Summary
本研究で提案する小説とリンパ球の隔離のための効果的なプロトコル卵胞 T の流れフローサイトメトリーによる調査と同様に、体内と体外の機能アッセイにその後使用できますパイエル パッチ (PPs) からヘルパーおよび胚中心 B 細胞。
Abstract
消化管粘膜の免疫細胞は、病原体に対する免疫防御を同時に付与しながら免疫寛容を促進するユニークな免疫学的実体を構成します。まあ、パイエル板 (PPs) がいくつかのエフェクター T および B 細胞のサブセットをホストすることによって粘膜免疫ネットワークの重要な役割をあることを設立します。これらのエフェクター細胞、卵胞の T ヘルパー (TFH) および (GC) 胚中心 B 細胞のある特定の一部分は、体液性免疫の調節に professionalized します。したがって、PPs 内の分化プログラムと機能性の面でこれらの細胞のサブセットの特性は、粘膜免疫に関する重要な情報を提供できます。このため、簡単に適用可能な効率的な再現性のある PPs からのリンパ球分離法は研究者に有益でしょう。本研究では細胞の高安マウスからリンパ球を分離するための効果的な方法を生成する目的とします。我々 のアプローチの処理消化試薬と組織の動揺の使用など、初期組織を明らかと同様、細胞染色条件と抗体パネルの選択、品質と分離リンパ球のアイデンティティに大きな影響を与える実験結果。
ここでは、効率的に再現性のある流れ cytometry TFH と GC B 細胞サブセットに主に焦点を当て、T および B 細胞のサブセットの評価を許可する PPs からリンパ球集団を隔離して研究者を有効にするプロトコルについて述べる。
Introduction
最後に、最初から全体の消化管はよりも他の人間の器官とマウス1免疫細胞を含むリンパ網で飾られて。Peyer のパッチ (PPs) は、この細胞の免疫組織、いわゆる腸管関連リンパ性ティッシュ (GALT)2,3の腸の枝の主要なコンポーネントを構成します。PPs、食材由来の抗原の数百万の何千もの内で共生微生物叢と病原体が連続的にサンプルされているし、それらに向かって必要な適切な免疫応答がマウントされた維持腸管免疫恒常性。その意味で、PPs は「小腸の扁桃」として名前可能性があります。PPs から成っている主要な小班: 上皮下ドーム (SED) 大規模な B 細胞濾胞ゾーン;T 細胞がある4を覆う濾胞関連上皮 (FAE) と胞間領域 (IFR)。協力する PPs により異なるエフェクター細胞のサブセットのこのユニークな区画は、したがって、腸内免疫を与えます。
PPs 求心性リンパ管の欠如し、この理由のため小腸から PPs に運ばれる抗原は他のリンパ器官のほとんどと対照をなしてリンパ管を介して行われているないです。代わりに、FAE、いわゆる M 細胞にある特殊な上皮細胞が PPs5への抗原の転送を担当します。その後、運ばれた抗原は、樹状細胞 (Dc) によって拾われますと FAE6,7下上皮ドーム (SED) 地域にある食。PP で DCs によって、この抗原並べ替えプロセスは適応免疫応答8および IgA 産生細胞9の次の世代を開始することが重要です。
共生植物や食材から抗原上負担による PPs ホスト内生と活性化エフェクター T TFH と伊賀+ GC B 細胞10など大きな元素に B 細胞サブセット PPs 表すアクティブな免疫のサイトであることを示唆しています。応答11。20-25% の検出 TFH セル合計 CD4 内+ T 細胞のコンパートメントとを GC B 細胞, B 細胞内で 10-15% に採集された unimmunized 若い C57BL/6 マウス12PPs で可能です。他の T ヘルパー細胞型とは対照的 (すなわち。、Th1、Th2、Th17 細胞)、TFH 細胞 CXCR5 式 CXCL13 勾配13に沿って TFH 細胞のホーミングを促進するため主に B 細胞濾胞にユニークな親和性を示します。PPs の B 細胞濾胞ゾーン、TFH 細胞誘導を誘導する IgA クラス スイッチ組換え活性化 B 細胞の高親和性 IgA を生産細胞分化14で体性 hypermutation。その後、これらの抗体分泌形質細胞は粘膜 (LP) に移行し、腸10免疫恒常性を調節します。
PPs 内 TFH と GC B 細胞集団の同定と解析は、時間のかかる免疫モデルを必要とせず定常条件の下で液性免疫応答の動態を調査する研究者を可能にするかもしれないTFH GC B 細胞研究15,16,17,18で伝統的に使用。PPs 内 TFH 細胞を解析は他の細胞のサブセットと同様に簡単ではありません。技術的な課題には、理想的な組織の準備条件、表面マーカー抗体の組み合わせを識別するだけでなく、適切な正と負のコントロールを選択することが含まれます。TFH と PP の研究分野では、実験手続きの面で大きな変動性を示すし、いくつかの理由のために標準化されたプロトコルを確立する合意を授与から遠く離れています。まず、PPs 内各細胞のサブセットは、特異的細胞サブセット固有の方法でさらに変更を必要とする組織調製条件の影響を受ける傾向があります。第二に、安第三に、理想的な組織調製技術と実験条件調査プロトコル ベースの比較研究の数からのセルの準備の詳細について報告の方法の間で大きな差異があります。PP と TFH の研究はかなり限られています。
TFH や B 細胞指向 GC、PP 細胞調製19,20,21,22の提案した現在のプロトコル ベースの研究はありませんでした。さらに、PPs19,20コラゲナーゼ ベースの消化などをお勧めしますいくつかの組織調製条件がフローサイトメトリーによる TFH 同定の結果に悪影響を与える判明した18。これに基づき、私たちは PPs 内 TFH と GC B の細胞動態を研究するために使用できる最適化された、標準化された、再現性のあるプロトコルがこのトピックに取り組んでいる研究者に価値があると判断。この必要性は私たちの分離と細胞回復、生存率、およびいくつかの T および B の流れフローサイトメトリー評価の効率を最適に細かく PP リンパ球の特性の改善と最新プロトコルを生成するきっかけとなった細胞サブセット。また、必要な操作と PPs から組織・細胞の準備のための時間を減らすことにより、以前のプロトコルで提案されているいくつかの面倒な準備手順を除外する目指しました。
