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Neuroscience

Méthode autoradiographique quantitative pour la détermination des taux régionaux de synthèse des protéines cérébrales In Vivo

Published: June 28, 2019 doi: 10.3791/58503
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Section on Neuroadaptation and Protein Metabolism, National Institute of Mental Health, National Institutes of Health

Summary

La synthèse des protéines est un processus biologique essentiel pour les cellules. Dans le cerveau, il est nécessaire pour les changements adaptatifs. La mesure des taux de synthèse des protéines dans le cerveau intact nécessite des considérations méthodologiques soignelées. Ici nous présentons la méthode autoradiographique quantitative de L-[1-14C]-leucine pour déterminer des taux régionaux de synthèse cérébrale de protéine in vivo.

Abstract

La synthèse des protéines est nécessaire pour le développement et le maintien de la fonction neuronale et est impliquée dans les changements adaptatifs dans le système nerveux. En outre, on pense que la dysrégulation de la synthèse des protéines dans le système nerveux peut être un phénotype de base dans certains troubles du développement. La mesure précise des taux de synthèse des protéines cérébrales dans les modèles animaux est importante pour comprendre ces troubles. La méthode que nous avons développée a été conçue pour être appliquée à l'étude des animaux éveillés et se comportant. Il s'agit d'une méthode autoradiographique quantitative, de sorte qu'il peut produire des taux dans toutes les régions du cerveau simultanément. La méthode est basée sur l'utilisation d'un acide aminé traceur, L-[1-14C]-leucine, et un modèle cinétique du comportement de L-leucine dans le cerveau. Nous avons choisi L-[1-14C]-leucine comme traceur parce qu'elle ne conduit pas à des produits métaboliques étiquetés par des produits non-terrestres. Il est soit incorporé dans les protéines ou rapidement métabolisé pour produire 14CO2 qui est dilué dans un grand pool de CO2 non étiqueté dans le cerveau. La méthode et le modèle permettent également la contribution de la leucine non étiquetée dérivée de la protéolyse tissulaire au pool de précurseurs tissulaires pour la synthèse des protéines. La méthode a la résolution spatiale pour déterminer les taux de synthèse des protéines dans les couches cellulaires et neuropil, ainsi que les noyaux hypothalamiques et crâniens nerf. Pour obtenir des données quantitatives fiables et reproductibles, il est important d'adhérer aux détails de la procédure. Ici, nous présentons les procédures détaillées de la méthode quantitative autoradiographique L-[1-14C]-leucine pour la détermination des taux régionaux de synthèse des protéines in vivo.

Introduction

La synthèse des protéines est un processus biologique important requis pour un changement adaptatif à long terme dans le système nerveux1. L'inhibition de la synthèse des protéines bloque le stockage de la mémoire à long terme chez les invertébrés et les vertébrés2. La synthèse des protéines est essentielle pour le maintien des phases tardives de certaines formes de potentialisation à long terme (LTP) et de dépression à long terme (LTD)3, survie neuronale pendant le développement4, et pour le maintien général du neurone et de ses connexions synaptiques5. La mesure des taux de synthèse des protéines cérébrales peut être un outil important pour étudier les changements adaptatifs ainsi que les troubles neurodéveloppementaux et les troubles liés à l'apprentissage et à la mémoire.

Nous avons développé une méthode pour quantifier les taux de synthèse des protéines cérébrales in vivo chez un animal éveillé qui offre des avantages inhérents à d'autres techniques qui estiment les taux de préparations ex vivo ou in vitro des tissus cérébraux6. Le premier est l'applicabilité aux mesures dans le cerveau intact dans un animal éveillé. Il s'agit d'une considération clé, car il permet des mesures avec la structure synaptique et la fonction en place et sans préoccupations au sujet des effets post mortem. En outre, l'approche autoradiographique quantitative que nous employons atteint un degré élevé de localisation spatiale. Alors que l'énergie de 14C est telle que nous ne pouvons pas localiser le traceur au niveau subcellulaire ou cellulaire, nous pouvons mesurer les taux dans les couches cellulaires et les petites régions du cerveau telles que les noyaux hypothalamiques, avec environ une résolution de 25 m7.

