Summary
이 연구에서는 선물이 고 림프 톨의 격리에 대 한 효율적인 프로토콜 Peyer의 패치 (PPs), 사용할 수 있습니다 이후 follicular T의 흐름 cytometric 학문 뿐만 아니라 vivo에서 그리고 생체 외에서 기능적 분석 실험에서 도우미 고 어린 싹 센터 B 세포입니다.
Abstract
창 자 점 막에 면역 세포 병원 균에 대 한 면역 방어를 동시에 부여 하는 동안 면역 관용을 승진 시키는 독특한 면역 엔티티를 구성 합니다. 잘 설립 Peyer의 패치 (조달 청) 여러 이펙터 T와 B 세포의 하위 집합을 개최 하 여 점 막 면역 네트워크에 필수적인 역할을 했습니다. 이러한 이펙터 셀, follicular T 도우미 (TFH) 및 본 원 센터 (GC) B 세포의 특정 분수는 독립적일 체액 성 면역의 규칙에서. 따라서, 그들의 차별화 프로그램 및 기능 속성을 조달 청에 내에서 이러한 셀 하위 특성 점 막 면역에 대 한 중요 한 정보를 제공할 수 있습니다. 이 위해 조달 청에서 림프 구 분리는 쉽게 적용, 효율적이 고 재현 방법 연구에 귀중 한 것입니다. 이 연구에서 우리가 높은 셀 수익률 마우스 조달 청에서 세포를 분리 하는 효과적인 방법 생성 목적입니다. 우리의 접근 공개 소화 시 약 및 조직 동요의 사용과 같은 처리 하는 초기 조직으로 세포 얼룩 조건 및 항 체 패널의 선택, 품질 및 고립 된 림프 톨의 정체성에 큰 영향력을가지고 실험 한 결과
여기, 우리가 효율적으로 재현 흐름 cytometry 기반 평가 TFH와 GC B 세포 하위 집합에 초점을 주로 하는 T와 B 세포 하위 집합을 허용 하는 조달 청에서 림프 구 인구를 분리 하는 연구자를 사용 하는 프로토콜을 설명 합니다.
Introduction
끝에 처음부터 전체 위 장관 이상 어떤 다른 인간의 기관 및 마우스1면역 세포를 포함 하는 광범위 한 림프 네트워크와 갑판입니다. 파이어의 패치 (조달 청)이 세포 면역 조직, 소위 창 자 연관 된 림프 조직 (GALT)2,3장 분기의 주요 구성 요소를 구성. 조달 청, 항 원 식이 자료에서 파생 된의 수백만의 수천에서 공생 microbiota 및 병원 체, 샘플링 되 고 그들을 향해 필요한 적절 한 면역 반응 탑재 따라서 유지 장 면역 항상성입니다. 그런 의미에서 조달 청 "편도 소장"으로 라는 수 있습니다. 조달 청 주요 하위 구획의 구성: subepithelial은 돔 (SED) 큰 B-세포 뿌리 영역; overlying 뿌리 관련 상피 (FAE) 및 interfollicular 지역 (IFR) T 세포는 위치4. 따라서, 조달 청 협조, 가능 하 게 다른 이펙터 셀 하위 집합의이 독특한 서 용기에서 immunocompetence를 수 여.
조달 청 부족 입성 lymphatics, 그리고 이런이 이유로 인해 항 소장에서 조달 청에 이송 하지 실시 되 고 다른 림프 기관의 대부분과 달리 림프 혈관을 통해. 대신, FAE, 소위 M 세포에에서 위치한 전문된 상피 세포는 luminal 항 조달 청5에 전송 합니다. 그 후, 수송된 항 원에 의해 선택 모 수석 세포 (DCs) 및 FAE6,7아래 subepithelial 돔 (SED) 지역에 있는 식 세포. Dc는 PP에이 항 원 정렬 과정은 적합 한 면역 반응8 및 IgA 은닉 세포9의 후속 세대를 시작 중요 합니다.
공생 식물과 식이 자료 항 원 부담 때문 PPs 호스트 endogenously 활성화 이펙터 T TFH 그리고이+ 가 GC B 세포10, 같은 훌륭한 나타났는데 하위 집합 B 세포 조달 청 활성 면역의 사이트 대표 제안 응답11. 최대 20-25%의 총 CD4 내의 TFH 셀+ T 세포 구획 및 최대 10-15% 총 B 세포 내에서 GC B 세포 이다 unimmunized 젊은 C57BL/6 마우스12에서 수집 하는 조달 청에서 가능 하다. 달리 다른 T 조 수 세포 유형 (즉., Th1, Th2, Th17 세포), TFH 셀 CXCL13 그라데이션13따라 TFH 셀 유도 승진 시키는 CXCR5 식 때문에 주로 B 세포 모 낭에 독특한 차 있는 굴곡 운동 표시. 조달 청의 B 세포 뿌리 영역에서 TFH 셀이 종류 스위치 재결합 및 활성화 된 B 세포에서 높은 선호도 생산 하는가 세포 분화14에 신체적인 hypermutation 유도. 그 후, 이러한 항 체 은닉 플라스마 세포 lamina propria (LP)에 이주 하 고 용기10면역 항상성 조절.
식별 및 조달 청 내 TFH와 GC B 세포 인구의 체액 면역 반응 시간이 걸리는 면역 모델의 필요 없이 정상 상태 조건 하에서 역학 조사 연구원 사용 수 있습니다. 전통적으로 TFH GC B 세포 연구15,,1617,18에 사용. 조달 청 내의 TFH 셀 분석 다른 셀의 하위 집합으로 간단 하지 않습니다. 기술 과제 포함 식별 이상적인 조직 준비 상태, 표면 항 체-마커 조합으로 적절 한 긍정적이 고 부정적인 컨트롤을 선택 합니다. TFH 그리고 PP 연구 분야 실험 절차의 측면에서 큰 다양성을 전시 하 고 부여 하는 여러 가지 이유로 인해 표준화 된 프로토콜을 설정 하는 합의. 첫째, 조달 청 내 각 세포 부분 집합 차동 조직 준비 조건 추가 셀 집합 특정 방식으로 수정 요구에 의해 영향을 받을 경향이 있다. 둘째, 조달 세 번째, 이상적인 조직 준비 기술 및 실험 조건 조사 프로토콜 기반 비교 연구의 수에서 셀 준비의 세부 사항에 관한 보고 방법 중에서 중요 한 차이가 있다 PP와 TFH 연구 다소 제한 됩니다.
현재 프로토콜 기반 연구 PP 셀 준비19,20,21,22 에 대 한 제안 TFH-또는 GC B 세포 지향 되지 않았습니다. 또한, 콜라 기반 소화 등 조달 청19,20 대 한 권장 일부 조직 준비 조건 cytometry에 의해 TFH 식별의 결과 부정적인 영향을 발견 했다18. 이 기초에, 우리는 최적화 된, 표준화 되 고 재현 가능한 프로토콜 TFH 조달 청 내에서 GC B 세포 역학을 공부 하는 데 사용할 수 있는이 주제에 수 사관을 가치가 있을 것 이라고 권유. 이 필요는 우리에 게 격리 및 정밀 하 게 세포 복구, 생존, 그리고 여러 T와 B의 흐름 cytometric 특성에 대 한 효율을 위해 최적화 된 PP 세포의 특성에 대 한 향상 및 최신 프로토콜을 생성 하는 원동력 셀의 하위 집합입니다. 우리는 또한 이전 프로토콜에 따라서, 제안 하는 여러 힘 드는 준비 단계를 제외 하 필요한 조작 및 조달 청에서 조직 및 세포 준비를 위한 시간을 줄이는 목적입니다.
