Summary

Разгадке ключевые игроки гуморального иммунитета: Расширенный и оптимизированный протокол лимфоцитов изоляции от патчи Пейера в мышиных

Published: November 21, 2018
doi:

Summary

В этом исследовании мы представляем Роман и эффективного протокола для изоляции лимфоциты от Пейера (PPs), которые могут быть впоследствии использованы в vivo и in vitro функциональных анализов, а также поток гранулярных исследования фолликулярной T вспомогательные и зародышевого центра B клетки.

Abstract

В слизистой оболочке кишечника иммунные клетки представляют собой уникальный иммунологические сущности, которая способствует иммунной толерантности при одновременно присвоении иммунной обороны против патогенов. Хорошо известно, что Пейера (PPs) играют важную роль в слизистой иммунной сети хостинг нескольких эффекторных T и B клетки подмножеств. Некоторая часть этих клеток-эффекторов, фолликулярная Т-хелперов (ЦГЗ) и клетки B зародышевого центра (GC) профессиональную в регуляции гуморального иммунитета. Таким образом характеристика эти подмножества ячеек в PPs с точки зрения их дифференциации программы и функциональных свойств могут обеспечить важную информацию о слизистой иммунитета. С этой целью легко применимые, эффективной и воспроизводимый метод лимфоцитов изоляции от PPs будет ценным для исследователей. В этом исследовании мы стремились создать эффективный метод для изоляции лимфоцитов из PPs мыши с высоким клетки доходности. Наш подход показал, что первоначальный ткани, обработки, например использование пищеварительной реагентов и ткани агитации, а также ячейки окрашивание условий и выбор панелей антитела, имеют большое влияние на качество и личность изолированных лимфоцитов и на экспериментальные результаты.

Здесь мы описываем протокол позволяет исследователям эффективно изолировать популяций лимфоцитов из PPs, позволяя воспроизводимого потока цитометрии-оценки на основе подмножеств T и B cell, сосредоточиваясь в первую очередь на TFH и GC B подмножества ячеек.

Introduction

Всего желудочно-кишечного тракта от начала до конца палубных с обширной сетью лимфоидной, содержащий иммунных клеток, больше чем любой другой орган человека и мыши1. Пейера в патчи (PPs) являются одним из основных компонентов кишечника отделения этой клеточных иммунных Организации, так называемые кишечнике связанных лимфоидной ткани (GALT)2,3. В PPs, тысячи миллионов антигенов, производный от пищевых материалов, синантропных микробиоту и патогенов будучи непрерывно, и при необходимости соответствующие иммунных реакций к ним смонтированные таким образом поддерживая кишечной иммунной гомеостаз. В этом смысле PPs может называться «миндалин кишечника». PPs состоят из основных суб отсеков: Субэпителиальная купол (SED), большие зоны B-клеток фолликула; эпителия вышележащих связанные фолликула (инженер) и межфолликулярных области (IFR) где T-клетки расположены4. Этот уникальный дробления PPs позволяет различных эффекторных клеток подмножеств сотрудничать, таким образом, наделяет туберкулина в кишечнике.

PPs не хватает афферентные лимфатические, и по этой причине, антигены, перевезены в PPs из тонкой кишки не проводятся через лимфатические сосуды в отличие от большинства других лимфоидных органов. Вместо этого специализированные эпителиальные клетки, расположенные в фей, так называемые M клеток, отвечают за передачу Люминал антигенов в PPs5. Впоследствии, перевозимых антигены подобрал дендритных клеток (DCs) и фагоциты, которые расположены в регионе Субэпителиальная купол (SED) под FAE6,7. Этот процесс сортировки антигена, DCs в PP важно инициировать адаптивного иммунного ответа8 и последующее поколение IgA, секреции клетки9.

Из-за антигенные бремя от синантропных флоры и пищевых материалов PPs хост эндогенно активированного эффекторных T и клетки B подмножества в большой обилия например TFH и IgA+ GC B клеток10, предложив, что PPs представляют сайт активной иммунной 11ответ. Обнаружение до 20-25% TFH клетки в течение всего CD4+ T Мобильный отсека и до 10 – 15%, GC B клетки в течение всего клетки B возможен в PPs, собранных от неиммунизированных молодых мышей C57BL/612. В отличие от других типов вспомогательные клетки T (т.е., Th1, Th2, Th17 клетки), TFH клетки показывают уникальные тропизм в клетки B фолликулы главным образом благодаря CXCR5 выражение, которое способствует TFH клеток самонаведения вдоль градиента CXCL1313. В зонах B клеток фолликула PPs TFH клетки вызывают рекомбинации переключатель класса IgA и соматические Гипермутационный в активированные клетки B, из которых высокоспецифичные IgA производства клеток дифференцировать14. Впоследствии эти антитела секретирующих плазматических клеток миграции propria пластинки (LP) и регулировать иммунного гомеостаза в кишечнике10.