Un défi des mesures in vivo avec des radiotracers est de s'assurer que l'étiquette radio mesurée est dans le produit de la réaction d'intérêt plutôt que le précurseur étiqueté non réagi ou d'autres produits métaboliques étiquetés non associés6. Nous avons choisi L-[1-14C]-leucine comme acide aminé traceur parce qu'il est soit incorporé dans la protéine ou rapidement métabolisé à 14CO2, qui est dilué dans le grand pool de CO2 non étiqueté dans le cerveau résultant du taux élevé de métabolisme énergétique8. En outre, tout 14C non incorporé dans la protéine existe principalement comme libre [14C]-leucine, qui au cours de la période expérimentale de 60 min, est presque entièrement effacé du tissu6. Les protéines sont ensuite fixées aux tissus avec formaline et ensuite rincées avec de l'eau pour enlever toute leucine libre[14C]-leucine avant l'autoradiographie.

Une autre considération importante est la question de la dilution de l'activité spécifique du pool d'acides aminés précurseurs par des acides aminés non étiquetés dérivés de la protéolyse tissulaire. Nous avons montré que chez le rat et la souris adultes, environ 40% du bassin précurseur de leucine pour la synthèse des protéines dans le cerveau provient d'acides aminés dérivés de la dégradation des protéines6. Ceci doit être inclus dans le calcul des taux régionaux de synthèse des protéines cérébrales (RCPS) et doit être confirmé dans les études dans lesquelles cette relation peut changer. La base théorique et les hypothèses de la méthode ont été présentées en détail ailleurs6. Dans le présent document, nous nous concentrons sur les questions de procédure de l'application de cette méthodologie.

Cette méthode a été utilisée pour la détermination de rCPS chez les écureuils terrestres9, moutons10, singes rhésus11, rats12,13,14,15,16 , 17 Annonces , 18 ans, états-unis qui , 19 ans, états-unis qui , 20 Ans, états-unis , 21, un modèle de souris de tubercule la sclérose complexe22, un modèle de souris du syndrome X fragile23,24,25,26, fragileX souris prémutation27, et un modèle de souris de phénylketonuria28. Dans ce manuscrit, nous présentons les procédures de mesure de rCPS avec la méthode autoradiographique in vivo L-[1-14C]-leucine. Nous présentons rCPS dans les régions de cerveau d'une souris de contrôle éveillée. Nous démontrons également que l'administration in vivo de l'anisomycine, un inhibiteur de la traduction, abolit la synthèse des protéines dans le cerveau.

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Protocol

Remarque : Toutes les procédures relatives aux animaux ont été approuvées par le Comité national des soins et de l'utilisation des animaux en santé mentale et ont été exécutées conformément aux Lignes directrices des National Institutes of Health sur les soins et l'utilisation des animaux.

Un aperçu du protocole est présenté à la figure 1.

1. Implanter chirurgicalement des cathéters dans une veine fémorale et une artère pour l'administration du traceur et la collecte des échantillons de sang artériel chronométrés, respectivement. Chirurgie complète d'au moins 22 h avant l'administration du traceur. La chirurgie nécessite environ 1 h pour terminer.

