पाचन मध्यस्थता सेल जारी पड़ोसी एल. पी. और intraepithelial डिब्बों से FSC-SSC प्रोफ़ाइल के परिवर्तन में योगदान कर सकता है । अंय आंत डिब्बों से इस कोशिका संदूषण भी पीपी लिम्फोसाइटों के प्रवाह विश्लेषण में हस्तक्षेप का कारण हो सकता है । उस आधार पर, सेल पवित्रता को अधिकतम करने के लिए, हम भी ऐसे EDTA या डीटीटी कि व्यापक रूप से उपकला कोशिकाओं और बलगम20निकालने के लिए उपयोग किया जाता है के रूप में रिएजेंट के अलावा से बचने के लिए, शारीरिक और संभव के रूप में unmanipulate के रूप में ऊतक तैयारी की स्थिति रखने. एंजाइमी पाचन के इन प्रतिकूल प्रभावों के बावजूद, पीपी लिम्फोसाइटों पर लाभकारी प्रभाव भी ऐसे intracellular धुंधला और कोशिका व्यवहार्यता के सुधार के रूप में की खोज की थी (आंकड़ा 7d-एफ, जी) । हालांकि, आगे विश्लेषण से पता चला है कि इन प्रभावों को आंदोलन की प्रक्रिया को ३७ डिग्री सेल्सियस पर स्वतंत्र रूप से एंजाइमी पाचन के लिए जिंमेदार ठहराया क्योंकि कोशिका व्यवहार्यता और intracellular Foxp3 धुंधला एक तुलनीय हद तक इष्ट थे जब कोशिकाओं में आंदोलन किया गया collagenase की अनुपस्थिति । Mechanistically, आंदोलन के लाभकारी प्रभाव पी एस से आंतों की सामग्री और बलगम को हटाने में सुधार के कारण हो सकता है ।
संक्षेप में, हम पीपीएस से लिम्फोसाइटों के अलगाव के लिए एक सुव्यवस्थित प्रोटोकॉल का वर्णन किया है । पृथक कोशिकाओं कई सेल उपसमुच्चय के प्रवाह cytometric लक्षण वर्णन के लिए दाग हो सकता है या सेल छंटाई और बाद में विभिंन में कार्यरत के अधीन किया जा सकता है इन विट्रो में और vivo कार्यात्मक परख में ।
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Disclosures
ब्याज का कोई विरोध नहीं घोषित ।
Acknowledgments
हम उपयोगी विचार विमर्श और प्रवाह cytometry विश्लेषण के साथ समर्थन के लिए लौरा स्ट्रास और पीटर बाबा शुक्रिया अदा करना चाहूंगा ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-mouse CD4 antibody | eBioscience, Biolegend* | 17-0041-81 ,10054* | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse CD19 antibody | eBioscience | MA5-16536 | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse PD-1 antibody | eBioscience | 61-9985-82 | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse ICOS antibody | eBioscience | 12-9942-82 | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse GL7 antibody | Biolegend | 144610 | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse CXCR5 antibody | Biolegend*, BD Bioscience | 145512*, 551960 | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse BCL-6 antibody | Biolegend | 358512 | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse Foxp3 antibody | eBioscience | 17-5773-82 | For detailed information see Table 1 |
| Streptavidin-BV421 | BD Bioscience | 563259 | For detailed information see Table 1 |
| FixableViability Dye | eBioscience | L34957 | For detailed information see Table 1 |
| 7AAD | Biolegend | 420404 | For detailed information see Table 1 |
| FcBlock (CD16/32) | BD Bioscience | 553141 | For detailed information see Table 1 |
| Collagenase II | Worthington | LS004176 | |
| Collagenase IV | Worthington | LS004188 | |
| Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set | eBioscience | 00-5523-00 | |
| 6-well,12-well & 96-well plates | Falcon/Corning | 353046,353043/3596 | |
| 50 mL conical tubes | Falcon | 3520 | |
| 40 µm cell strainer | Falcon | 352340 | |
| 10 mL syringe-plunger | Exel INT | 26265 | |
| RPMI | Corning | 15-040-CV | |
| PBS | Corning | 21-040-CM | |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Orbital shaker | VWR | Model 200 | |
| Curved-end scissor | |||
| Fine Serrated Forceps | |||
| Small curved scissor |
References
- van den Berg, T. K., van der Schoot, C. E. Innate immune ‘self’ recognition: a role for CD47-SIRPα interactions in hematopoietic stem cell transplantation. Trends in Immunology. 29 (5), 203-206 (2008).
- Mowat, A. M., Agace, W. W. Regional specialization within the intestinal immune system. Nature Reviews Immunology. 14 (10), 667-685 (2014).
- Reboldi, A., Cyster, J. G. Peyer’s patches: Organizing B-cell responses at the intestinal frontier. Immunological Reviews. 271 (1), 230-245 (2016).
- Heel, K. A., McCauley, R. D., Papadimitriou, J. M., Hall, J. C. Review: Peyer’s patches. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 12 (2), 122-136 (1997).
- Fagarasan, S., Kinoshita, K., Muramatsu, M., Ikuta, K., Honjo, T. In situ class switching and differentiation to IgA-producing cells in the gut lamina propria. Nature. 413 (6856), 639-643 (2001).
- Hopkins, S. A., Niedergang, F., Corthesy-Theulaz, I. E., Kraehenbuhl, J. P. A recombinant Salmonella typhimurium vaccine strain is taken up and survives within murine Peyer’s patch dendritic cells. Cellular Microbiology. 2 (1), 59-68 (2000).
