В этом исследовании мы представляем Роман и эффективного протокола для изоляции лимфоциты от Пейера (PPs), которые могут быть впоследствии использованы в vivo и in vitro функциональных анализов, а также поток гранулярных исследования фолликулярной T вспомогательные и зародышевого центра B клетки.
В слизистой оболочке кишечника иммунные клетки представляют собой уникальный иммунологические сущности, которая способствует иммунной толерантности при одновременно присвоении иммунной обороны против патогенов. Хорошо известно, что Пейера (PPs) играют важную роль в слизистой иммунной сети хостинг нескольких эффекторных T и B клетки подмножеств. Некоторая часть этих клеток-эффекторов, фолликулярная Т-хелперов (ЦГЗ) и клетки B зародышевого центра (GC) профессиональную в регуляции гуморального иммунитета. Таким образом характеристика эти подмножества ячеек в PPs с точки зрения их дифференциации программы и функциональных свойств могут обеспечить важную информацию о слизистой иммунитета. С этой целью легко применимые, эффективной и воспроизводимый метод лимфоцитов изоляции от PPs будет ценным для исследователей. В этом исследовании мы стремились создать эффективный метод для изоляции лимфоцитов из PPs мыши с высоким клетки доходности. Наш подход показал, что первоначальный ткани, обработки, например использование пищеварительной реагентов и ткани агитации, а также ячейки окрашивание условий и выбор панелей антитела, имеют большое влияние на качество и личность изолированных лимфоцитов и на экспериментальные результаты.
Здесь мы описываем протокол позволяет исследователям эффективно изолировать популяций лимфоцитов из PPs, позволяя воспроизводимого потока цитометрии-оценки на основе подмножеств T и B cell, сосредоточиваясь в первую очередь на TFH и GC B подмножества ячеек.
Всего желудочно-кишечного тракта от начала до конца палубных с обширной сетью лимфоидной, содержащий иммунных клеток, больше чем любой другой орган человека и мыши1. Пейера в патчи (PPs) являются одним из основных компонентов кишечника отделения этой клеточных иммунных Организации, так называемые кишечнике связанных лимфоидной ткани (GALT)2,3. В PPs, тысячи миллионов антигенов, производный от пищевых материалов, синантропных микробиоту и патогенов будучи непрерывно, и при необходимости соответствующие иммунных реакций к ним смонтированные таким образом поддерживая кишечной иммунной гомеостаз. В этом смысле PPs может называться «миндалин кишечника». PPs состоят из основных суб отсеков: Субэпителиальная купол (SED), большие зоны B-клеток фолликула; эпителия вышележащих связанные фолликула (инженер) и межфолликулярных области (IFR) где T-клетки расположены4. Этот уникальный дробления PPs позволяет различных эффекторных клеток подмножеств сотрудничать, таким образом, наделяет туберкулина в кишечнике.
PPs не хватает афферентные лимфатические, и по этой причине, антигены, перевезены в PPs из тонкой кишки не проводятся через лимфатические сосуды в отличие от большинства других лимфоидных органов. Вместо этого специализированные эпителиальные клетки, расположенные в фей, так называемые M клеток, отвечают за передачу Люминал антигенов в PPs5. Впоследствии, перевозимых антигены подобрал дендритных клеток (DCs) и фагоциты, которые расположены в регионе Субэпителиальная купол (SED) под FAE6,7. Этот процесс сортировки антигена, DCs в PP важно инициировать адаптивного иммунного ответа8 и последующее поколение IgA, секреции клетки9.
Из-за антигенные бремя от синантропных флоры и пищевых материалов PPs хост эндогенно активированного эффекторных T и клетки B подмножества в большой обилия например TFH и IgA+ GC B клеток10, предложив, что PPs представляют сайт активной иммунной 11ответ. Обнаружение до 20-25% TFH клетки в течение всего CD4+ T Мобильный отсека и до 10 – 15%, GC B клетки в течение всего клетки B возможен в PPs, собранных от неиммунизированных молодых мышей C57BL/612. В отличие от других типов вспомогательные клетки T (т.е., Th1, Th2, Th17 клетки), TFH клетки показывают уникальные тропизм в клетки B фолликулы главным образом благодаря CXCR5 выражение, которое способствует TFH клеток самонаведения вдоль градиента CXCL1313. В зонах B клеток фолликула PPs TFH клетки вызывают рекомбинации переключатель класса IgA и соматические Гипермутационный в активированные клетки B, из которых высокоспецифичные IgA производства клеток дифференцировать14. Впоследствии эти антитела секретирующих плазматических клеток миграции propria пластинки (LP) и регулировать иммунного гомеостаза в кишечнике10.