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Protocol
모든 연구 및이 프로토콜에서 설명 하는 실험 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 베스 이스라엘 여자 집사 의료 센터의 지침에 따라 실시 했다.
1. 설계 실험 설정 및 마우스 그룹
- (선택 사항) 공동 실험 쥐 실험 쥐 사이의 본질적인 microbiota의 수평 전송을 촉진 하 고 PP 세포 내에서 일반적인 다양성을 줄이기 위해 집. 또한, 같은 성별의 littermate 컨트롤을 사용 하 여 변화를 최소화 하기 위해.
2. 외과 절단, 조직 준비 단계:
- 작은 창 자 (SI)의 외과 제거
- CO2 질 식 또는 기관 동물 윤리 위원회에 의해 승인 된 모든 해당 메서드를 사용 하 여 마우스를 안락사
- 외과 절단에 대 한 전용된 영역에 마우스를 전송 합니다. 아래 뒷면을 놓고 70% 에탄올과 복 부를 청소 합니다. 복 부 피부와 복 막 액에서 따라서 복 막 구멍을 열고 흉 곽에 중간 선 따라 절단 하 여는 개복 술을 수행 합니다.
참고: 복 막 구멍을 관통 하 고 장 조직 손상 방지에 피부의 비교적 작은 영역에 첫 번째 절 개를 수행 합니다. 계속 원하는 해 부 경계까지 절단. - 작은 창 자의 원심 세그먼트 구성 터미널 회장의 검출을 위한 이상적인 랜드마크 caecum을 식별 합니다.
참고: Caecum는 마우스 복 부의 왼쪽 아래에 있습니다 일반적으로. - Ileocaecal 접점을 파악 하 고이 수준에서 절단은 caecum 소장 구분 가능한 원심. 다음 단계에 걸쳐 연약한 PPs 터치 시 쉽게 붕괴 때문에 창 자 벽과 과도 한 신체 접촉을 피하십시오.
- 가 위를 사용 하 여 mesentery를 절단 하 여 전체 소장 pyloric 괄약근까지 부드럽게 제거 합니다. Pylorus 십이지, 사이 연결을 식별 하 고이 수준에서 소장 복 부 구멍에서의 분리를 완료로 이어질 것입니다 십이지를 싹 둑.
참고: (i) 하이퍼 확장으로 피하이장 벽의 파열을 발생할 수 있습니다. (ii) mesenteric 지방의 완전 한 제거는 필요 LP 림프 구 분리 PP 세포 이외에 필요한 경우. 그러나, PP 격리에 대 한 mesenteric 지방 남은 수 혜택을 제공할 몇 가지 추가 격리 단계; 따라서, 그것은 해야 합니다 유지. - 6 잘 플레이트 가득 찬 RPMI + 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)에 분리 소장을 배치 하 고 부드럽게 선동 조직 수동으로 모든 장 세그먼트 차가운 미디어에 잠긴 때까지. 다음 단계에 걸쳐 얼음에 조직 유지 합니다.
- 원하는 마우스 소장 수 해 부, 후 수집 된 작은 창 자에서 PP 절단을 진행 합니다.
- 조달 청 및 단일 세포 현 탁 액의 준비의 외과 절단:
- 부드럽게 종이 타월에 집게를 사용 하 여 mesenteric 지방 창과 작은 창 자 전송 및 종이 타월에 직면 mesenteric 측면 장소. 축 찬 RPMI + 10% 전체 장 세그먼트 FBS 조직 탈수와 끈 적 거 림을 피하기 위해.
참고: 시의 mesenteric 사이트에 지방 조직 세그먼트 위로 향하도록 반 mesenteric 사이트를 유지 하는 종이 타월에 충실 하기 때문에이 단계에서 도움이 될 수 mesenteric 지방에 남아 있는. - 조달 청, 창 자 벽의 안티 mesenteric 측에 "콜리플라워 같은" 형태로 화이트 멀티 lobulated 집계로 표시 되는 확인 합니다.
참고: 모든 조달 청 excised 됩니다 때까지 플러싱 luminal 콘텐츠 권장 하지 않습니다. 비우는 luminal 콘텐츠는 조달 청의 붕괴를 발생할 수 있습니다 하 고 조달 청 조달 청의 시각적 식별에 매우 도움이 되는 장벽 사이의 색상 명암을 막을 것 이다. - 확인 후 조달 청 안티 mesenteric 측에, 위 수술 끝 곡선가 위 조달 청 (곡선 해야 얼굴)의 말 초 및 인접 국경에서 PP를 억제.
선택 사항: PP가 위 손가락을 사용 하 여 블레이드를 향해 부드럽게 밀어. 이 책략 주변의 비 PP 조직은 더 나은 배제 이어질 것입니다. 소비 세는 조달 청 부드럽게, 주변 장 조직을 제외.
참고: (i)이이 단계는 등 LP 장 상피 세포, T 세포에 풍부도 장의 구획을 이웃 셀 오염 최소화 하면서 최대한 PP 셀 수율을 얻기 위해 중요 한. (ii)에서 한 시 C57BL/6 마우스에서 excised, 5-10 조달 청 (평균 크기, 다중 lobulated)를 수집할 수 있습니다. 심지어 작은 PPs (멀티 lobulated)의 컬렉션을 최대 목표로 하 여 마우스 (C57BL/6) 당 12 월 13 일 조달 청이이 프로토콜을 사용 하 여 가능 하다. - 전송 삭제 조달 청 12 음 조직 문화 접시에 가득 차가운 RPMI + 10 %FBS 유지에 얼음 집게 또는 곡선된 수술가 위를 사용 하 여.
참고: (i) 조달 청의 절단, 직후 점액과 PP 표면에 장의 내용을 정리할 수 있습니다 종이 타월에 조직을 부드럽게 문질러. 이 단계는 PP 세포의 생존 능력을 개선 하는 데 도움이 됩니다. (ii) 조달 청 접시에 전송의 대신 튜브를 분리 전송 여겨질 수 있다 또한 총 샘플 수에 따라. - 선택 사항: PP 절단 및 잘 플레이트에 후속 배치 완료 되 면 수와 다른 실험/마우스 그룹에서 수집 하는 조달 청의 크기 수 문서화 조달 청을 포함 하는 조직 문화 접시의 그림을 복용 함으로써.
- 가득한 RPMI + 10%의 25 mL 50 mL 원뿔 관의 세트를 준비 FBS (37 ° C에서 미리 예 열). 1 mL 피 펫와 조달 청의 열망 하면 거리에서 1000 µ L 팁의 가장자리를 잘라가 위를 사용 하 여. 1 mL 피 펫으로 PPs를 발음 하 고 준비 된 50 mL 원뿔 튜브를 12 음 조직 배양 접시에서 그들을 전송.
참고: 샘플 중 상호 오염을 피하기 위해 각 마우스 샘플에 대 한 새로운 팁을 사용 합니다. - 뚜껑을 장악 하 고 10 분 125-150 rpm에서 지속적인 동요와 37 ° C에서 궤도 통에 튜브를 수직으로 배치. 한편, 50 mL 튜브의 새로운 세트를 준비 하 고 각 관,이 통해 단일 세포 현 탁 액 준비 됩니다 정상 40 µ m 셀 스 트레이너를 배치.
참고:는 PP 세포의 회복과 세포 생존 능력을 감소 하지 않을 경우 제거 (i) 동요 단계 나머지 장 콘텐츠, 점액과 세포 파편을 제거 합니다. (소화 과정 세포 표면에서 CXCR5 식의 극적인 손실 때문에 PP 조직에 소화 효소의 어떤 종류를 적용 되지 않습니다 ii). - 동요, 후 40 µ m 셀 스 트레이너 새로 준비 원뿔 50 mL 튜브 상단에 배치 하는 조달 청을 전송 합니다. 부드럽게 10 mL 주사기 플런저의 둥근된 쪽을 사용 하 여 단일 세포 현 탁 액을 생성 하 셀 스 트레이너를 통해 조달 청을 중단. 린스 차가운 RPMI + 10%의 15-20 mL와 여과기 FBS.