- Shreedhar, V. K., Kelsall, B. L., Neutra, M. R. Cholera toxin induces migration of dendritic cells from the subepithelial dome region to T- and B-cell areas of Peyer's patches. Infection and Immunity. 71 (1), 504-509 (2003).
- Sato, A., Iwasaki, A. Peyer’s patch dendritic cells as regulators of mucosal adaptive immunity. Cellular and Molecular Life Sciences. 62 (12), 1333-1338 (2005).
- Bemark, M., Boysen, P., Lycke, N. Y. Induction of gut IgA production through T cell-dependent and T cell-independent pathways. Annals of the New York Academy of Sciences. 1247 (1), 97-116 (2012).
- Fagarasan, S., Kawamoto, S., Kanagawa, O., Suzuki, K. Adaptive Immune Regulation in the Gut: T Cell-Dependent and T Cell-Independent IgA Synthesis. Annual Review of Immunology. 28, 243-273 (2010).
- Hase, K., et al. Uptake through glycoprotein 2 of FimH + bacteria by M cells initiates mucosal immune response. Nature. 462 (7270), 226-230 (2009).
- Wu, H., et al. An Inhibitory Role for the Transcription Factor Stat3 in Controlling IL-4 and Bcl6 Expression in Follicular Helper T Cells. Journal of Immunology. 195 (5), 2080-2089 (2015).
- Vinuesa, C. G., Tangye, S. G., Moser, B., Mackay, C. R. Follicular B helper T cells in antibody responses and autoimmunity. Nature Reviews Immunology. 5 (11), 853-865 (2005).
- Victora, G. D., Nussenzweig, M. C. Germinal Centers. Annual Review of Immunology. 30, 429-457 (2012).
- Vaeth, M., et al. Store-Operated Ca2+Entry in Follicular T Cells Controls Humoral Immune Responses and Autoimmunity. Immunity. 44 (6), 1350-1364 (2016).
- Meli, A. P., et al. The Integrin LFA-1 Controls T Follicular Helper Cell Generation and Maintenance. Immunity. 45 (4), 831-846 (2016).
- Fu, W., et al. Deficiency in T follicular regulatory cells promotes autoimmunity. Journal of Experimental Medicine. 215 (3), 815-825 (2018).
- Espéli, M., Walker, J. M. T follicular helper cells - Methods and Protocols. , (2015).
- Couter, C. J., Surana, N. K. Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes. Journal of Visual Experiments. (111), e54114 (2016).
- De Jesus, M., Ahlawat, S., Mantis, N. J. Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer’s Patches. Journal of Visual Experiments. (73), e50167 (2013).
- Pastori, C., Lopalco, L. Isolation and in vitro Activation of Mouse Peyer’s Patch Cells from Small Intestine Tissue. Bio-protocol. 4 (21), e1282 (2014).
- Fukuda, S., Hase, K., Ohno, H. Application of a Mouse Ligated Peyer’s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells. Journal of Visual Experiments. (58), 3225 (2011).
- Naito, Y., et al. Germinal Center Marker GL7 Probes Activation-Dependent Repression of N-Glycolylneuraminic Acid, a Sialic Acid Species Involved in the Negative Modulation of B-Cell Activation. Molecular and Cellular Biology. 27 (8), 3008-3022 (2007).
- Bollig, N., et al. Transcription factor {IRF4} determines germinal center formation through follicular T-helper cell differentiation. Proceedings of the National Academy of Science of U. S. A. 109 (22), 8664-8669 (2012).
- Pérez-Mazliah, D., et al. Follicular Helper T Cells are Essential for the Elimination of Plasmodium Infection. EBioMedicine. 24, 216-230 (2017).
- Sage, P. T., Sharpe, A. H. T follicular regulatory cells in the regulation of B cell responses. Trends Immunology. 36 (7), 410-418 (2015).
- Van Damme, N., et al. Chemical agents and enzymes used for the extraction of gut lymphocytes influence flow cytometric detection of T cell surface markers. Journal of Immunological Methods. 236 (1-2), 27-35 (2000).
- Meenan, J., et al. Altered expression of alpha 4 beta 7, a gut homing integrin, by circulating and mucosal T cells in colonic mucosal inflammation. Gut. 40 (2), 241-246 (1997).
- Cao, A. T., et al. Interleukin (IL) -21 promotes intestinal IgA response to microbiota. Mucosal Immunology. 8 (5), 1072-1082 (2015).
- Wei, J., et al. Autophagy enforces functional integrity of regulatory T cells by coupling environmental cues and metabolic homeostasis. Nature Immunology. 17 (3), 277-285 (2016).
- Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function. European Journal of Microbiology & Immunology. 2 (2), 112-120 (2012).
- Trapecar, M., et al. An Optimized and Validated Method for Isolation and Characterization of Lymphocytes from HIV+ Human Gut Biopsies. AIDS Research and Human Retroviruses. 33 (S1), (2017).
- Bergqvist, P., Gardby, E., Stensson, A., Bemark, M., Lycke, N. Y. Gut IgA Class Switch Recombination in the Absence of CD40 Does Not Occur in the Lamina Propria and Is Independent of Germinal Centers. Journal of Immunology. 177 (11), 7772-7783 (2006).
- Keil, B., Gilles, A. M., Lecroisey, A., Hurion, N., Tong, N. T. Specificity of collagenase from Achromobacter iophagus. FEBS Letters. 56 (2), 292-296 (1975).
- Mora, J. R., et al. Selective imprinting of gut-homing T cells by Peyer’s patch dendritic cells. Nature. 424 (6944), 88-93 (2003).
- Reboldi, A., et al. Mucosal immunology: IgA production requires B cell interaction with subepithelial dendritic cells in Peyer’s patches. Science. 352 (6287), (2016).