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Protocol
機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) ベス イスラエス ディーコネス メディカル センターのガイドラインの下ですべての研究とこのプロトコルで記述されている実験を行った。
1. 設計の実験の設定とマウス グループ
- (省略可能)共同実験的マウス実験的マウスの腸内細菌の水平伝播を容易にして PP リンパ球内で非固有の可変性を減らすための家します。また、同じ性別の濾胞を使用して変動を最小限に抑えます。
2. 外科的切除および組織の準備のステップ:
- 外科的切除小腸 (SI)
- CO2窒息または動物倫理委員会によって承認された同等のメソッドを使用してマウスを安楽死させます。
- 外科的切除のための専用の領域にマウスを転送します。裏面を置くし、70% エタノールで腹部をサニタイズします。腹部の皮膚と腹膜腹膜腔を開くので胸郭に恥骨から正中線に沿って切断することによって開腹したを実行します。
メモ: は、腹腔内を貫通し、腸組織の損傷を避けるために皮膚の比較的小さい区域の最初の切開を行います。目的の解剖学的境界線まで切除を続行します。 - 盲腸は、小腸遠位のセグメントを構成する回腸末端部の検出のための理想的なランドマークを識別します。
注: 盲腸は通常マウスの腹部の左下にあります。 - 回盲部の接合部を特定し、盲腸から小腸を分離することが可能として、遠位このレベルに切り付けます。次の手順では、全体ため壊れやすい PPs 崩壊タッチ時に簡単に腸管壁に過度の物理的な接触を避けてください。
- 優しくはさみを使って腸を切断することによって幽門括約筋まで小腸全体を削除します。幽門、十二指腸、間の接合部を特定し、腹腔内から腸の剥離を完了につながるこのレベルで十二指腸を切り取る。
注: (i) を避けるため過伸展、これはの腸の壁の破裂を引き起こす可能性があります。(ii)腸間膜の脂肪を完全に除去が必要な PP リンパ球に加えて LP リンパ球の隔離が必要な場合。ただし、PP 分離のみ、残りの腸間膜脂肪でした提供するいくつかの利点それ以上の分離手順中にしたがって、それは保持する必要があります。 - 冷たい RPMI + 10% 牛胎児血清 (FBS) でいっぱい 6 ウェル プレートで小腸の戸を置き、腸内のすべてのセグメントが冷たいメディアで水中に沈むまで手動で組織を振といます。次の手順で氷の上の組織を維持します。
- マウス小腸の必要な数を解剖した後に、収集された小腸から PP 切除に進みます。
- PPs と単一細胞懸濁液の準備の外科的切除は:
- 優しく把持鉗子を使用して腸間膜脂肪、ペーパー タオルに小腸を転送し、ペーパー タオルに直面して腸間膜側を配置します。冷たい RPMI + 10% 腸管全体を湿らせて組織の脱水と粘りを避けるために政府短期証券。
注: 残りの腸間膜脂肪することでこの段階で、SI の腸間膜のサイト上の脂肪質のティッシュのセグメント直面している反腸間膜のサイトを維持するペーパー タオルに固執するでしょう。 - PPs は、腸管壁の反腸間膜側に「カリフラワーのような」形で白い多葉状集計として表示されますを識別します。
注: すべての PPs を切除まで、フラッシング、内腔のコンテンツは推奨されません。内腔のコンテンツを空に PPs の崩壊を引き起こす可能性があります、PPs と PPs の視覚的な識別のため非常に便利です, 腸管壁の色のコントラストを防ぎます。 - 抗腸間膜側に PPs を識別した後 PPs に手術の湾曲最後シザーを配置 (曲線上に向きます) の遠位と近位の境界線から PP を抑制します。
指先を使用してシザーの刃に向けて優しく PP はオプション: プッシュします。この演習は、周囲 PP 非組織の良い排除に します。周囲の腸組織を除く、PPs を優しく、消費税します。
注: (i) この手順から LP と腸上皮、T 細胞に富んでいるもなど腸内の区画を隣接セルの汚染を最小限に抑えながら最大の PP 細胞収率を取得することが重要です。(ii) から 1 つの SI c57bl/6 マウスから摘出した、5-10 PPs (平均サイズ、多葉状) を収集できます。までも小さい PPs (多葉状ではない) のコレクションを目指してマウス (C57BL/6) あたり 12-13 PPs がこのプロトコルを使用できます。 - 12 ウェル培養プレートに転送摘出 PPs は満ちて冷たい RPMI + 10 %fbs と鉗子または湾曲の外科はさみを使用しての維持の氷。
注: (i) 直後に PPs の切除、粘液や PP 表面に腸内容で洗浄できますペーパー タオルの上にティッシュをこすりします。この手順では、PP 細胞の生存率を向上します。(ii) PPs をプレートに転送するの代わりにチューブを分離への転送も考えられる総サンプル数に応じて。 - オプション: PP 切除およびウェル プレートに後続の配置が完了したら、数と別の実験/マウス グループから収集した PPs のサイズことができます文書化する PPs を含む組織培養プレートの写真を撮るに。
- 50 mL コニカル チューブ RPMI + 10 %25 ml のセットを準備 (37 ° C に加温) FBS。1 mL ピペットで PPs の吸引ができる距離から 1,000 μ L チップのエッジをカットするはさみのペアを使用して。1 mL ピペットで PPs を吸引し、準備 50 mL の円錐管に 12 も組織培養プレートからそれらを転送します。