참고: (i) 하기 전에 필터링, 가로로 조달 청을 포함 하는 튜브를 흔들. 이 짧은 동요 셀 멤브레인으로 조달 청의 전송을 촉진 한다. (ii)를 사용 하 여 70 µ m 셀 스 트레이너 비 림프 면역 세포의 고립에 대 한 (예., monocytes, 대 식 세포, Dc) 것이 좋습니다. - 단일 셀 정지 4 ° c.에서 10 분 동안 350-400 x g에서 원심
- 신중 하 게 삭제는 상쾌한 고 10 x 106 셀/mL의 농도에서 세포를 resuspend. hemocytometer를 사용 하 여 셀을 계산 합니다.
참고: (i) 셀 계산 하기 전에 각 마우스 PP 그룹에 대 한 총 셀 수 예상할 수 있는 대략 다음과 같은 수식을 사용 하 여: "0.5-1 x 106 셀 (조달 청의 수) x 총 세포 수 =". Trypan 블루 셀 카운팅을 위한와 더 희석 할 수도 있습니다. (ii)을 수동 계산 하는 대신으로 자동된 셀 카운터를 사용할 수 있습니다. - 2-2.5 x 106 셀에 적절 한 볼륨을 전송 (예., 200 µ L) 96-잘 라운드-하단 플레이트에.
참고: 단일 색상 및 부정적인 컨트롤 샘플, 0.5-1 x 106 세포 수 있습니다 충분. - 4 ° c.에서 5 분 동안 350 x g에서 격판덮개 원심 접시를 터치 합니다.
- 워시 얼룩 버퍼의 200 µ L에 셀.
- 부드럽게 종이 타월에 집게를 사용 하 여 mesenteric 지방 창과 작은 창 자 전송 및 종이 타월에 직면 mesenteric 측면 장소. 축 찬 RPMI + 10% 전체 장 세그먼트 FBS 조직 탈수와 끈 적 거 림을 피하기 위해.
3. 표면 항 체 얼룩이 지기
- 생존 얼룩:
- 최종 세척 후 PBS (1:1, 000)에 희석 고칠 수 생존 염료의 100 μ 셀 resuspend. 얼음에 또는 어둠 속에서 4 ° C에서 30 분 동안 품 어.
참고: 키 전사의 탐지를 위해 (i) 세포내 얼룩 Foxp3 같은 요인 또는 Bcl-6 셀의 고정을 필요 합니다. 이 경우 고칠 수 비 생존 염료 (예., 7-AAD, DAPI) 사용할 수 없습니다. (ii)를 고칠 수 생존 염료 희석, 단백질을 포함 하는 어떤 얼룩 버퍼를 사용 하지 마십시오. 이 단계에 사용 된 미디어는 단백질 무료 여야 합니다. (iii) 제외 생존 얼룩을 사용 하 여 죽은 세포의 죽은 세포 흐름 cytometry 분석 autofluorescence를 방출 하 여, nonspecifically, 표면 항 체를 바인딩하여 false로 이어질 수 있는 심각한 기술적인 문제가 발생할 수 있습니다 때문에 결정적 이다 긍정적인 결과입니다. - 두 번 버퍼를 얼룩과 세포를 씻어. 4 ° c.에서 5 분 동안 350 x g에서 원심 분리기 접시를 터치 합니다.
- 최종 세척 후 PBS (1:1, 000)에 희석 고칠 수 생존 염료의 100 μ 셀 resuspend. 얼음에 또는 어둠 속에서 4 ° C에서 30 분 동안 품 어.
- Fc 블록 및 표면-i: 레이어
- 버퍼를 얼룩이 지기에서 안티-CD16/32 항 체 (1: 200)을 diluting 하 여 Fc 블록 솔루션을 준비 합니다.
- 준비 된 Fc 블록 솔루션의 20 μ 셀 resuspend 얼음에 15 분 동안 품 어.
- 세척, 없이 표면 항 체 칵테일의 80 μ 적절 한 희석에 준비 (항 체 요약 표 1 참조)를 추가 합니다. 적어도 30 분 동안 얼음에 품 어.
- 과도 한 착 색 버퍼를 추가 하 여 두 번 세척. 4 ° c.에서 5 분 동안 350 x g에서 원심 분리기 접시를 터치 합니다.
- 표면-레이어 II:
- 얼룩 버퍼에 형광 색소 활용 된 Streptavidin diluting 하 여 Streptavidin 얼룩 솔루션을 준비 합니다.
- 최종 세척 후 얼룩이 솔루션 사전 희석된 Streptavidin (1: 100)의 100 μ 셀 resuspend. 어둠 속에서 얼음에 적어도 15 분 동안 품 어.
- 두 번 버퍼를 얼룩과 워시. 4 ° c.에서 5 분 동안 350 x g에서 원심 분리기 접시를 터치 합니다.
선택 사항: follicular 규제 T 세포 검출을 위해 얼룩이 지는 세포내가 적절 하지, 마지막 세척 후 얼룩이 버퍼와 교류 cytometer에서 데이터를 얻기 위해 적절 한 튜브로 전송의 200 μ 셀 resuspend. 샘플은 고정 되어 있지 않으며 때 cytometry 데이터의 수집 정확한 결과 얻기 위해 3-4 시간 내에서 수행 되어야 한다.
4. 셀 고정
- 고정/permeabilization (수정/파 마) 작업 솔루션 Foxp3/녹음 방송 요인 얼룩 버퍼 설정에서 시 약을 사용 하 여 준비 합니다. 고정/permeabilization 원하는 최종 볼륨을 희석제의 세 부분을 고정/permeabilization의 한 부분 집중을 믹스.
- 최종 세척 후 수정/파 마 작업 솔루션의 200 μ 셀 resuspend.
- 20 분 동안 4 ° C 또는 얼음에 플레이트를 품 어. 이 단계에 대 일 분을 초과 하지 마십시오. 장시간 보육 심각 셀 복구를 줄일 수 있습니다.
- 4 ° c.에서 5 분 동안 350 x g에서 원심 분리기 접시를 터치 합니다. (옵션) 이 단계 후 고정된 세포 얼룩 소 혈 청 알 부 민 (BSA)를 포함 하는 버퍼에 4 ° C에서 며칠 동안 저장 될 수 있다 또는 FBS 후속 세포내 얼룩 또는 흐름 cytometry 인수까지.
- Permeabilization 버퍼 갓 순화 이온된 수에 미리 희석 (x1)의 200 μ 셀 resuspend
- 실 온 (RT)에서 5 분 동안 350 x g에서 원심.
- Permeabilization 버퍼 및 실시간에 5 분 동안 350 x g에서 원심 분리기의 200 μ로 한 번 씻어
5. 세포내 얼룩
- Permeabilization 버퍼에 안티-CD16/32 항 체 (1: 200)을 diluting 하 여 Fc 블록 솔루션을 준비 합니다.
참고: 고정 단계 후 셀 유지 되어야 합니다 permeabilization 버퍼에 세포내 착 과정의 끝까지. - 최종 세척 후 Fc 블록 솔루션의 20 μ 셀 resuspend. 어둠 속에서 RT에서 10-15 분 동안 품 어.