  1. Rassembler les matériaux nécessaires : instruments chirurgicaux stériles (ciseaux chirurgicaux, micro-ciseaux, forceps, trois crochets chirurgicaux pour la peau), équipement pour l'anesthésie isoflurane (vaporisateur d'isoflurane, charognard actif de gaz, chambre d'anesthésie scellée, anesthésie cône nasal), stade de chirurgie stérile, tondeuses à fourrure, 70 % d'éthanol, de bétadine, gaze stérile, ruban chirurgical, chauffe-mains commerciaux, microscope chirurgical, chlorure stérile de 0,9 % de sodium (saline), héparine stérile 100 unités USP/mL en chlorure de sodium de 0,9 % (heparinisé saline), stérile cinq bandes de 20 cm de suture absorbable de 6-0, brins stériles de 25 cm de PE-8 et PE-10 cathéters en polyéthylène avec une extrémité coupée à 45o, seringues stériles de 1 cc, aiguilles stériles de 32 jauges, équipement de cautérisation, stérile15-20 cm creux en acier inoxydable tige d'acier (2,5 mm de diamètre intérieur, 3 mm de diamètre extérieur), anesthésiques locaux (onimite de bupivane et de lidocaïne), et enclos animal avec configuration d'appendice pivotant (30 cm d'attache de ressort avec bouton, pivot, monture pivotante et bras, 20 X 13 cm cylindrique clair conteneur).
  2. Préparer l'animal pour la chirurgie.
  3. Assurez-vous que les techniques aseptiques et stériles appropriées sont utilisées selon les besoins de votre établissement.
    1. Pesez l'animal. L'animal doit être d'au moins 25 g pour une chirurgie réussie.
    2. Placez l'animal à l'intérieur d'une chambre en plexiglas scellée et connectez la chambre à l'appareil d'anesthésie isoflurane. Fixer le débit à 2,5 L/min pour les mâles et à 3,0 L/min pour les femelles de 1,5 % d'isoflurane dans O2. Après environ 2 min, assurez-vous que la souris est correctement sédative par l'absence d'un réflexe de retrait avec une pincée d'orteil.
    3. Une fois sous sédatif, retirez la souris de la chambre et placez-la en position couchée avec son visage à l'intérieur du cône nasal d'anesthésie. Installez le cône de nez pour recevoir le gaz du vaporisateur et pour retourner le gaz au charognard. Le charognard capturera l'isoflurane dans un filtre à charbon de bois.
    4. Utilisez des tondeuses pour raser la fourrure entre les omoplates. Assurez-vous de stériliser correctement la région rasée, en alternant trois fois entre les gommages de bêtadine et d'éthanol.
    5. Retournez la souris dans une position de supine en gardant le visage dans le cône de nez. Tapez la jambe gauche sur le stade de la chirurgie et utilisez des tondeuses pour raser la fourrure de la cuisse interne gauche à l'abdomen gauche supérieur. Assurez-vous de stériliser correctement la région rasée, en alternant trois fois entre les gommages de bêtadine et d'éthanol.
    6. Faites glisser sous la souris un chauffe-mains activé disponible dans le commerce, enveloppé dans de la gaze. Tapez la jambe droite sur le stade de la chirurgie.
  4. Insérer le cathéter dans la veine fémorale gauche.
    1. À l'aide d'un microscope chirurgical, utilisez des ciseaux chirurgicaux pour faire une incision de 1 cm de la partie médiale supérieure de la cuisse gauche rostalement vers la ligne médiane, révélant l'artère fémorale et la veine.
    2. Retirez la peau lâche avec des crochets chirurgicaux pour exposer davantage les vésicules.
    3. Appliquer du chlorure de sodium stérile de 0,9 % sur la zone exposée pour maintenir une humidité adéquate.
    4. Utilisez des forceps pour émousser le disséquement, séparant le tissu conjonctif autour d'une petite section de l'artère fémorale et de la veine. Soigneusement, séparer l'artère et la veine (Figure 2).