注: は、サンプル間のクロスコンタミネーションを避けるために各マウスのサンプルのための新しいヒントを使用します。 - 蓋を保護し、125-150 rpm で 10 分間の連続攪拌と 37 ° C で軌道シェーカーでチューブを垂直方向に配置します。一方、50 mL チューブの新しいセットを準備し、単一細胞懸濁液の準備を通じて、各チューブの上に 40 μ m セル ストレーナーを配置します。
注: (i) かくはん手順を PP リンパ球の回復、細胞生存率を減少しない場合は削除腸内のコンテンツ、粘液や細胞の残骸の残りが削除されます。(消化過程が細胞表面から CXCR5 式の劇的な損失を原因、PP 組織に消化酵素の任意の種類を適用されません ii)。 - ・攪拌後 40 μ m の細胞のストレーナーに転送、PPs は、新しく準備された円錐 50 mL チューブ上に配置。単一細胞懸濁液を生成するセル ストレーナーを介して PPs が中断される 10 mL シリンジのプランジャーの丸い側を使用して、優しく。15-20 ml の冷たい RPMI + 10% のストレーナーを洗浄 FBS。
メモ: (i) 抽出前に PPs を水平方向に入りチューブを振ります。この短い揺れはセル ストレーナーに PPs の転送を容易にするため。(ii) 非リンパ系免疫細胞の隔離のため 70 μ m セル ストレーナを使用して (e.g。、単球、マクロファージ、DCs) をお勧めします。 - 4 ° C で 10 分間 350-400 x g で単一細胞懸濁液を遠心分離します。
- 慎重に上澄みを廃棄し、10 x 106セル/mL の濃度で細胞を再懸濁します。診断を使用してセルをカウントします。
注: (i) セルがカウントする前マウス PP グループごとに総細胞数約推定できる次の数式を使用して:「0.5-1 x 10 の6セル (PPs の数) x = 総セル数"。トリパン ブルーのセルをカウントするため、さらに希釈は必要かもしれません。(ii) として手動カウントの代わりに、自動化された細胞カウンターを使用できます。 - 適切なボリュームの 10 の6セル × 2 2.5 を転送 (e.g。、200 μ l) 96 ウェル丸底プレートに。
注: 単色および否定的なコントロールのサンプルは、0.5-1 x 10 の6セルがあります十分です。 - 4 ° C で 5 分間 350 x g でプレートを遠心分離します。プレートにフリックします。
- 染色バッファーの 200 μ L のセルを洗浄します。
- 優しく把持鉗子を使用して腸間膜脂肪、ペーパー タオルに小腸を転送し、ペーパー タオルに直面して腸間膜側を配置します。冷たい RPMI + 10% 腸管全体を湿らせて組織の脱水と粘りを避けるために政府短期証券。
3. 表面抗体の汚損
- 生存率は染色:
- 最終的な洗浄の後に、100 μ L の PBS (1:1, 000) で希釈した修正可能性色素で細胞を再懸濁します。氷や闇の 4 ° C で 30 分間インキュベートします。
注: (i) 細胞内染色の重要な転写の検出 Foxp3 などの要因や Bcl 6 セルの固定が必要です。その場合、非修正可能な生存の染料 (e.g。 DAPI 7 AAD, ) は使用できません。(ii) 修正可能性色素を希釈するタンパク質を含む染色バッファーを使用しないでください。この手順で使用されるメディアは、タンパク質無料する必要があります。(死んだ細胞を false につながるかもしれない流れフローサイトメトリー分析蛍光を発光、結合の表面抗体特異的、深刻な技術的な問題を引き起こすので、iii) 生存の染色を使用して死んだ細胞の排除は重要です肯定的な結果。 - 染色バッファーで 2 回洗浄を行う。350 x g で 4 ° C で 5 分間遠心プレートにフリックします。
- 最終的な洗浄の後に、100 μ L の PBS (1:1, 000) で希釈した修正可能性色素で細胞を再懸濁します。氷や闇の 4 ° C で 30 分間インキュベートします。
- Fc ブロックおよび表面の層 i:
- 染色バッファーで抗体抗 CD16/32 (レバレッジ) を希釈して Fc ブロック ソリューションを準備します。
- Fc ブロックの調製した溶液の 20 μ l 細胞を再懸濁します。氷の上の 15 分間インキュベートします。
- 洗浄せず表面抗体カクテル 80 μ L は適切な希薄で準備 (概要の抗体の表 1を参照) を追加します。氷上で少なくとも 30 分間インキュベートします。
- 過剰な染色バッファーを追加して 2 回洗います。350 x g で 4 ° C で 5 分間遠心プレートにフリックします。
- 表面の層 II:
- 螢光色素標識ストレプトアビジン染色バッファーで希釈することによってストレプトアビジン染色液を準備します。
- 最終的な洗浄の後に、染色液を希釈ストレプトアビジン (1: 100) 100 μ l 細胞を再懸濁します。暗闇の中で氷の上に少なくとも 15 分間インキュベートします。
- 染色バッファーで 2 回洗浄します。350 x g で 4 ° C で 5 分間遠心プレートにフリックします。
オプション: 細胞内染色の濾胞性制御性 T 細胞の検出が必要ない場合は、最後の洗浄後が 200 μ L の染色バッファーと流れの cytometer でデータを取得する適切なチューブに転送で細胞を再懸濁します。サンプルが固定されていない場合、正確な結果を得るために 3-4 時間以内フローサイトメトリーによるデータの取得を行ってください。
4. セル固定
- 固定/透過 (修正/パーマ) Foxp3/転写因子染色バッファー設定から試薬を使用して実用的なソリューションを準備します。固定/透過目的の最終的なボリュームに希釈剤の 3 つの部分と固定/透過の一部分の集中をミックスします。
- 最終的な洗浄の後に、作業の修正/パーマ液 200 μ l 中で細胞を再懸濁します。