- 세척, 없이 세포내 항 체 칵테일 (100 μ 최종 볼륨) permeabilization 버퍼에 미리 희석의 80 μ를 추가 합니다. 실시간에서 30 분 동안 품 어
- 실시간에서 5 분 동안 350 x g에서 페름 버퍼, 그리고 원심 분리기의 100 μ를 추가
- Permeabilization 버퍼의 200 μ로 한 번 씻어, 실시간에서 5 분 동안 350 x g에서 원심
- 최종 세척 후 얼룩이 버퍼의 200 μ 셀 resuspend 하 고 적절 한 튜브 (착 색 버퍼에 400 μ의 최종 볼륨)로 셀 전송 cytometry로 데이터를 수집. 96 잘 접시에 묻은 샘플 튜브 플레이트 리더 옵션 교류 cytometer 사용할 수 있는 경우 전송 없이 실행할 수 있습니다. 이 단계는 셀 전송 하는 동안 셀 손실을 최소화합니다.
- 5 x 105 총 셀 흐름 cytometer TFH, TFR의 재현성 분석을 수행할 수의 최소를 취득 뿐만 아니라 GC B 세포.
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Representative Results
이전 프로토콜20, 달리 우리 조달 청 시에 걸쳐 균등 하 게 배포 되지 않은 그러나 더 조밀 하 게 SI의 원심 및 인접 하는 끝을 향해 지역화와 같이 관찰 그림 1A. 흐름 cytometric 분석, 정확 하 게 따라 하는 경우 우리의 프로토콜 PP 림프 구 인구는 앞으로 사이드 분산형 배포 splenocytes (그림 2AE, 및 2D, H)와 비슷한 게 나타났다 > 95% 셀 생존 능력 (그림 2B 와 2 층) 다른 2 차 림프 기관 (Slo), 달리 C57BL/6 쥐에 총 PP 림프 톨의 약 70-80% 구성 B 세포, 반면 CD4+ T 세포 구성 (그림 2C 와 2 세대) 총 PP 세포의 단지 10-15%.
참고로 그 CD4+ CD19+ 더블 긍정적인 (DP) 세포 구성 ≈ 총 PP 세포의 1%. B 세포의 Fc 수용 체에 대 한 Fc-블록을 수행 하 고 남자, CD4 제외 등 셀 준비 하는 동안 특정 주의와+ CD19+ DP 셀 인구 수 (그림 3A , B)를 최소화. 그러나, 남자의 앞으로 분산형 (FSC) 특성을 입증 하지 않는 DPs의 일부분은 피할 수 및 단 하나 긍정적인 T와 B 세포 성문에서 밖으로 문이 한다 (그림 3B). 우리의 결과 DP 셀 내에서 B 세포 거짓 긍정적인 결과 TFH 게이트는 조정으로 이어질 수 있는 그들의 표면 (그림 3C)에 매우 빠른 CXCR5 CD4에 CXCR5 식에 따라 공개+ T 세포. 다른 한편으로, 우리가 발견 GL7, 활성화 된 B 세포의 표식 CD4 표현 또한 된다+ CD19+ DP 셀 (그림 3D), 는 GC B 세포 게이팅 방해가 발생할 수 있습니다.
알고리즘 게이팅 TFH과 GC B 세포의 예는 그림 4. 에 묘사 된 GL7 라벨 CD38, GL7으로 GC B 세포를 식별 하는 대 우리 사용 GC B 세포 게이팅,+ CD38- B 세포 (그림 4A-B). 반면 CD38 다음 마커 중 하나에 의해 대체 될 수 있다 GL723 대신 사용 PNA 라벨: IgD, Bcl-6, 그리고 CD95. 대체 GC B 세포에서 시연에 대 한 전략을 게이팅 그림 S1. 조달 청에서 GC B 세포 비율 C57BL/6 마우스의 큰 변화를 보여줍니다. 그러나 조달 청, 다른 Slo에 비해 상당히 높은 GC B 세포 비율을 정상 상태 조건 하에서 총 B 세포의 2-10%의 범위를, 있다. CD19로 설명 PP TFH 셀에 대 한 전략을 게이팅- CD4+ PD-1안녕하세요 CXCR5+ T 세포 (그림 4A, C). "얼룩말 플롯" TFH 게이팅 PD-1안녕하세요 인구 더 몰래 다른 플롯 유형 (그림 4C)에 비해 묘사로 대 한 최적의 데모 방법으로 발견 되었다. TFR, Foxp3, 표현 TFH 셀의 하위 집합으로 CD19 문이- CD4+ PD-1안녕하세요 CXCR5+ Foxp3+ T 세포 (그림 4D). GC B 세포 처럼 TFH 셀 분수 또한 unimmunized 마우스 개인 총 CD19의 10-20%의 범위에서 변화 한다- CD4+ PP 림프 톨. 그림 4E, F에 그림 S1C, D. TFH 셀에 대 한 대체 제어 알고리즘의 세부 사항 설명
거짓 양성 배경 얼룩 및 autofluorescence를 방지 하려면 isotype 컨트롤 또는 대체 해당 컨트롤 같은 형광 마이너스 1 (FMO)에 포함 되어야 얼룩 패널 TFH와 GC B 세포 마커 ( 에 대 한 부정적인 제어로 그림 4G-J).
PP 조직 준비에 대 한 조건을 최적화 하려면 우리 전략을 개발 소설 내부적으로 제어 실험, 조달 청 한 개별 마우스에서 수집 된와 그들의 해부학 적 근원에 따라 별도로 풀링 (예., 십이지 장, ileal). 실험을 수행, 풀링된 PPs는 각 실험 개별 그룹에 할당 된 및 제어 그룹 (그림 5A) 각 해 부 지역에서 조달 청의 동일한 수를 포함. 이 접근 방식에 의해 우리가 발견 그 콜라 기반 효소 소화 (소화 믹스의 25 mL 당 콜라의 37.5 mg에서 II 또는 IV 테스트 = 1.5 mg/mL), 다양 한 점 막 조직, 크게 감소 CXCR5에서에서 림프 구 분리에 일반적으로 사용 되는 PP 세포 (그림 5B), 특히 TFH 셀에에서 식 (그림 5 층-난), 동안 다른 표면 분자의 표현을 (예., CD19, CD4) 그대로 (그림 5 C-E)에 남아 있었다. 콜라 취급 TFH 셀에 CXCR5의 식 isotype 컨트롤에서 거의 구별할 수 없었다 그래야 감소 CXCR5 검출의 유명 했다 (그림 5 층-난). 추가 실험 보여주었다 CXCR5 식 효소 소화의 간섭 레벨 (그림 6A-F) CXCR5 항 체 복제 사용에 의존 했다. 특히, 콜라 2 차 치료 시 CXCR5 항 체 클론 2G 8의 탐지 능력 (그림 6A-D)에 CXCR5 항 체 클론 L138D7의 탐지의 용량 보다 더 크게 손상 했다.
효소 소화 CXCR5의 표현 뿐만 아니라 앞으로 전시 소화 조달 청 측에서 분리 하는 세포의 상당한 부분 동안, FSC-SSC 특성에 의해 결정 된 PP 세포 내 총 림프 톨의 비율 감소 PP 세포 보다 더 높은 강도의 분산 (그림 7A-C). 셀 복구에 콜라의 효과 복용량-의존 방식 (그림 7A, H-J)발생 했습니다. 효소 소화 (그림 7D, E)세포 생존 능력을 증가. 그러나,이 혜택은 causatively에 연결 되지 않은 콜라 소화 콜라 없이 동요 후 조달 청에서 분리 된 셀 마찬가지로 선호 했다 때문에 (그림 7 층). 핵 녹음 방송 요인 Foxp3, TFH 절연 TFR 셀을 식별 하는 동안 일반적으로 평가 하기 때문에 여기에 특정 관심의 이다, 감지 콜라 소화 (그림 7G에 37 ° C에서 동요에 의해 개량 되었다 ).