    5. Utilisez des forceps pour enfiler un brin de suture absorbable (Strand A) sous la veine fémorale et l'artère au point le plus latéral de l'incision. Tirez la suture à mi-chemin à travers de sorte que les extrémités sont égales.
    6. À un point plus proximal à l'aine, utiliser des forceps pour enfiler une deuxième suture (Strand B) sous seulement la veine fémorale. Attachez doucement un demi-noeud qui sera utilisé pour restreindre la circulation sanguine.
    7. À un point entre le brin A et le brin B, utilisez des forceps pour enfiler une troisième suture (Strand C) sous seulement la veine fémorale. Attachez doucement un noeud complet qui sera utilisé pour restreindre la circulation sanguine. Veillez à ne pas déchirer la veine.
    8. Tirez doucement sur le brin B pour limiter la circulation sanguine. Utilisez un hemostat pour tirer doucement Strand B pour maintenir la circulation sanguine restreinte.
    9. Couper un petit trou dans la zone restreinte de la veine fémorale avec des microscissors et insérer soigneusement l'extrémité inclinée du tube PE-8 (précédemment rincé avec de l'héparine saline) vers le brin B. Une fois inséré, relâchez la tension de Strand B et guidez le cathéter plus haut dans la veine. Resserrer le brin B autour de la veine contenant le cathéter.
    10. À l'aide du brin C, nœuer un noeud supplémentaire autour du cathéter. Assurez-vous que ce noeud ne capte pas l'artère fémorale.
    11. Retirez doucement sur le baril de seringue pour remplir partiellement le tube de sang pour s'assurer que le cathéter a été implanté correctement.
  5. Après la même procédure, insérez un cathéter PE-10 dans l'artère fémorale gauche.
  6. Procédure chirurgicale complète.
    1. Une fois que les cathéters de veine fémorale et d'artère ont été fixés, attachez le brin A dans un noeud autour des deux cathéters.
    2. Couper tous les points de suture excédentaires et enlever les crochets de peau. Rincer le cathéter artériel avec de la saline héparinisée pour éviter la coagulation. Cauteriser les extrémités des deux cathéters pour créer un joint.
    3. Placez la souris en position couchée et faites une petite incision à la base du cou et appliquez saline sur la zone exposée.
    4. Insérer la tige de métal creuse subdermally de l'incision de cou à l'incision fémorale. Serpentez les cathéters à travers la tige creuse et hors de l'incision du cou. Retirez la tige creuse. L'implantation subderformelle des cathéters empêchera les souris d'endommager les cathéters.
    5. Appliquer la bupivacaine sur les côtés de la plaie. Fermer l'incision fémorale avec de la suture. Ajouter la pommade de lidocaïne sur la plaie fermée et suture.
    6. Serpentez les cathéters à travers un tube creux flexible de 30 cm (attache de ressort) et suturez le bouton de l'attache de ressort sous la peau. Appliquer la bupivacaine sur les côtés de la plaie. Suturer le bouton de l'attache de ressort sous la peau. Ajouter la pommade de lidocaïne sur la plaie fermée et suture.
    7. Déplacer la souris dans un récipient cylindrique clair (20 cm de haut, 13 cm de diamètre) avec une monture pivotante et un bras pour loger l'animal pendant la période de récupération. Placez un chauffe-mains sous le récipient pour garder l'animal au chaud.
    8. Visser le haut de l'attache de ressort à un pivot et fixer le pivot vers le bras pivotant attaché au récipient cylindrique. Assurez-vous que la souris a une gamme complète de mouvement et les cathéters peuvent être consultés.
    9. Placez un couvercle à fentes qui n'interfère pas avec le mécanisme pivotant au-dessus de l'enclos des animaux. Reportez-vous à la figure 3 pour la configuration complète.
    10. Laisser la souris récupérer. Au moins 22 h est recommandé.