Определение и характеристика TFH и GC B клеточных популяций в PPs может позволить исследователей для изучения динамики гуморального иммунного ответа в условиях устойчивого состояния без необходимости длительной иммунизации моделей традиционно используется в TFH-GC B клеток исследования15,16,17,18. Анализируя TFH клетки в PPs не так просто, как другие клетки подмножеств. Технические проблемы включают в себя выявление условий приготовления идеальной ткани, поверхности антитела маркер комбинация, а также выбрав соответствующие положительной и отрицательной контроля. TFH и PP поля исследования демонстрируют большое разнообразие с точки зрения экспериментальной процедуры и далеки от наделения консенсуса для установления стандартизованных протоколов по нескольким причинам. Во-первых каждого подмножества ячеек в пределах PPs, как правило, быть затронуты дифференциально условий приготовления тканей, требующих дальнейшего изменения подмножества конкретным образом клетки. Во-вторых существует значительное расхождение среди сообщаемых методов относительно деталей подготовка клетки от PPs. третьего, количество на основе протокола сравнительных исследований, изучения методов подготовки идеально тканей и экспериментальных условий для PP и ЦГВЗ исследования является довольно ограниченной.

Текущие исследования на основе протокола предложил для PP ячейки подготовка19,20,21,22 были не TFH – или GC клетки B ориентированный. Кроме того, были найдены некоторые условия подготовки ткани, рекомендуется для PPs19,20 , например на основе коллагеназы пищеварение негативно повлияли на результат идентификации TFH подачей cytometry18. Исходя из этого мы полагали, что оптимизированные, стандартизированных и воспроизводимые протокол, который может использоваться для изучения TFH и GC B динамика клеток в PPs будет ценным для следователей, работающих по этой теме. Эта потребность дал нам стимул для создания улучшение и современный протокол для изоляции и характеристика лимфоцитов PP, мелко оптимизированную для клеточного восстановления, жизнеспособности и эффективности для потока гранулярных характеристика несколько T и B подмножества ячеек. Мы также стремились исключить несколько трудоемкий подготовительных шагов, предложенных в предыдущих протоколах, таким образом, снижая необходимые манипуляции и времени для подготовки ткани и клетки от PPs.

Protocol

Руководящие принципы согласно институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC) Бет Израиля Deaconess медицинский центр были проведены все исследования и эксперименты, описанные в настоящем Протоколе. 1. проектирование экспериментальной установки и мыши групп …

Representative Results

В отличие от предыдущих протокол20, мы наблюдали, что PPs не распределяются равномерно по всему Си, но локализованы более плотно к проксимальных и дистальных концов Си, как показано в Рисунок 1A. Потока гранулярных анализ по?…

Discussion

Здесь мы описываем протокол, оптимизированный для потока характеристика гранулярных клеток TFH и GC B. Одним из основных преимуществ нашего протокола является, что он позволяет изоляции до 107 (в среднем 4-5 х 106 клеток) всего PP клеток из одной мыши (штамм C57BL/6) без каких-либо процес?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы хотели бы поблагодарить Лаура Штраус и Питер Sage за полезные обсуждения и поддержки с cytometry анализ потоков.