그림 1: 거시적인 구조와 해부학 murine Peyer의 패치 배포. (A). 위장과 소장의 십이지 장 끝에서 얻은 이미지. 두 개의 밀접 하 게 위치한 PPs 십이지 장 검은 화살표와 함께 표시 됩니다. (B). 조달 청 11 C57BL/6 쥐에서 수집한 12 잘 판에 개별적으로 저장 된. (C). 갓 삭제 마우스 조달 청 40 µ m 셀 스 트레이너에 표시의 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 흐름 cytometric 특성화 및 PP 세포에 대 한 기본 제어 알고리즘. (A). 점 작 설명 (D)에 묘사 된 splenocytes 큰 유사성을 전시 하는 FSC 그리고 SSC 축 따라 갓 절연된 고정 되지 않은 PP 세포의 분포. (B). 7AAD 식을 통해 죽은 세포의 배제. 7AAD- 셀 라이브 셀을 나타냅니다. (C). CD19 및 중 T와 B 세포의 CD4 기반 immunophenotyping 미리 라이브 PP 셀 문이. (E-G)입니다. 고정된 PP 세포의 대표적인 흐름 분석입니다. (H). 고정된 splenocytes의 대표적인 흐름 특성. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: CD4+ CD19+ 더블 긍정적인 (DP) 세포 원인 TFH와 GC B 세포 게이팅에 거짓 양성. (A). CD4+CD19+ DP 라이브 PP 세포 내 림프 톨을 보여 줍니다. (B). 분리의 DP 셀 남자와 singlets FSC 특성에 따라. (C,D). CXCR5 및 GL7 식 DP 셀의 히스토그램 플롯에 묘사 된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 대표 TFH 그리고 GC B 세포 제어 전략. 조달 청 3 달 오래 된 마우스에서 수집 된 고 세포 프로토콜 섹션에 설명 된 대로 고립 되었다. (A) CD19와 CD4 림프 톨 PP 라이브의 라벨 표시 됩니다. (B) CD38lo GL7안녕하세요CD19+ B 세포 GC B 세포로 문이 되었다. (C) TFH 셀 CXCR5로 문이 했다+PD-1안녕하세요 CD4+ 세포. (D) TFR 셀 TFH 마커 함께 규제 셀 특정 전사 인자 Foxp3 표현 TFH 셀의 일부 이며 CXCR5로 문이+ PD-1안녕하세요 Foxp3+ CD4+ T 세포. (E-F) 전략 TFH 위한 게이팅 표면 마커 splenocytes에서 확인 NP-OVA-예방 접종을 마우스에서 BCL-6 식에 의하여 절연 되어 있습니다. (G-J) 형광-1 (FMO) 컨트롤 키 TFH TFR 및 GC 셀 표식에 대 한 묘사 된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: 콜라 기반 효소 소화 CXCR5 탐지의 거 대 한 감소에 지도. 십이지 장 (≈ 1/3 근), 공장에에서 있는 2 개월 마우스에서 (A) 조달 청 (≈ 1/3 중간) 및 회장 (≈ 1/3 원심) 수집 되었고 별도로 풀링된. 풀링된 PPs는 실험적인 그룹에 동등 하 게 배 부 되었다. II 또는 IV 콜라 1.5 mg/mL 농도에서 효소 소화 37 ° c.에서 10 분 동안 동요와 함께 수행한 (B-E) 히스토그램 플롯 콜라 기반 소화를 조달 청에서 분리 된 세포 표면 분자 (CXCR5, CD19, PD-1, CD4)의 식을 묘사 합니다. (F-난) TFH 게이팅 콜라 관리 내에서 컨트롤 그룹은 얼룩말 플롯에 과시 하 고 있다. 데이터는 3 개의 독립적인 실험을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6: CXCR5 식에 콜라의 효과 안티-CXCR5 항 체 클론에 따라 큰 차이가 보였다. PP 세포 6 개월 마우스, 항 체에 관한 풀링된 및으로 분리 된 다른 그룹에서 사용 하 고 효소 소화 응용 프로그램 복제. (A-F) TFH 셀의 비율 얼룩말 플롯에 묘사 된 내 사전 문이 라이브, CD19- CD4+ T 세포. (A, C와 E) PP 셀 안티 마우스 CXCR5 Biotin 활용 된 항 체와 스테인드 했다 (2G 8 복제), BV421 형광 색소와 Streptavidin 활용 하 고. (B, D 및 F) PP 세포는 기본 활용된 반대로 마우스 CXCR5 항 체 (L138D7 클론)으로 물 했다. (A-B) TFH 게이팅 소화 되지 않은 PP 세포에서 플롯. 콜라 II (20 mg/25 mL 소화 믹스의)로 소화 하 고 37 ° c.에서 10 분 동안 동요 (C D) 조달 청 데이터는 두 개의 독립적인 실험을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 7: 콜라 기반 소화와 37 ° C에서 동요 영향 세포 생존 능력, 복구 및 세포내 착 효율. 3 개월 된 C57BL/6 마우스 희생 되었다; 조달 청 수집 되었고 풀링된 5A 그림에 설명 된 대로. (A) 후 조달 청, 조직 컬렉션 콜라 II (37.5 mg/25 mL 소화 믹스의) 10 분의 동요 했다, 고정된 PP 셀의 FSC, SSC 특성 (A)에 묘사 및 생존 능력 플롯을 얼룩 (묘사 D). (B, E) 조달 청의 컬렉션 후 조직 동요 또는 효소 소화; 없이 얼음에 보관 했다 FSC 그리고 SSC 고정된 조달 청 세포의 특성 (B)에 묘사 하 고 (E)에 그려져 생존 얼룩. (C, F) 조달 청의 컬렉션 후 조직 콜라;의 부재에서 37 ° C에서 10 분 동안 125-150 rpm에서 동요 했다 FSC, SSC 특성 및 고정된 PP 세포의 생존 얼룩이 그려져 (C, F), 각각. (G) 콜라 관리 없이 흥분 하 고 unagitated 조달 청에서 분리 하는 규제 T 세포에 Foxp3 식의 비교는 히스토그램 플롯에 묘사 된다. (H-J) 조달 청 6 달 오래 된 C57BL/6 마우스에서 수집 하 고 콜라 II의 다른 농도를 취급 했다: 25 mL 소화 믹스, 25 mL 소화 믹스 또는 아무 콜라 당 15 밀리 그램 당 25 밀리 그램. PP 셀 복구 및 수율에 효소 소화의 효과 공개 FSC 그리고 SSC 플롯 묘사 된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 8: 분자 모형 및 CXCR5의 완전 한 아미노산 시퀀스. (A) 7-패스 CXCR5의 막 횡단 단백질 구조 모델 이다. (B) CXCR5의 완전 한 아미노산 순서는 보여 줍니다. Extracellular 영역의 시퀀스 빨간색으로 표시 되 고 노란색으로 extracellular-아미노산 추정할 수 콜라 민감한 화학 채권을 보여 줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 항 원 | 클론 | Fluourochrome | 희석 |
| CD4 | GK1.5, RM4-5 | APC, PECy7, PerCpCy5.5, FITC | 1: 100 |
| CD19 | 6D 5 | FITC, APC/Cy7 | 1: 100 |
| PD-1 | J43 | PE ef 610 (텍사스 레드) | 1: 100 |
| ICOS | 15 F 9, 7E.17G9 | PE | 1: 100 |
| GL7 | GL7 | PerCp/Cy5.5 | 했다 1: 75 |
| CXCR5 | 2 세대 8,L138D7 * | 비타민 b 복합체 | 1:50 |
| BCL-6 | 7D 1 | PE/Cy7 | 1:50 |
| FOXP3 | FJK-16 | APC, PE | 1: 100 |
| Streptavidin | - | BV421, PE | 1: 100 |
| FixableViability 염료 | - | BV 510(AQUA) | 1:1,000 |
| 7AAD | - | PerCp/Cy5.5 | 1: 500 |
| FcBlock (CD16/32) | 2.4G2 | - | 1: 200 |
표 1: 항 체 요약. 희석, 복제와 관련 된 항 체와 생존 염료에 대 한 형광 색소 활용형 표시 됩니다. 최적의 희석 실험 조건 및 많은 제품의 품질에 따라 달라질 수 있습니다. 1시 20분에 기본 BV421 활용 된 L138D7 복제 희석 biotin 활용 된 2G 8 비교 CXCR5 탐지 능력을 보여주었다 클론 1시 50분에 희석. 따라서, 기본 활용 L138D7 biotin 활용 대체 2G 8로 사용할 수 있습니다 복제.