Определение и характеристика TFH и GC B клеточных популяций в PPs может позволить исследователей для изучения динамики гуморального иммунного ответа в условиях устойчивого состояния без необходимости длительной иммунизации моделей традиционно используется в TFH-GC B клеток исследования15,16,17,18. Анализируя TFH клетки в PPs не так просто, как другие клетки подмножеств. Технические проблемы включают в себя выявление условий приготовления идеальной ткани, поверхности антитела маркер комбинация, а также выбрав соответствующие положительной и отрицательной контроля. TFH и PP поля исследования демонстрируют большое разнообразие с точки зрения экспериментальной процедуры и далеки от наделения консенсуса для установления стандартизованных протоколов по нескольким причинам. Во-первых каждого подмножества ячеек в пределах PPs, как правило, быть затронуты дифференциально условий приготовления тканей, требующих дальнейшего изменения подмножества конкретным образом клетки. Во-вторых существует значительное расхождение среди сообщаемых методов относительно деталей подготовка клетки от PPs. третьего, количество на основе протокола сравнительных исследований, изучения методов подготовки идеально тканей и экспериментальных условий для PP и ЦГВЗ исследования является довольно ограниченной.
Текущие исследования на основе протокола предложил для PP ячейки подготовка19,20,21,22 были не TFH – или GC клетки B ориентированный. Кроме того, были найдены некоторые условия подготовки ткани, рекомендуется для PPs19,20 , например на основе коллагеназы пищеварение негативно повлияли на результат идентификации TFH подачей cytometry18. Исходя из этого мы полагали, что оптимизированные, стандартизированных и воспроизводимые протокол, который может использоваться для изучения TFH и GC B динамика клеток в PPs будет ценным для следователей, работающих по этой теме. Эта потребность дал нам стимул для создания улучшение и современный протокол для изоляции и характеристика лимфоцитов PP, мелко оптимизированную для клеточного восстановления, жизнеспособности и эффективности для потока гранулярных характеристика несколько T и B подмножества ячеек. Мы также стремились исключить несколько трудоемкий подготовительных шагов, предложенных в предыдущих протоколах, таким образом, снижая необходимые манипуляции и времени для подготовки ткани и клетки от PPs.
Здесь мы описываем протокол, оптимизированный для потока характеристика гранулярных клеток TFH и GC B. Одним из основных преимуществ нашего протокола является, что он позволяет изоляции до 107 (в среднем 4-5 х 106 клеток) всего PP клеток из одной мыши (штамм C57BL/6) без каких-либо процес?…
The authors have nothing to disclose.
Мы хотели бы поблагодарить Лаура Штраус и Питер Sage за полезные обсуждения и поддержки с cytometry анализ потоков.
anti-mouse CD4 antibody | eBioscience, Biolegend* | 17-0041-81 ,10054* | For detailed information see Table 1 |
anti-mouse CD19 antibody | eBioscience | MA5-16536 | For detailed information see Table 1 |
anti-mouse PD-1 antibody | eBioscience | 61-9985-82 | For detailed information see Table 1 |
anti-mouse ICOS antibody | eBioscience | 12-9942-82 | For detailed information see Table 1 |
anti-mouse GL7 antibody | Biolegend | 144610 | For detailed information see Table 1 |
anti-mouse CXCR5 antibody | Biolegend*, BD Bioscience | 145512*, 551960 | For detailed information see Table 1 |
anti-mouse BCL-6 antibody | Biolegend | 358512 | For detailed information see Table 1 |
anti-mouse Foxp3 antibody | eBioscience | 17-5773-82 | For detailed information see Table 1 |
Streptavidin-BV421 | BD Bioscience | 563259 | For detailed information see Table 1 |
FixableViability Dye | eBioscience | L34957 | For detailed information see Table 1 |
7AAD | Biolegend | 420404 | For detailed information see Table 1 |
FcBlock (CD16/32) | BD Bioscience | 553141 | For detailed information see Table 1 |
Collagenase II | Worthington | LS004176 | |
Collagenase IV | Worthington | LS004188 | |
Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set | eBioscience | 00-5523-00 | |
6-well,12-well & 96-well plates | Falcon/Corning | 353046,353043/3596 | |
50 ml conical tubes | Falcon | 3520 | |
40 µm cell strainer | Falcon | 352340 | |
10 ml syringe-plunger | Exel INT | 26265 | |
RPMI | Corning | 15-040-CV | |
PBS | Corning | 21-040-CM | |
FBS | Atlanta Biologicals | S11150 | |
Orbital shaker | VWR | Model 200 | |
Curved-end scissor | |||
Fine Serrated Forceps | |||
Small curved scissor |