- プレート氷の上または 20 分のための 4 ° C で孵化させなさい。このステップの 20 分を超えないようにします。長いインキュベーション時間細胞回復が大幅に低下可能性があります。
- 350 x g で 4 ° C で 5 分間遠心プレートにフリックします。(省略可能)この手順の後固定セルをウシ血清アルブミン (BSA) を含むバッファーを染色で 4 ° C で数日間保存ことができますまたは後続の細胞内汚れるか、または流れの cytometry 買収まで FBS。
- 透過バッファー (x1) たて精製脱イオン水で希釈済みの 200 μ L で細胞を再懸濁します。
- 部屋の温度 (RT) で 5 分間 350 × g で遠心分離機します。
- 透過バッファーと 350 × g で遠心する室温 5 分の 200 μ L で 1 回洗浄します。
5. 細胞内染色
- Fc ブロック ソリューションを準備するには、透過バッファーで抗体抗 CD16/32 (レバレッジ) を希釈します。
注: 固定ステップの後、細胞維持されなければならない透過バッファー内細胞内染色のプロセスが終了するまで。 - 最終的な洗浄の後に、Fc ブロック ソリューションの 20 μ l 細胞を再懸濁します。暗闇の中で RT で 10-15 分の間孵化させなさい。
- 洗浄せず細胞抗体カクテル (100 μ L 最終巻) 透過バッファーで希釈済みの 80 μ L を追加します。室温 30 分間インキュベートします。
- 右で 5 分間 350 x g でパーマ バッファー、および遠心分離機の 100 μ L を追加します。
- 透過バッファーの 200 μ L で 1 回洗浄、右で 5 分間 350 × g で遠心分離
- 最終的な洗浄の後染色バッファーの 200 μ L で細胞を再懸濁します適切な管 (染色バッファーで 400 μ L の最終巻) にセルを転送し、フローサイトメトリーによるデータを取得します。プレート リーダーのオプションを持つ流れの cytometer が利用可能な場合、管に転送することがなく、96 ウェル プレートでステンド グラス サンプルを実行もあります。この手順では、セルを転送する時にセル損失を最小限に抑えます。
- GC B 細胞だけでなく、TFH、出生率の再現性の高い分析を実行できるようにする流れの cytometer でセルの総数が 5 x 105の最小値を取得します。
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Representative Results
以前のプロトコル20と対照をなして PPs は SI 全体均等に配布されていないに示すように、SI の遠位と近位端に向かってより密ローカライズを観察している図 1 a.フローサイトメトリーによる解析を示した場合、我々 のプロトコルと脾細胞 (図 2 a、E、および2 D, H) と同様の前方側方散乱分布を示す PP リンパ球の人口に与えること、> 95% のセル生存率 (図 2 bおよび2 階)。その他二次リンパ器官 (Slo) と対照をなして c57bl/6 マウスで PP リンパ球の合計の約 70-80% から成っている B 細胞に対し CD4+ T 細胞は PP リンパ球 (図 2と2 G) の合計の 10-15% だけを構成します。
注意してくださいその CD4+ CD19+二重陽性 (DP) 細胞は ≈ PP リンパ球の合計の 1% を構成します。B 細胞の Fc の受容器に対して Fc ブロックの実行など、CD4 のダブレットを除くセル準備の間にある特定の注意と+ CD19+ DP 細胞集団があることができる (図 3 aおよびB) を最小化します。ただし、ダブレットの前方散乱 (FSC) 特性を示していない DPs のほんの一部は不可避であり単一正 T および B 細胞のゲートからうちゲート必要があります(図 3 b)。我々 の結果は、DP 細胞内 B 細胞調整は TFH ゲートの偽肯定的な結果につながる可能性のある表面 (図 3) に高い特急 CXCR5 は cd4 CXCR5 表現に基づく明らかに+ T 細胞。一方、GL7、活性化 B 細胞のマーカーがまた CD4 で表されることがわかった+ CD19+ DP 細胞 (図 3 D)、 GC B 細胞のゲーティングとの干渉につながる可能性のあります。
図 4.のアルゴリズムをゲーティング TFH と GC B セルの例を示したものGC B 細胞のゲーティング、GL7 GL7 として GC B 細胞を識別する CD38 とラベリングを使用+ CD38- B 細胞 (図 4 aB)。PNA のラベル付けされる可能性があります GL723の代わりに対し、CD38 は以下のマーカーのいずれかで置き換えることができます: IgD、Bcl-6、および CD95。GC B 細胞に示されていますのために戦略をゲートの代替図 S1 。PPs の GC B セルの比率は、c57bl/6 マウスの大きな変動を示しています。しかし、他の Slo と比較して、PPs は定常条件の下で, B 細胞の 2-10% の範囲で有意に高い GC B セルの比率をあります。CD19 として記載されて PP TFH 細胞のための戦略をゲート- CD4+ PD 1こんにちはCXCR5+ T 細胞 (図 4 a, C)。TFH ゲーティング PD 1こんにちは人口より離散的に比べて他のプロット タイプ (図 4) を描いた、最適な実証方法「ゼブラ プロット」が見つかりました。出生率、Foxp3 を発現する TFH 細胞のサブセットは、CD19 としてゲートは- CD4+ PD 1こんにちはCXCR5+ Foxp3+ T 細胞 (図 4)。TFH 細胞画分が合計 CD19 の 10-20% の範囲と unimmunized マウス個体でも異なります GC B 細胞のような- CD4+ PP リンパ球。TFH 細胞のゲーティング アルゴリズムの詳細については、図 4 eFと図 S1C、d.