2. Préparer l'onde L-[1-14C]leucine pour l'injection et 16 % (w/v) solution de déshydratation à 5 sulfosalicyliques (SSA) pour la déprotéinification des échantillons de plasma. Dans la solution SSA, inclure également 0,04 mM de norleucine et 1 'Ci/mL [H3]leucine comme normes internes pour l'analyse des acides aminés et l'analyse de la concentration de traceurs dans les fractions plasmatiques solubles dans l'acide, respectivement. Conserver l'ESS jusqu'à deux mois à 4 oC.

  1. Acheter l'al-[1-14C]leucine disponible dans le commerce (50-60 mCi/mmol), qui est vendu comme solution en éthanol à 2 % ou 0,1 N HCl. Soufflez sécher une activité connue du traceur sous un doux flux d'azote et reconstituer dans une solution de saline normale stérile fabriquée jusqu'à une concentration de 100 'Ci/mL.

3. Administrer L-[1-14C]leucine par voie intraveineuse et recueillir des échantillons de sang artériel.

  1. Rassembler les matériaux nécessaires : 18 microtubes de 1,5 ml pour la déprotéinisation des échantillons de plasma (ajouter 70 mL d'eau déionisée à chaque tube), 17 insertions de flacons de verre de 250 ml (15 inserts pour la collecte d'échantillons de sang artériel et 2 inserts pour la collecte de sang mort-vivant à être réinjectés. Pour limiter la collecte de sang supplémentaire et inutile, de petits inserts minces de flacon de verre avec des fonds effilés qui permettent le pipetting accessible du plasma supernatant est recommandé), 2 tubes microcapillaires (32 X 0.8mm, pour la mesure d'hématocrit), 1 héparine et tube microcentrifuge enduit de fluorure de lithium (pour prévenir la coagulation et la glycolyse, respectivement), hemostats (couvrir les pointes avec des tubes de tygon de sorte que les pinces n'endommageront pas les tubes PE), moniteur de glycémie, transduceur de pression artérielle, 1 mL de seringues stériles (pour solution d'euthanasie disponible dans le commerce (dilué1:1 dans de l'eau déionisée (pour les souris)).
  2. Assurez-vous que l'animal est dans un état physiologique normal au début de l'expérience.
    1. Clamp le tube artériel à environ 2 cm de l'extrémité et couper la pointe, créant une ouverture pour le sang à couler. Ensuite, dépincez les tubes et collectez du sang mort dans l'espace ((c. 30 ml) pour recueillir tout salin résiduel et/ou sang des prélèvements précédents) et, dans un tube séparé, recueillez un échantillon témoin (environ 30 l), des échantillons d'hématocrit (environ la moitié du volume du tube capillaire) et un glucose (environ 20 l).
    2. Mesurer l'hématocrit en branchant une extrémité avec du mastic et de la centrifugeuse scellants pendant 1 min à 4500 x g. Mesurer le rapport du volume des globules rouges au volume sanguin total. Si un animal a un hématocrit inférieur à 30%, ne poursuivez pas l'étude.
    3. Utilisez un moniteur de glycémie disponible dans le commerce pour mesurer le taux de glucose dans une goutte de sang.
    4. Échantillon de contrôle centrifugeuse pendant 2 min à 18 000 x g pour séparer le plasma. Déprotéiculer les échantillons de plasma comme suit : ajouter 5 l de plasma à 70 l d'eau déionisée dans un microtube de 1,5 ml, ajouter 25 l de la solution SSA de 16 % et du vortex. Placer sur la glace pendant 30 min avant de geler sur de la glace sèche.
    5. Retournez le sang mort de l'espace à l'animal par la ligne veineuse, suivi d'une chasse d'eau saline héparinisée pour empêcher la perte de sang excédentaire.
    6. Connectez la ligne artérielle à un transducteur de tension artérielle pour mesurer la tension artérielle moyenne.
    7. Après avoir pris les échantillons assurez-vous de re-serrer la ligne artérielle et de rincer la ligne avec un petit volume (50 ml) de saline héparinisée.
  3. Administrer le traceur par voie intraveineuse et recueillir des échantillons de sang artériel chronométrés.
    1. Utilisez un connecteur Y pour attacher une seringue avec le traceur (100 ci/kg) et une seringue avec saline stérile de 50 ml pour rincer la ligne veineuse après l'injection de traceur. Connectez Y-connecteur à la ligne veineuse.
    2. Lancez l'étude en commençant simultanément un chronomètre et en injectant le traceur. Rincer la ligne veineuse avec de la saline (c. 100mL) immédiatement après l'injection.
    3. Recueillir des échantillons de sang 1-7 en continu tout au long des 2 premières min de l'expérience de la même manière. Après avoir prélevé le 7e échantillon, prélever 30 ll de sang mort-espace avant chaque échantillon restant. Les échantillons 8-14 sont recueillis à 3, 5, 10, 15, 30, 45 et 60 min, respectivement.
    4. Traiter les échantillons de sang immédiatement après la collecte, tel qu'il a été décrit pour l'échantillon témoin. En cas de retard, placez les échantillons sur la glace. Réinjectez soigneusement le sang mort d'espace dans l'artère par l'intermédiaire du cathéter artériel et rincer avec la saline d'héparine.
    5. À un moment donné au cours de l'expérience, traiter trois normes internes en ajoutant 25 L 16% SSA, 0,04 mM norleucine, et 1 mCi/mL [3H]leucine à 75 'L eau, vortex et place sur la glace.
    6. Après avoir recueilli le 14e échantillon à 60 min, injecter environ 0,2 ml de B-euthanasie-D dans la ligne veineuse pour euthanasier l'animal. Enregistrez l'heure de la mort.
    7. Dévisser l'animal de la monture pivotante et retirer de l'enclos des animaux. Retirez soigneusement le cerveau, placez-le sur du papier d'aluminium et congelez-le sur de la glace sèche. Ne gèlez pas les cerveaux avec de l'azote liquide car le cerveau peut se fissurer. Entreposez le cerveau, les échantillons et les normes internes à -80 oC jusqu'à ce qu'il soit prêt pour le traitement. Le traitement peut être effectué à tout moment par la suite.