그림 보충 1 (S1): TFH와 GC B 세포에 대 한 전략을 게이팅 대체. (A) PP 라이브 세포 3 개월 마우스 C57BL/6 배경에서 묘사 된다. (B-C) GC B 세포 CD38로 문이- GL7+ (B) 및 BCL-6+ GL7+ B 세포 (C). (D-E) TFH 셀 PD-1안녕하세요 CXCR5로 묘사 된다+ (D) 그리고 ICOS+CXCR5+ CD4 + T 세포 (E). 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
여기, 우리가 TFH와 GC B 세포의 흐름 cytometric 특성에 최적화 된 프로토콜을 설명 합니다. 우리의 프로토콜의 주요 장점 중의 하나 이다는 하나의 마우스 (C57BL/6 변형)에서 최대 107 (평균 4-5 x 106 셀) 총 PP 셀의 모든 소화 과정 없이. 총 셀 생산량 조달 청의 수와 긍정적으로 상관 했다 및 실험 계획에 대 한 도움이 되는 다음과 같은 간단한 방정식에서 예상할 수 있는 관찰: "총 PP 셀 수 마우스에 당 0.5-1 = x (삭제 PP 당 수 마우스) x 106". 이 높은 셀 수율 향상 된 세포 생존 능력으로 보충 되었다 (> 95%). 향상 된 세포 복구 및 생존 분석 흐름 cytometric 다양 한 림프 톨 부분 집합의 병렬로 패널 얼룩 다양 한 항 체를 사용 하 여 조달 청에 허용.
드 예수 외의해 최근 PP 격리 프로토콜에 비해. 20 및 이전 보고서19,21, 상당히 높은 총 셀 생산량 및 생존 능력, 콜라와 소화의 부재에도 불구 하 고 우리의 프로토콜이 했다. 조달 청 식별 수도 있지만 "까다로운" 처음 조사에 대 한,이 프로토콜에 대 한 학습 곡선 꽤 가파른 이며 만약 마스터, 우리의 기술을 수 있습니다 식별 및 작은 창 자에서 조달 청의 외과 절단 짧은 시간입니다. 원하는 페이지 번호는 첫 번째 시도 후에 도달 하지, 경우 SI의 원심 및 인접 끝에 초점을 맞추고 PP 식별 단계를 반복 하는 것이 좋습니다. 우리의 연습, 거의 모든 마우스에서에서 십이지 장 끝 (그림 1A)에서 두 개의 밀접 하 게 위치한 PPs와 적어도 2-3 PPs는 회장의 지난 5 cm 이내 감지 했다.
TFH 얼룩 여분의 주의18백업은 조달 청 내 다른 셀 하위 집합 보다 더 요구 될 수 있습니다. 조직 처리 및 세포 격리 하는 동안 특정 단계는 놓쳤다면 결과 아주 오해의 소지가 있을 수 있습니다. 따라서, 다음 실험 "팁"에 주목 하는 연구를 것이 좋습니다. 키 TFH 그리고 GC B 세포 마커 이후와 같은 CXCR5 및 GL7 B와 T 세포에 표현 될 수 있습니다 그것은 오염 CD19 거짓 긍정적인 결과 피하기 위해 항 체 패널에는 B 세포 마커를 포함 하는 중요 한+CD4+ DP 셀24 ( 그림 2). 전략 게이팅 기반 T 세포 마커 때문에이 세포는 또한 매우 CD3를 포함 하는 T 세포 마커를 표현25 DP 셀의 충분 한 배제를 제공 하지 것입니다만 참고 (데이터 표시 되지 않음)와 CD4. DP 셀의 배제, 뿐만 아니라 교류 cytometry 결과 유효성을 검사 하 고 적절 한 부정적인 컨트롤을 사용 하 여 확인 (예., isotype 컨트롤, FMOs). 거짓 양성 뿐만 아니라 잃어버렸던된 TFH 게이트 false 결과 결론을 발생할 수 있습니다. TFH 게이트의 조정 수 때로는 전하실 TFH 세포 인구는 풍부한, cytometry에 분리 된 인구로 서 나타나지 않는 그로 인하여 하는 경우에 특히. 이 제한을 여러 TFH 마커 추가 회피 (예., BCL-6, PD-1, ICOS) 항 체로 패널 수 대체 제어 기회를 제공 하 고 증가 정확도26. 실용적인 이유로 BCL-6 대체 TFH 게이팅에 대 한 이상적인 공동 얼룩 마커 GC B 게이팅에 사용할 수 있는 셀 동시에16 (그림 S1C) 수 발견 됐다.
또한, 긍정적인 컨트롤 샘플 높은 TFH 비율을 포함 하는 데 제공할 수 있다 연구팀은 TFH 게이트를 올바르게 배치에 대 한 좋은 탐색. 우리의 실험에서는 사용 하는 PP 샘플 세 쥐 긍정적인 컨트롤 (6 개월 이상)에서 이후 노화 하면 조달 청 내의 TFH 셀의 향상 총 CD4의 40%까지+ T 세포 정상 상태 (데이터 표시 되지 않음). 우리는 또한 더 TFH TFH 셀18얼룩에 대 한 게시 된 프로토콜에 방법을 보고 얼룩의 기술적인 세부 사항에 관심을가지고 연구를 권장 합니다.
Pp에서 테스트 실험 가설 상대적으로 도전적 일 수 있다 고 통계적 의미21를 도달 하는 그룹 당 쥐의 매우 높은 숫자를 해야 할 수도 있습니다. 우리의 프로토콜의 높은 셀 수익률을 활용 함으로써 우리 다음 실험 전략이 장애물을 피할. 첫째, 우리 excised 조달 청 및 그들의 해부학 적 근원에 따라 그들을 별도로 정렬 (예., 십이지 장, jejunal 및 ileal). 다음, 우리가 동등 하 게 이러한 실험에 서로 다른 풀링된 PPs 및 제어 그룹 배포. 이 내부 제어 실험 전략 우리 모든 셀 단일 마우스에서 가져온 동안 쥐에 간 개별 차이 최소화 하기 위해 사용할 수 있습니다.
또한, 다른 장의 구획 사이 변화 (예., 십이지 vs. 회장)-이전 중요 한2 보고-실험으로 방지 되었다 제어 그룹 당 조달 청의 동등한 수에서 구성 되어 해 부 지역 (그림 5A). 동일한 방식을 사용 하 여 독립적인 실험의 복제를 수행 하 여 신뢰성과 결과의 중요성을 향상. 일반적인 변형 제거, 게다가이 방법론은 또한 여분의 마우스, 시 약 및 시간 도움이 됩니다.