背景を染色し、蛍光による偽陽性を避けるためには、アイソタイプ コントロールまたは代替相当コントロールなど蛍光マイナス 1 つ (FMO) に含めるか染色パネル TFH と GC B 細胞マーカー (のネガティブ コントロールとして図 4-J)。
PP ティッシュの準備のための条件を最適化するため新たな内部で管理される実験的戦略、PPs が 1 つ個々 のマウスから採取したし、彼らの解剖学的起源に応じて別々 にプールを開発した (例えば.、十二指腸、回腸)。実験を実行すると、プールされた PPs のように各実験の個々 のグループに割り当てられた、コントロール グループごとの解剖学的領域 (図 5 a) から PPs の等しい数を含まれています。これにより、我々 が見つかりましたそのコラゲナーゼ ベースの酵素消化 (消化ミックスの 25 mL あたり II や IV コラゲナーゼの 37.5 mg でテスト = 1.5 mg/mL)、大幅に削減 CXCR5 様々 な粘膜組織からのリンパ球分離に使われる一般的TFH 細胞で特に PP リンパ球 (図 5 b) の式 (図 5 階-私)、一方、他の表面分子の発現 (e.g。、CD19、CD4) そのまま (図 5 C E) に残った。CXCR5 TFH のコラゲナーゼ処理細胞での発現はアイソタイプ コントロールからほとんど見分け CXCR5 検出の低減が顕著だった (図 5 階-私)。さらなる実験は、CXCR5 式の酵素の消化力の干渉レベルが CXCR5 抗体クローン使用 (図 6 a F) に依存していたことを示した。具体的には、コラゲナーゼ II 治療 CXCR5 抗体クローン 2 8 の検出能力は CXCR5 抗体クローン L138D7 (図 6 a D) の検出能力よりも、さらに障害。
酵素消化 CXCR5 の表現だけでなく、展示楽しみにして消化の PPs の側から分離した細胞のかなりの部分ながら、FSC SSC 特性によって決定される PP 細胞内総リンパ球の割合の減少PP リンパ球よりも高い強度のばらつき (図 7 a C).細胞回復に及ぼすコラゲナーゼの影響は用量依存的(図 7 a, H J)で発生しました。酵素の消化力は、細胞生存率(図 7, E)を増加しました。ただし、この利点は causatively にリンクされていないコラゲナーゼの消化力コラゲナーゼなし撹拌後 PPs から分離した細胞を同様に支持されたので(図 7 階).それは通常出生率セルを識別するために TFH 分離中に評価されるのでここで特に興味深いは、核転写因子 Foxp3、検出は、コラゲナーゼの消化力 (図 7 に関係なく 37 ° C で撹拌によって改善されました。).
図 1: 巨視的構造とパイエル板のマウスの解剖学的分布。(A). 胃と小腸の十二指腸側から得られた画像。十二指腸で 2 つの密接にある PPs は、黒の矢印で示されます。(B). 11 c57bl/6 マウスから収集した PPs は、12 ウェル プレートに個別に格納されていた。(C). 40 μ m の細胞ストレーナーに表示される新鮮な摘出マウス PPs のイメージ。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 流れのフローサイトメトリー解析と PP リンパ球の基本ゲート アルゴリズム。(A). ドット プロット (D) に示されている脾細胞に偉大な類似性を表わす FSC と SSC の軸に沿ってたて分離固定されていない PP リンパ球の分布を示します。(B). 7AAD 式による死んだ細胞の排除。7AAD-セルは生きているセルを表します。(C). ライブ PP 細胞事前ゲート CD19 との間で T および B 細胞の CD4 ベース診療。(E G)。リンパ球 PP 固定の代表的なフロー分析。(H) します。 固定脾細胞の代表的な流動特性。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: CD4+ CD19+二重肯定的な (DP) 細胞原因 TFH と GC B 細胞のゲーティングの偽陽性。(A)。CD4+CD19+ DP ライブ PP 細胞内リンパ球の例を示します。(B). 分離の DP 細胞はダブレットとシングレット FSC 特性に基づきます。(C,D)。CXCR5 と DP 細胞の GL7 式は、ヒストグラム ・ プロットで描かれています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: 代表 TFH と GC B 細胞のゲーティング戦略。3 月の古いマウスから採取した PPs とリンパ球がプロトコルのセクションで説明するように分離されました。 (A) CD19 と CD4 リンパ球 PP ライブのラベルに描かれています。(B) CD38lo GL7こんにちはCD19+ B 細胞は B 細胞としてゲートだった。(C) TFH 細胞だった CXCR5 としてゲート+PD 1こんにちはCD4+細胞。(D) TFR 細胞 TFH マーカーとともに規制細胞特異的転写因子 Foxp3 を発現する TFH 細胞の分画、CXCR5 としてゲート+ PD 1こんにちはFoxp3+ CD4+ T 細胞。(E ・ F)TFH の戦略をゲート脾細胞で確認された表面のマーカーは BCL 6 式 NP OVA 免疫マウスから分離しました。(G J)キー TFH 出生率および GC 細胞マーカーの蛍光マイナス 1 つ (FMO) コントロールが描かれています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: コラゲナーゼ ベースの酵素消化 CXCR5 検出の大規模な削減につながります。十二指腸 (≈ 1/3 近位)、空腸にある 2 ヶ月齢マウスから (A) PPs (≈ 1/3 ミドル) 回腸 (≈ 1/3 遠位) が収集し、別々 にプールします。プールされた PPs は実験群に均等に配られました。37 ° C で 10 分間撹拌を 1.5 mg/mL の濃度でコラゲナーゼ II や IV の酵素消化を行った(B E)ヒストグラム プロット コラゲナーゼ ベース消化を受けた PPs から分離された細胞表面の分子 (CXCR5、CD19、PD-1、CD4) の式を描いたします。(F-私)TFH ゲート内コラゲナーゼ投与群、ゼブラのプロットに示されてと。データは、3 つの独立した実験を表しています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 6: 反 CXCR5 抗体クローンによって大きな違いを示した CXCR5 式に及ぼすコラゲナーゼ。PP リンパ球 6 ヶ月齢マウス抗体に関するプールのさまざまなグループから収集した使用され、酵素消化アプリケーションのクローンを作成します。(A ~ F)TFH の細胞の割合はゼブラのプロットで描かれている内 CD19 ゲート ライブ、事前- CD4+ T 細胞。 (A、C 、 E) PP 細胞は抗マウス CXCR5 のビオチン化抗体で染色された (2 8 クローン)、ストレプトアビジン螢光色素 BV421 の共役と。 (B、DおよびF) PP 細胞は一次の共役抗マウス CXCR5 抗体 (L138D7 クローン) で染色しました。 (A B) TFH 未消化の PP のリンパ球からのプロットのゲートします。 (C D) PPs コラゲナーゼ II (消化ミックスの 20 mg/25 mL) と消化され、37 ° C で 10 分間攪拌データは、2 つの独立した実験を表しています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 7: コラゲナーゼ ベース消化と 37 ° C で撹拌細胞生存率、回復及び細胞内染色の効率に影響します。3 ヶ月齢の c57bl/6 マウスは犠牲になった;PPs は、収集され、プール5A を図で説明するよう。(A) PPs、組織のコレクションはコラゲナーゼ II (消化ミックスの 37.5 mg/25 mL) 10 分の存在下で攪拌した後、固定 PP 細胞の FSC と SSC の特徴は、(A) で描かれている (生存率プロットを染色が描かれています。D). (B, E) 撹拌または酵素の消化力; なし氷の上保たれた組織 PPs のコレクションの後(B) の固定、PPs 細胞の FSC と SSC の特性を示したものし、生存の染色、(E) で描かれています。(C, F)コラゲナーゼ; の不在で 37 ° C で 10 分間 125 150 rpm で攪拌した組織 PPs のコレクションの後FSC と SSC の特性、生存率は固定の PP 細胞の染色 (C, F) をそれぞれ描かれています。(G) 制御性 T 細胞由来のコラゲナーゼ管理せず興奮し unagitated PPs の Foxp3 発現比較ヒストグラム プロットで描かれています。(H J)PPs 6 ヶ c57bl/6 マウスから収集し、コラゲナーゼ II の濃度の異なる扱われた: 25 mL 消化ミックス、25 mL 消化ミックスまたはないコラゲナーゼあたり 15 mg あたり 25 mg を。酵素の消化力の PP 細胞の回復と収量に及ぼす影響を明らかにする FSC と SSC のプロットが描かれています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 8: 分子モデルと CXCR5 の完全なアミノ酸シーケンス。(A) 7 パス CXCR5 の膜貫通タンパク質の構造をモデル化します。 (B) CXCR5 の完全なアミノ酸シーケンスを示した。細胞外領域のシーケンスは赤で示され、想定コラゲナーゼ敏感な化学結合と細胞外アミノ酸 - 黄色で示した。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| 抗原 | クローン | Fluourochrome | 希釈 |
| CD4 | GK1.5、RM4 5 | APC、PECy7、PerCpCy5.5、FITC | 1: 100 |
| CD19 | 6 5 | FITC、APC/Cy7 | 1: 100 |
| PD 1 | J43 | PE ef 610 (テキサス赤) | 1: 100 |
| アイコス | 15 F9 キーを 7E.17G9 | PE | 1: 100 |
| GL7 | GL7 | PerCp/Cy5.5 | 1: 75 |
| CXCR5 | 2 8、L138D7 * | ビオチン | 1:50 |
| BCL 6 | 7 1 | PE/Cy7 | 1:50 |
| FOXP3 | FJK 16 | APC、PE | 1: 100 |
| ストレプトアビジン | - | BV421、PE | 1: 100 |
| FixableViability 色素 | - | BV 510(AQUA) | 縮尺 |
| 7AAD | - | PerCp/Cy5.5 | 1: 500 |
| FcBlock (CD16/32) | 2.4G2 | - | 1: 200 |
表 1: 抗体の概要。希釈、クローンおよび螢光色素動詞関連抗体と生存率染料は示されます。最適な希釈は実験条件と製品のロットの品質に応じて異なる場合があります。1:20 でプライマリ BV421 共役 L138D7 クローン、ビオチン化 2 8 に匹敵する CXCR5 検出能力を示した希釈 1:50 時点のクローン希釈。したがって、プライマリ共役 L138D7 をビオチン化する代替 2 8 として使用できますクローン。
図補足 1 (S1): 代替 TFH と GC B 細胞のための戦略をゲーティングします。(A) C57BL/6 背景に 3 ヶ月齢マウスから住んでいる PP リンパ球が描かれています。(B ・ C)GC B 細胞は CD38 としてゲートは- GL7+ (B) と BCL-6+ GL7+ B 細胞 (C)。(D E)TFH 細胞が PD 1こんにちはCXCR5 として描かれている+ (D) とアイコス+CXCR5+ cd 4 + T 細胞 (E)。このファイルをダウンロードするここをクリックしてください。
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Discussion
ここでは、TFH および GC B 細胞の流れフローサイトメトリー評価のために最適化されたプロトコルについて述べる。プロトコルの主要な利点の 1 つは、任意の消化プロセスがなければ最大 107 (平均 4-5 x 10 の6セル) 単一のマウス (C57BL/6 ひずみ) から合計 PP 細胞の分離できます。総細胞収量が PPs の数と正の相関は、実験計画のために有用である次の単純な式から推定することができる観察:"マウスあたり合計 PP 細胞数 = 0.5-1 x (摘出 PPあたりの数マウス) x 106"。この高い細胞収量が強化されたセル実行可能性に補完された (> 95%)。改良された細胞の回復と生存率並列でパネルを染色多様な抗体を用いた PPs の各種リンパ球サブセットのフローサイトメトリーによる解析を実行することを許可しました。
最近の PP 隔離のプロトコルでは、De イエスら刊と比較。20と前レポート19,21、我々 のプロトコルは、かなり高い総細胞収量およびコラゲナーゼの消化力の不在にもかかわらず、生存率を与えた。PPs の識別は、「トリッキーな」初めて捜査のため可能性があります、このプロトコルの学習曲線はかなり急、本手法により短期間で同定と小腸から PPs の外科的切除、マスターされた場合、時間。最初の試行後、PP 数に達していない場合は、SI の遠位と近位端に焦点を当て、PP を識別する手順を繰り返しすることをお勧めします。ほぼすべてのマウスで、我々 の練習で十二指腸の端 (図 1 a) に 2 つの近接 PPs と回腸の最後 5 cm 以内の少なくとも 2-3 安いた検出。