4. Analyser les concentrations de leucine et de L-[1-14C]leucine dans des échantillons de plasma.

  1. Dégel des échantillons et des normes internes sur la glace, le vortex et la centrifugeuse 18 000 x g pendant 5 min à 2 oC. La fraction supernatant contiendra la leucine libre étiquetée et non étiquetée.
  2. Transférer 40 l de supernatant dans un flacon de scintillation liquide et ajouter le cocktail de scintillation. Quantifier les désintégrations par min (DPM) de 3H et 14C au moyen du comptage de la scintillation liquide et d'une courbe d'étance conçue pour le comptage simultané à double étiquette (3 H et 14C).
  3. Pour quantifier les concentrations plasmatiques de leucine, utilisez un système HPLC avec une colonne d'échange de cation de sodium et une dérivatisation post-colonne avec o-phthaldéhyde et détection fluorométrique.
    1. Définir HPLC selon les spécifications suivantes : excitation fluoromètre de 330 nm et émission de 465 nm. La phase mobile se compose de l'éluant de sodium, pH 7,40, et de l'éluant de sodium - 5% sulfolane, pH 3.15. Définir le débit tampon de 0,400 ml/min et le débit de l'instrument de dérivation à 0,300 ml/min. Fixer la température de la colonne à 48 oC et la température du réacteur à 45 oC.
    2. Calibrer le système avec une gamme de concentrations d'acides aminés (y compris la norleucine) entre 30 et 500 pmol/10mL. La courbe d'étalonnage est linéaire. Les concentrations d'acides aminés des échantillons d'injection testés de 10 ml se situent dans les fourchettes de cette courbe d'étalonnage.

5. Effectuer l'autoradiographie quantitative.

  1. Préparer des sections cérébrales de 20 m d'épaisseur pour l'autoradiographie. Section du cerveau au moyen d'un cryostat à -20 oC.
  2. Décongeler les sections du cerveau en série sur des lames recouvertes de gélatine. L'air sec.
  3. Laver les glissières en cinq changements de formaline de 10 % pendant 30 min par changement, suivie d'un débit continu d'eau déionisée pendant 1 h. Couvrir les glissières lâchement de papier d'aluminium pour éviter la poussière et laisser sécher pendant 24 h.
  4. Disposer des diapositives dans une cassette de film à rayons X (des cassettes qui s'adaptent à des films de mammographie de 20X25 cm sont recommandées) ainsi qu'un ensemble de [14C]méthylmethacrylate standards, qui ont été précédemment calibrés contre des tissus de concentrations connues de 14C comme décrit29. Les normes peuvent être achetées commercialement, mais elles garantissent qu'elles couvrent une plage de 2 à 300 mCi/g de tissu et qu'elles sont calibrées sur une épaisseur de tissu de 20 m. Sous le feu rouge, placez un morceau de film de mammographie, côté émulsion vers le bas, sur le dessus des sections.
  5. Scellez les cassettes et placez-les dans un sac à louage noir et entreposez-les dans une armoire pendant 40 à 45 jours.
  6. Développer des films selon les directives du fabricant. Remarque : Le développement automatisé de films n'est pas recommandé parce que l'arrière-plan peut être inégal et affecter la quantification.