개발 및 우리의 프로토콜의 최적화 하는 동안 우리의 결과 밝혀 콜라 II와 IV-기반 소화 기 막히게 감지 TFH 표면 다른 분자 동안 CXCR5 식 (그림 5B) 감소 및 GC B 세포 남아 그대로 ( 그림 5C -E) . 최근 보고 된 정돈 프로토콜19, 콜라 II 조달 청 및 LPs에서 림프 구 분리에 대 한 매우 효과적인 것으로 표시 했다. 그러나, 콜라 II 이전 여러 표면 분자의 분열 귀착되는 높은 tryptic 활동에 보고 되었습니다. 문학28,,2930에 그것의 표면-분자 친화적인 자연27 낮은 tryptic 활동 및 더 일반적인 사용을 감안할 때, 콜라 4 했다 또한 포함 되어 콜라 II 이외에 우리의 연구가 이전 보고서에서 권장 농도에 사용 되 고. 콜라와 해당 효소의 사용과 같은 변경 하는 면역 세포 표면 분자 식31,27에 소화의 원치 않는 효과 인해 점 막 면역학 모순 문제 되었습니다.
그것은 이전 콜라의 다른 종류를 사용 하 여 흐름 cytometric 인간의 직감32 및 편도 선 샘플18내 CXCR5 탐지를 방해할 수 보고 되었다. 반대로, 다른 연구 collagenases24,33의 사용 없이 조달 청에서 TFH와 GC B 세포의 절연을 보여주었다. 그러나,까지 아무 비교 접근 포함 또는 제외 콜라 소화의 murine 조달 마우스 CXCR5에서 CXCR5 표현 TFH 셀의 격리에 대 한 최적의 상태를 나타내는 것 이다 여부를 평가 하기 위해 시행 된 했다 이제는 374 아미노산 CD4, PPs (UniProt에서 가져온 데이터)에 림프 세포에 풍부 하 게 표현 됩니다 CD19 같은 다른 막 횡단 단백질에 비해 상대적으로 짧은 extracellular 영역 긴 7 패스 막 단백질. 그림 8A-B, 분자 모델 및 콜라 기반 소화의 추정된 대상 시퀀스와 마우스 CXCR5 묘사의 총 아미노산 시퀀스는 글리신 (Gly) 및 중립 아미노산 사이 화학 결합을 해리 하는 경향이 산34 7-패스 막 횡단 분자 구조 결과 짧은 세포 외 도메인 CXCR5 분자 효소 소화 (그림 8A)에 취약 만들기 위한 수 있습니다. 글, 우리는 CXCR5 식의 그 검출 후 콜라 치료 항 체 복제 사용에 따라 달라 집니다 발견. 비록 2G 8 및 L138D7 소화 PP 그룹에 비해 TFH 분수의 탐지에 의해 결정으로 소화 되지 않은 PP 그룹에서 유사한 성능을 보였다 L138D7 복제 약 3 CD4 내의 TFH 셀의 (≈ 9%) 보다 높은 분수 배 공개+ 2G 8 보다 T 세포 클론 (≈ 3%) (그림 6)입니다. 이 감소 된 CXCR5 얼룩 것 콜라의 효소 활동에 의해 수정 된 3 차원 epitope 구성을 보조 나왔다. 우리의 결과 나타냅니다 콜라 기반 소화 PP 준비 하는 동안 피해 야 한다.
CXCR5 분자 검출 콜라 분리의 간섭 소화 단계를 제외 하 여 피할 되었습니다. 그러나, LP 같은 일부 조직에 대 한 기계적 장애 세포를 격리 하기 위해 충분 하지 않습니다 그리고 그런 조직에 대 한 효소 소화 필요한19것 주목 되어야 한다. 미래에, 그것 대체 소화 조건 효소 소화 프로세스를 요구 하는 조직에 대 한이 기술 한계를 우회 하기 위하여 소화 호환 항 체 클론 테스트 필수적인 것입니다. 그때까지, 면역 형광 현미경 검사 법 같은 이미징 기술을 TFH 검출이 조직에 선택의 방법으로 있을 것입니다. Lp로 세포를 분리, 뿐만 아니라 Dc 및 조달 청에서 플라즈마 세포 등 일부 조 혈 세포 하위 집합의 효소 소화35필요 합니다. 우리의 프로토콜을 채용 하는 경우 조달 청에서 이러한 셀의 하위 집합을 분리 하고자 하는 연구자는 적절 한 효소 소화 단계20을 포함 해야 합니다. DC 마커의 식의 효소 소화 가능한 간섭 한다 고려 되어야 하 고 필요에 따라 소화 조건 최적화 되어야 합니다. TFH와 GC B 세포의 분리 콜라 소화36, 조달 청 각 마우스에서 수집 해야 하는 셀 하위 집합 뿐 아니라 원하는 때와 병렬 패널에 콜라 치료 없이 처리를 위해 두 그룹에서 분리 될 수 있습니다.
PP 림프 톨에 콜라의 효과 표면 분자 식 제한 되었습니다. 우리의 결과 효소 소화는 복용량-의존 방식 (그림 7) PP 세포 내 림프 구 비율 상대적 감소 발생 밝혔다. 림프 구 분수의 감소는 크고 림프 세포 보다 더 세분화 된 조달 청에서 식 세포, Dc 등 하위 집합 조 혈 세포의 다른 종류의 콜라 중재 방출의 결과 수 있습니다. 그것은 또한 가능한 LP 이웃 셀 릴리스를 중재 하는 콜라 소화 및 intraepithelial 구획 FSC SSC 프로필의 변화에 기여할 수 있는. 다른 창 구획에서이 셀 오염 또한 PP 림프의 흐름 분석에 간섭을 발생할 수 있습니다. 그 기준 셀 순도 최대화 하기 위해 우리 또한 피할 상피 세포와 점액20, 추출에 널리 사용 되는 EDTA 또는 DTT 등 시 약의 추가 생리 및 가능한 unmanipulated 조직 준비 상태를 유지. 효소 소화 이러한 부작용에도 불구 하 고 PP 세포에 유익한 효과 세포내 얼룩 및 세포 생존 능력 (그림 7D-F, G)의 개선과 같은 또한 발견 되었다. 그러나, 추가 분석 공개 세포 생존 및 세포내 Foxp3 얼룩 비교할 정도로 셀에 동요 했다 때 선호 했다 때문에 이러한 효과 효소 소화 별도로 37 ° C에 동요 과정에 기인 했다 콜라의 부재입니다. Mechanistically, 동요의 유익한 효과 장 콘텐츠 및 조달 청에서 점액의 향상 된 제거 때문일 수도 있습니다.
요약 하자면, 우리 조달 격리 셀 수 여러 셀 하위 집합의 흐름 cytometric 특성에 대 한 스테인드 또는 셀 정렬 대상이 고 수 이후 다양 한 에서 고용에서 세포의 고립에 대 한 효율적인된 프로토콜을 설명 했습니다. 생체 외에서 및 기능 분석 vivo에서 .
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언.
Acknowledgments
우리는 유용한 토론에 대 한로 라 스트라우스와 피터 세이 지를 감사 하 고 교류 cytometry 분석 지원 하 고 싶습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-mouse CD4 antibody | eBioscience, Biolegend* | 17-0041-81 ,10054* | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse CD19 antibody | eBioscience | MA5-16536 | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse PD-1 antibody | eBioscience | 61-9985-82 | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse ICOS antibody | eBioscience | 12-9942-82 | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse GL7 antibody | Biolegend | 144610 | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse CXCR5 antibody | Biolegend*, BD Bioscience | 145512*, 551960 | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse BCL-6 antibody | Biolegend | 358512 | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse Foxp3 antibody | eBioscience | 17-5773-82 | For detailed information see Table 1 |
| Streptavidin-BV421 | BD Bioscience | 563259 | For detailed information see Table 1 |
| FixableViability Dye | eBioscience | L34957 | For detailed information see Table 1 |
| 7AAD | Biolegend | 420404 | For detailed information see Table 1 |
| FcBlock (CD16/32) | BD Bioscience | 553141 | For detailed information see Table 1 |
| Collagenase II | Worthington | LS004176 | |
| Collagenase IV | Worthington | LS004188 | |
| Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set | eBioscience | 00-5523-00 | |
| 6-well,12-well & 96-well plates | Falcon/Corning | 353046,353043/3596 | |
| 50 mL conical tubes | Falcon | 3520 | |
| 40 µm cell strainer | Falcon | 352340 | |
| 10 mL syringe-plunger | Exel INT | 26265 | |
| RPMI | Corning | 15-040-CV | |
| PBS | Corning | 21-040-CM | |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Orbital shaker | VWR | Model 200 | |
| Curved-end scissor | |||
| Fine Serrated Forceps | |||
| Small curved scissor |
References
- van den Berg, T. K., van der Schoot, C. E. Innate immune ‘self’ recognition: a role for CD47-SIRPα interactions in hematopoietic stem cell transplantation. Trends in Immunology. 29 (5), 203-206 (2008).