TFH 染色注意18必要になるため、PPs 内他の細胞のサブセットより厳しいことができます。特定の手順は、ティッシュの処理および細胞の分離に逃している、結果がかなり誤解を招く可能性があります。したがって、私達は研究者次の「ヒント」が実験的に注意を払うことを提案します。キーの TFH と GC B 細胞マーカー以来、CXCR5 と GL7 B および T 細胞で表現できるように、汚染の CD19 のための偽肯定的な結果を避けるために抗体パネルの B 細胞マーカーを含めることが重要です+CD4+ DP 細胞24 (図 2)。T 細胞マーカーに基づく戦略をゲートだけでこれらの細胞も強く表現 T 細胞マーカー CD3 を含むので、25は DP 細胞の十分な排除を提供しませんを注意してください (データは示されていない) および CD4。流れの cytometry の結果の検証し、適切なネガティブ コントロールを用いた確認 DP 細胞の排除、に加えて (e.g。、アイソタイプ コントロール、FMOs)。偽陽性だけでなく、見当違い TFH ゲート偽の結果と結論につながることができます。特に TFH セル人口は cytometry 流れの離散人口として表示されないことにより豊富なではない場合、TFH ゲートの調整を困難な時が。複数の TFH マーカーの追加は、この制限を回避するために (e.g。 BCL 6、PD 1、アイコス) 抗体にパネルが代替のゲーティング機会を提供し、精度26を増やします。実用的な理由から BCL 6 は代替 TFH ゲーティングの理想的な共同染色マーカー GC B ゲートの使用できるので細胞同時に16 (図 S1C) ことが判明しました。
さらに、TFH の割合が高いを含む肯定的な制御サンプルを持つことができるナビゲーションを提供研究者良い TFH ゲートを正しく配置するため。我々 の実験で PP のサンプルを使用して肯定的な制御として老齢マウス (6 ヶ月以上) から高齢化は、合計 CD4 の 40% まで PPs 内 TFH 細胞の強化を引き起こすことを見出したので+ T 細胞の定常状態 (データは示されていない)。我々 はまたさらに TFH を染色18TFH セルの公開されているプロトコル本の方法見て染色の技術的な詳細に興味がある研究者を奨励します。
Pp 実験仮説検定は比較的困難なことができ、統計的有意性21に到達するグループごとマウスの非常に高い数を必要があります。プロトコルの高い細胞収量を利用して我々 は次の実験的方法によって、この障害を回避しました。まず、PPs を摘出し、彼らの解剖学的起源に応じてそれらを別々 にソート (e.g。、十二指腸、空腸、回腸)。我々 は、これらのプールされた PPs 別に実験および制御グループを均等に分散。この内部制御の実験的戦略では、間のすべてのセルが単一のマウスから得られたマウスの個体間違いを最小限に抑えることができました。
さらに、別の腸内コンパートメント間変動 (e.g、十二指腸vs。 回腸)-以前重要な2であると報告-実験としては防がれたあたり PPs の等しい数から成っていた制御グループと。解剖学的領域 (図 5 a).同じアプローチを使用しての独立実験の複製を実行すると、我々 は信頼性と我々 の結果の重要性を改善しました。非特異的変化を排除すること、に加えてこの方法論は予備マウス、試薬および時間にも役立ちます。
コラゲナーゼ消化の II および IV ベース著しく減少 CXCR5 検出 TFH の他の表面の分子の表現 (図 5 b)、B 細胞のままそのまま (開発およびプロトコルの最適化、中に我々 の結果を明らかにしました。図 5-E).最近報告されたゼウス プロトコル19, コラゲナーゼ II は PPs の Lp からのリンパ球分離のため非常に効果的であること示されました。ただし、コラゲナーゼ II は以前いくつかの表面の分子の開裂の結果、高いトリプシンの活動が報告されています。コラゲナーゼ IV は、コラゲナーゼ II に加えて含まれてもされていた文学28,29,30で考えるとその表面分子友好的な性質27低トリプシン活性とより一般的な使用のためで我々 の研究、これらの以前のレポートを参考に、濃度で使用します。コラゲナーゼと同等の酵素の使用変更など免疫細胞表面分子式31,27消化の不必要な効果による粘膜免疫学の矛盾した問題となっています。
以前、コラゲナーゼのさまざまな種類の使用が流れフローサイトメトリー法によるひと腸内32および扁桃サンプル18CXCR5 検出と干渉する可能性が報告されました。逆に、他の研究は、コラゲナーゼ24,33を使用せず PPs からの TFH と GC B 細胞の分離を示した。しかし、今まで包含または除外コラゲナーゼの消化力のマウス安マウス CXCR5 から CXCR5 表現 TFH 細胞の分離の最適条件となるかどうかを評価するためにない比較アプローチを実施したは 374 アミノ酸長い 7 パス膜蛋白質 CD4、PPs (UniProt から得られたデータ) リンパ様細胞に豊富に表現される CD19 など他の膜貫通蛋白質と比較して比較的短い細胞外領域を持つ。図 8 a・ Bは、分子モデルと消化のコラゲナーゼ ベースの推定ターゲット シーケンスと CXCR5 が描かれているマウスの全アミノ酸配列、グリシン (Gly) と中性アミノ酸間の化学結合を分離する傾向があります。酸34。7 パス膜分子構造作成された短い細胞外ドメインは酵素消化 (図 8 a) に脆弱性が存在 CXCR5 分子を作るための責任かもしれない。興味を持って、コラゲナーゼ処理が使用される抗体クローンに依存した後その検出 CXCR5 式がわかった。L138D7 クローン明らか CD4 内 TFH 細胞 (≈ 9%) 高い割合 x 3 約 2 8 と L138D7 クローン消化 PP グループでの同等の TFH 分数の検出によって決定される未消化の PP グループで同じような性能を示したが,+2 8 よりも T 細胞クローン (≈ 3%)(図 6)。この発見は、減らされた CXCR5 染色かもしれないコラゲナーゼの酵素活性によって変更された三次元エピトープ構成にセカンダリことを示唆します。PP の準備中にコラゲナーゼ ベース消化を避けなければならないことが示唆されました。
CXCR5 分子検出コラゲナーゼ解離の干渉は、消化手順を除くによって阻止されました。しかし、LP などのいくつかの組織、機械的破壊ではないセルを隔離するための十分なこのような組織の酵素の消化力の必要な19になります注意する必要があります。今後、酵素消化プロセスを必要とする組織のこの技術的な制限をバイパスする消化互換抗体クローンと同様に、代替消化条件をテストするのには不可欠ででしょう。それまでは、免疫蛍光顕微鏡などのイメージング技術の選択のこれらのティッシュの TFH 検出法としてままになります。LP のセルを分離する、に加えて DCs と PPs からプラズマ細胞など一部の造血細胞サブセットの分離酵素消化35が必要です。我々 のプロトコルを採用し、PPs からこれらの細胞のサブセットを分離することを望む者は適切な酵素消化手順20を含める必要があります。DC マーカーの発現と酵素消化可能な干渉を考慮する必要があります、必要に応じて消化条件を最適化する必要があります。コラゲナーゼ消化36, PPs の各マウスから収集を必要とする細胞サブセットに加えて TFH と GC B 細胞の分離が必要なときは、並列パネルでコラゲナーゼ処理の処理のための 2 つのグループに分けることができます。