6. Analyser les images.

Remarque : Il est recommandé d'avoir un programme d'analyse d'image disponible dans le commerce, couplé à une caméra CCD et à une boîte lumineuse fluorescente avec un éclairage uniforme. Les densités optiques relatives dans le film illuminé sont détectées par la caméra CCD.

  1. Construire une courbe d'étalonnage de densité optique (OD) c. concentration de tissu 14C basée sur les OD de l'ensemble de normes calibrées sur le film. Adéquation de ces données (y compris le blanc ou le fond) à une équation polynomiale. Une équation polynomiale de deuxième ou troisième degré s'adapte très bien.
  2. Pour analyser des régions spécifiques du cerveau, localisez la région d'intérêt (ROI) en six à huit sections par rapport à un atlas cérébral. Enregistrez les OD des pixels dans un retour sur investissement dans toutes les sections et, en fonction de la courbe d'étalonnage, calculent la concentration de tissu 14C dans chaque pixel. Calculer la concentration moyenne de 14C de tissu dans le roi-roi.

7. Calcul de rCPS. Calculer rCPS dans chaque ROI au moyen de l'équation suivante :

Equation

Là où la concentration moyenne pondérée de tissu de 14C dans le ROI, Cp(t) et Cp(t) sont les concentrations artérielles de plasma de leucine non étiquetée et étiquetée à l'époque, t, T est le moment où l'animal est mort ( environ 60 min), et est la fraction de leucine dans le bassin de précurseurs tissulaires qui provient du plasma. L'évaluation de l'aétée est effectuée dans le cadre d'une expérience distincte 6. a été évalué en WT, Fmr1 knock-out, Tsc-, et pKU souris 6,22,25,28. Si une expérience implique des changements génétiques ou pharmacologiques qui pourraient affecter les taux de synthèse, de dégradation ou de métabolisme des protéines, il faut évaluer les nouveaux taux de synthèse, de dégradation ou de métabolisme de la leucine.

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Representative Results

Ici nous montrons une expérience représentative démontrant les effets de l'administration antérieure d'un inhibiteur de synthèse de protéine sur rCPS. L'anisomycine dans la saline normale a été administrée à une souris sauvage de type sauvage de C57/BL6 adulte sous-cutanée (100 mg/kg) 30 min avant l'initiation de la détermination de rCPS. Les effets du traitement de l'anisomycine par rapport à un animal témoin traité par véhicule montrent que le RCPS est presque indétectable chez la souris traitée à l'anisomycine (figure 4). Ces données représentent une validation que la méthode autoradiographique in vivo L-[1-14C]-leucine mesure les taux de synthèse des protéines dans le cerveau.

Nous présentons une figure des autoradiogrammes luène L-[1-14C] à quatre niveaux du cerveau pour démontrer la résolution de la méthode (Figure 5). Illustrés sont les couches cellulaires dans l'ampoule olfactive (Figure 5A et B), l'hippocampe (Figure 5C), et le cervelet (Figure 5G). Les noyaux dans l'hypothalamus (figure 5D),les pons (Figure 5E et F), et le tronc cérébral (Figure 5H) sont également clairement visibles dans les autoradiogrammes. Nous montrons également les taux régionaux quantitatifs de synthèse des protéines dans le cortex frontal (5,88 nmol/g/min) (Figure 6A) et l'hippocampe dorsal (5,35 nmol/g/min) (figure 6B) d'un animal témoin typique.