- Mowat, A. M., Agace, W. W. Regional specialization within the intestinal immune system. Nature Reviews Immunology. 14 (10), 667-685 (2014).
- Reboldi, A., Cyster, J. G. Peyer’s patches: Organizing B-cell responses at the intestinal frontier. Immunological Reviews. 271 (1), 230-245 (2016).
- Heel, K. A., McCauley, R. D., Papadimitriou, J. M., Hall, J. C. Review: Peyer’s patches. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 12 (2), 122-136 (1997).
- Fagarasan, S., Kinoshita, K., Muramatsu, M., Ikuta, K., Honjo, T. In situ class switching and differentiation to IgA-producing cells in the gut lamina propria. Nature. 413 (6856), 639-643 (2001).
- Hopkins, S. A., Niedergang, F., Corthesy-Theulaz, I. E., Kraehenbuhl, J. P. A recombinant Salmonella typhimurium vaccine strain is taken up and survives within murine Peyer’s patch dendritic cells. Cellular Microbiology. 2 (1), 59-68 (2000).
- Shreedhar, V. K., Kelsall, B. L., Neutra, M. R. Cholera toxin induces migration of dendritic cells from the subepithelial dome region to T- and B-cell areas of Peyer's patches. Infection and Immunity. 71 (1), 504-509 (2003).
- Sato, A., Iwasaki, A. Peyer’s patch dendritic cells as regulators of mucosal adaptive immunity. Cellular and Molecular Life Sciences. 62 (12), 1333-1338 (2005).
- Bemark, M., Boysen, P., Lycke, N. Y. Induction of gut IgA production through T cell-dependent and T cell-independent pathways. Annals of the New York Academy of Sciences. 1247 (1), 97-116 (2012).
- Fagarasan, S., Kawamoto, S., Kanagawa, O., Suzuki, K. Adaptive Immune Regulation in the Gut: T Cell-Dependent and T Cell-Independent IgA Synthesis. Annual Review of Immunology. 28, 243-273 (2010).
- Hase, K., et al. Uptake through glycoprotein 2 of FimH + bacteria by M cells initiates mucosal immune response. Nature. 462 (7270), 226-230 (2009).
- Wu, H., et al. An Inhibitory Role for the Transcription Factor Stat3 in Controlling IL-4 and Bcl6 Expression in Follicular Helper T Cells. Journal of Immunology. 195 (5), 2080-2089 (2015).
- Vinuesa, C. G., Tangye, S. G., Moser, B., Mackay, C. R. Follicular B helper T cells in antibody responses and autoimmunity. Nature Reviews Immunology. 5 (11), 853-865 (2005).
- Victora, G. D., Nussenzweig, M. C. Germinal Centers. Annual Review of Immunology. 30, 429-457 (2012).
- Vaeth, M., et al. Store-Operated Ca2+Entry in Follicular T Cells Controls Humoral Immune Responses and Autoimmunity. Immunity. 44 (6), 1350-1364 (2016).
- Meli, A. P., et al. The Integrin LFA-1 Controls T Follicular Helper Cell Generation and Maintenance. Immunity. 45 (4), 831-846 (2016).
- Fu, W., et al. Deficiency in T follicular regulatory cells promotes autoimmunity. Journal of Experimental Medicine. 215 (3), 815-825 (2018).
- Espéli, M., Walker, J. M. T follicular helper cells - Methods and Protocols. , (2015).
- Couter, C. J., Surana, N. K. Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes. Journal of Visual Experiments. (111), e54114 (2016).
- De Jesus, M., Ahlawat, S., Mantis, N. J. Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer’s Patches. Journal of Visual Experiments. (73), e50167 (2013).
- Pastori, C., Lopalco, L. Isolation and in vitro Activation of Mouse Peyer’s Patch Cells from Small Intestine Tissue. Bio-protocol. 4 (21), e1282 (2014).
- Fukuda, S., Hase, K., Ohno, H. Application of a Mouse Ligated Peyer’s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells. Journal of Visual Experiments. (58), 3225 (2011).
- Naito, Y., et al. Germinal Center Marker GL7 Probes Activation-Dependent Repression of N-Glycolylneuraminic Acid, a Sialic Acid Species Involved in the Negative Modulation of B-Cell Activation. Molecular and Cellular Biology. 27 (8), 3008-3022 (2007).
- Bollig, N., et al. Transcription factor {IRF4} determines germinal center formation through follicular T-helper cell differentiation. Proceedings of the National Academy of Science of U. S. A. 109 (22), 8664-8669 (2012).
- Pérez-Mazliah, D., et al. Follicular Helper T Cells are Essential for the Elimination of Plasmodium Infection. EBioMedicine. 24, 216-230 (2017).
- Sage, P. T., Sharpe, A. H. T follicular regulatory cells in the regulation of B cell responses. Trends Immunology. 36 (7), 410-418 (2015).
- Van Damme, N., et al. Chemical agents and enzymes used for the extraction of gut lymphocytes influence flow cytometric detection of T cell surface markers. Journal of Immunological Methods. 236 (1-2), 27-35 (2000).
- Meenan, J., et al. Altered expression of alpha 4 beta 7, a gut homing integrin, by circulating and mucosal T cells in colonic mucosal inflammation. Gut. 40 (2), 241-246 (1997).
- Cao, A. T., et al. Interleukin (IL) -21 promotes intestinal IgA response to microbiota. Mucosal Immunology. 8 (5), 1072-1082 (2015).
- Wei, J., et al. Autophagy enforces functional integrity of regulatory T cells by coupling environmental cues and metabolic homeostasis. Nature Immunology. 17 (3), 277-285 (2016).
- Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function. European Journal of Microbiology & Immunology. 2 (2), 112-120 (2012).
- Trapecar, M., et al. An Optimized and Validated Method for Isolation and Characterization of Lymphocytes from HIV+ Human Gut Biopsies. AIDS Research and Human Retroviruses. 33 (S1), (2017).
- Bergqvist, P., Gardby, E., Stensson, A., Bemark, M., Lycke, N. Y. Gut IgA Class Switch Recombination in the Absence of CD40 Does Not Occur in the Lamina Propria and Is Independent of Germinal Centers. Journal of Immunology. 177 (11), 7772-7783 (2006).
- Keil, B., Gilles, A. M., Lecroisey, A., Hurion, N., Tong, N. T. Specificity of collagenase from Achromobacter iophagus. FEBS Letters. 56 (2), 292-296 (1975).
- Mora, J. R., et al. Selective imprinting of gut-homing T cells by Peyer’s patch dendritic cells. Nature. 424 (6944), 88-93 (2003).
- Reboldi, A., et al. Mucosal immunology: IgA production requires B cell interaction with subepithelial dendritic cells in Peyer’s patches. Science. 352 (6287), (2016).