PP のリンパ球に及ぼすコラゲナーゼの影響は表面の分子式に制限でした。我々 の結果は、酵素消化が用量依存的 (図 7) に PP 細胞内リンパ球の割合の相対的な減少を引き起こしたことを明らかにしました。リンパ球分画の減少が大きく、リンパ球よりも細かい PPs から食や Dc などの造血細胞のサブセットの他のタイプのコラゲナーゼを介したリリースの結果である可能性があります。コラゲナーゼの消化力から LP を隣接セル リリースを仲介し、上皮内コンパートメント FSC SSC プロファイルの変更に貢献するかもしれない可能です。その他の腸の仕切りからこの細胞汚染可能性も PP リンパ球の流れ解析における干渉をあります。その上で、細胞の純度を最大限にも回避上皮細胞と粘液20、抽出に広く使用されている EDTA など DTT 試薬添加生理と可能な限り非操作組織調製条件を維持します。酵素の消化力のこれらの副作用、にもかかわらず PP リンパ球に有益な効果は細胞内染色と細胞生存率 (図 7-F G) の改善なども発見されました。しかし、さらに分析を明らかにしたこれらの効果は、細胞生存率、細胞内 Foxp3 染色細胞で攪拌したときに匹敵する程度、支持されたので、酵素消化とは無関係の 37 ° C で撹拌プロセスに帰因したことコラゲナーゼの不在。機械論的に、腸内容と PPs からの粘液の改良された除去のため撹拌の有益な効果があります。
要約すると、安分離された細胞流れフローサイトメトリー評価いくつかの細胞のサブセットのため染色するまたはことができます細胞選別を受けるでき様々 なでその後採用からのリンパ球の隔離のための合理化されたプロトコルについて説明しましたin vitro におけると生体内機能アッセイ。
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Disclosures
利害の対立が宣言されていません。
Acknowledgments
役に立つ議論のローラ シュトラウス、ピーター ・ セージを感謝し、フローサイトメトリー解析でサポートしたいと思います。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-mouse CD4 antibody | eBioscience, Biolegend* | 17-0041-81 ,10054* | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse CD19 antibody | eBioscience | MA5-16536 | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse PD-1 antibody | eBioscience | 61-9985-82 | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse ICOS antibody | eBioscience | 12-9942-82 | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse GL7 antibody | Biolegend | 144610 | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse CXCR5 antibody | Biolegend*, BD Bioscience | 145512*, 551960 | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse BCL-6 antibody | Biolegend | 358512 | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse Foxp3 antibody | eBioscience | 17-5773-82 | For detailed information see Table 1 |
| Streptavidin-BV421 | BD Bioscience | 563259 | For detailed information see Table 1 |
| FixableViability Dye | eBioscience | L34957 | For detailed information see Table 1 |
| 7AAD | Biolegend | 420404 | For detailed information see Table 1 |
| FcBlock (CD16/32) | BD Bioscience | 553141 | For detailed information see Table 1 |
| Collagenase II | Worthington | LS004176 | |
| Collagenase IV | Worthington | LS004188 | |
| Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set | eBioscience | 00-5523-00 | |
| 6-well,12-well & 96-well plates | Falcon/Corning | 353046,353043/3596 | |
| 50 mL conical tubes | Falcon | 3520 | |
| 40 µm cell strainer | Falcon | 352340 | |
| 10 mL syringe-plunger | Exel INT | 26265 | |
| RPMI | Corning | 15-040-CV | |
| PBS | Corning | 21-040-CM | |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Orbital shaker | VWR | Model 200 | |
| Curved-end scissor | |||
| Fine Serrated Forceps | |||
| Small curved scissor |
References
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