Materials

anti-mouse CD4 antibody eBioscience, Biolegend* 17-0041-81 ,10054* For detailed information see Table 1
anti-mouse CD19 antibody eBioscience MA5-16536 For detailed information see Table 1
anti-mouse PD-1 antibody eBioscience 61-9985-82 For detailed information see Table 1
anti-mouse ICOS antibody eBioscience 12-9942-82 For detailed information see Table 1
anti-mouse GL7 antibody Biolegend 144610 For detailed information see Table 1
anti-mouse CXCR5 antibody Biolegend*, BD Bioscience 145512*, 551960 For detailed information see Table 1
anti-mouse BCL-6 antibody Biolegend 358512 For detailed information see Table 1
anti-mouse Foxp3 antibody eBioscience 17-5773-82 For detailed information see Table 1
Streptavidin-BV421 BD Bioscience 563259 For detailed information see Table 1
FixableViability Dye eBioscience L34957 For detailed information see Table 1
7AAD Biolegend 420404 For detailed information see Table 1
FcBlock (CD16/32) BD Bioscience 553141 For detailed information see Table 1
Collagenase II Worthington LS004176
Collagenase IV Worthington LS004188
Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set eBioscience 00-5523-00
6-well,12-well & 96-well plates Falcon/Corning 353046,353043/3596
50 ml conical tubes Falcon 3520
40 µm cell strainer Falcon 352340
10 ml syringe-plunger Exel INT 26265
RPMI Corning 15-040-CV
PBS Corning 21-040-CM
FBS Atlanta Biologicals S11150
Orbital shaker VWR Model 200
Curved-end scissor
Fine Serrated Forceps
Small curved scissor

References

  1. van den Berg, T. K., van der Schoot, C. E. Innate immune ‘self’ recognition: a role for CD47-SIRPα interactions in hematopoietic stem cell transplantation. Trends in Immunology. 29 (5), 203-206 (2008).
  2. Mowat, A. M., Agace, W. W. Regional specialization within the intestinal immune system. Nature Reviews Immunology. 14 (10), 667-685 (2014).
  3. Reboldi, A., Cyster, J. G. Peyer’s patches: Organizing B-cell responses at the intestinal frontier. Immunological Reviews. 271 (1), 230-245 (2016).
  4. Heel, K. A., McCauley, R. D., Papadimitriou, J. M., Hall, J. C. Review: Peyer’s patches. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 12 (2), 122-136 (1997).
  5. Fagarasan, S., Kinoshita, K., Muramatsu, M., Ikuta, K., Honjo, T. In situ class switching and differentiation to IgA-producing cells in the gut lamina propria. Nature. 413 (6856), 639-643 (2001).
  6. Hopkins, S. A., Niedergang, F., Corthesy-Theulaz, I. E., Kraehenbuhl, J. P. A recombinant Salmonella typhimurium vaccine strain is taken up and survives within murine Peyer’s patch dendritic cells. Cellular Microbiology. 2 (1), 59-68 (2000).
  7. Shreedhar, V. K., Kelsall, B. L., Neutra, M. R. Cholera toxin induces migration of dendritic cells from the subepithelial dome region to T- and B-cell areas of Peyer’s patches. Infection and Immunity. 71 (1), 504-509 (2003).
  8. Sato, A., Iwasaki, A. Peyer’s patch dendritic cells as regulators of mucosal adaptive immunity. Cellular and Molecular Life Sciences. 62 (12), 1333-1338 (2005).
  9. Bemark, M., Boysen, P., Lycke, N. Y. Induction of gut IgA production through T cell-dependent and T cell-independent pathways. Annals of the New York Academy of Sciences. 1247 (1), 97-116 (2012).
  10. Fagarasan, S., Kawamoto, S., Kanagawa, O., Suzuki, K. Adaptive Immune Regulation in the Gut: T Cell-Dependent and T Cell-Independent IgA Synthesis. Annual Review of Immunology. 28, 243-273 (2010).
  11. Hase, K., et al. Uptake through glycoprotein 2 of FimH + bacteria by M cells initiates mucosal immune response. Nature. 462 (7270), 226-230 (2009).
  12. Wu, H., et al. An Inhibitory Role for the Transcription Factor Stat3 in Controlling IL-4 and Bcl6 Expression in Follicular Helper T Cells. Journal of Immunology. 195 (5), 2080-2089 (2015).
  13. Vinuesa, C. G., Tangye, S. G., Moser, B., Mackay, C. R. Follicular B helper T cells in antibody responses and autoimmunity. Nature Reviews Immunology. 5 (11), 853-865 (2005).
  14. Victora, G. D., Nussenzweig, M. C. Germinal Centers. Annual Review of Immunology. 30, 429-457 (2012).
  15. Vaeth, M., et al. Store-Operated Ca2+Entry in Follicular T Cells Controls Humoral Immune Responses and Autoimmunity. Immunity. 44 (6), 1350-1364 (2016).
  16. Meli, A. P., et al. The Integrin LFA-1 Controls T Follicular Helper Cell Generation and Maintenance. Immunity. 45 (4), 831-846 (2016).
  17. Fu, W., et al. Deficiency in T follicular regulatory cells promotes autoimmunity. Journal of Experimental Medicine. 215 (3), 815-825 (2018).
  18. Espéli, M., Walker, J. M. . T follicular helper cells – Methods and Protocols. , (2015).
  19. Couter, C. J., Surana, N. K. Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes. Journal of Visual Experiments. (111), e54114 (2016).
  20. De Jesus, M., Ahlawat, S., Mantis, N. J. Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer’s Patches. Journal of Visual Experiments. (73), e50167 (2013).
  21. Pastori, C., Lopalco, L. Isolation and in vitro Activation of Mouse Peyer’s Patch Cells from Small Intestine Tissue. Bio-protocol. 4 (21), e1282 (2014).
  22. Fukuda, S., Hase, K., Ohno, H. Application of a Mouse Ligated Peyer’s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells. Journal of Visual Experiments. (58), 3225 (2011).
  23. Naito, Y., et al. Germinal Center Marker GL7 Probes Activation-Dependent Repression of N-Glycolylneuraminic Acid, a Sialic Acid Species Involved in the Negative Modulation of B-Cell Activation. Molecular and Cellular Biology. 27 (8), 3008-3022 (2007).
  24. Bollig, N., et al. Transcription factor {IRF4} determines germinal center formation through follicular T-helper cell differentiation. Proceedings of the National Academy of Science of U. S. A. 109 (22), 8664-8669 (2012).
  25. Pérez-Mazliah, D., et al. Follicular Helper T Cells are Essential for the Elimination of Plasmodium Infection. EBioMedicine. 24, 216-230 (2017).
  26. Sage, P. T., Sharpe, A. H. T follicular regulatory cells in the regulation of B cell responses. Trends Immunology. 36 (7), 410-418 (2015).
  27. Van Damme, N., et al. Chemical agents and enzymes used for the extraction of gut lymphocytes influence flow cytometric detection of T cell surface markers. Journal of Immunological Methods. 236 (1-2), 27-35 (2000).
  28. Meenan, J., et al. Altered expression of alpha 4 beta 7, a gut homing integrin, by circulating and mucosal T cells in colonic mucosal inflammation. Gut. 40 (2), 241-246 (1997).
  29. Cao, A. T., et al. Interleukin (IL) -21 promotes intestinal IgA response to microbiota. Mucosal Immunology. 8 (5), 1072-1082 (2015).
  30. Wei, J., et al. Autophagy enforces functional integrity of regulatory T cells by coupling environmental cues and metabolic homeostasis. Nature Immunology. 17 (3), 277-285 (2016).
  31. Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function. European Journal of Microbiology & Immunology. 2 (2), 112-120 (2012).
  32. Trapecar, M., et al. An Optimized and Validated Method for Isolation and Characterization of Lymphocytes from HIV+ Human Gut Biopsies. AIDS Research and Human Retroviruses. 33 (S1), (2017).
  33. Bergqvist, P., Gardby, E., Stensson, A., Bemark, M., Lycke, N. Y. Gut IgA Class Switch Recombination in the Absence of CD40 Does Not Occur in the Lamina Propria and Is Independent of Germinal Centers. Journal of Immunology. 177 (11), 7772-7783 (2006).
  34. Keil, B., Gilles, A. M., Lecroisey, A., Hurion, N., Tong, N. T. Specificity of collagenase from Achromobacter iophagus. FEBS Letters. 56 (2), 292-296 (1975).
  35. Mora, J. R., et al. Selective imprinting of gut-homing T cells by Peyer’s patch dendritic cells. Nature. 424 (6944), 88-93 (2003).
  36. Reboldi, A., et al. Mucosal immunology: IgA production requires B cell interaction with subepithelial dendritic cells in Peyer’s patches. Science. 352 (6287), (2016).

Play Video

Cite This Article
Yazicioglu, Y. F., Aksoylar, H. I., Pal, R., Patsoukis, N., Boussiotis, V. A. Unraveling Key Players of Humoral Immunity: Advanced and Optimized Lymphocyte Isolation Protocol from Murine Peyer’s Patches. J. Vis. Exp. (141), e58490, doi:10.3791/58490 (2018).

View Video