Figure 1
Figure 1 : Schéma représentant les étapes de l'ensemble du protocole rCPS. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Image de l'artère fémorale exposée et de la veine fémorale. Allongée parallèlement les unes aux autres, l'artère fémorale est montrée au-dessus de la veine fémorale. La veine fémorale a également une couleur rouge plus profonde que l'artère fémorale. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : Image de l'enclos recommandé pour les animaux pour l'expérience rCPS. Il utilise un enclos animal cylindrique clair avec appendice pivotant relié à un attache de ressort. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4 : Images représentatives d'un animal traité par véhicule (A) par rapport à un animal traité à l'anisomycine (100 mg/kg, sous-cutané) 30 minutes avant l'administration du traceur (B). Les taux de synthèse des protéines sont proportionnels au niveau d'obscurité dans l'image. L'anisomycine réduit considérablement les taux mesurés de synthèse des protéines indiquant la spécificité de cette méthode. La barre d'échelle en haut à droite de A représente 1 mm et s'applique aux deux images. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5
Figure 5 : Autoradiogrammes numérisés d'une souris éveillée se comportant au niveau de l'ampoule olfactive (A, B), de l'hypothalamus (C, D), des pons (E, F), du cervelet (G) et du tronc cérébral (G, H). Les régions plus sombres ont des rCPS plus élevés. La barre d'échelle du panneau G s'applique aux panneaux A, C, E et G. Autoradiograms sur la droite (B, D, F et H) sont des images agrandies des zones désignées sur les images de gauche et la barre d'échelle du panneau H s'applique aux panneaux B , D, F, et H. Abbreviations sont les suivants: FrA, cortex d'association frontale; OB, ampoule olfactive; AO, noyau olfactif antérieur; Gl, couche glomerulaire; EPl, couche plexiforme externe; BLA, amygdale basolatérale; py, couche cellulaire pyramidale; dHi, hippocampe dorsal; DG, gyrus denté; MHb, habenula médial; Rt, noyau réticulaire thalamique; VMH, noyau hypothalamique médial ventral ; Arc, noyau arcuate; EW, noyau Edinger-Westphal; R, noyau rouge; PN, noyau pontin; ML, couche moléculaire; GL, couche granulaire; PC, couche cellulaire Purkinje; Cu, noyau cuneate; AP, zone postrema; 10, noyau moteur dorsal du vagus ; 12, noyau hypoglossal. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 6
Figure 6 : Autoradiogrammes numérisés d'une souris de contrôle éveillée au niveau du cortex frontal (A) et de l'hippocampe dorsal (B). Les taux de synthèse des protéines cérébrales sont codés en couleur dans les images en fonction de la barre de couleur indiquée à droite. La barre d'échelle en bas à gauche de A représente 1 mm et s'applique aux deux images. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Discussion

Nous présentons une méthode quantitative pour déterminer les taux régionaux de synthèse des protéines cérébrales (rCPS) in vivo chez les animaux expérimentaux. Cette méthode présente des avantages considérables par rapport aux méthodes existantes : 1. Les mesures sont effectuées chez l'animal qui se comporte éveillé, de sorte qu'elles reflètent les processus continus dans le cerveau qui fonctionne. 2. Les mesures sont faites au moyen de l'autoradiographie quantitative offrant la capacité de déterminer rCPS dans toutes les régions et sous-régions du cerveau simultanément. 3. Le modèle cinétique de la méthode prend en compte la possibilité de recyclage des acides aminés non étiquetés dérivés de la dégradation des protéines tissulaires et de son effet sur le bassin précurseur pour la synthèse des protéines6.

La principale limite de cette méthode est qu'elle prend du temps et est exigeante. Alors qu'il est tentant d'utiliser des méthodes de débit plus simples et plus élevées, les limites des données obtenues doivent être reconnues.

En raison de la complexité de mesurer rCPS dans une souris intacte, des problèmes avec le maintien d'un état physiologique normal, la collecte des échantillons de sang adéquats, et d'éviter les conditions d'interférence possible peut être rencontré. L'implantation chirurgicale des cathéters veineux et artériels est provocante. Comme avec n'importe quelle intervention chirurgicale, particulièrement avec la manipulation de la vascularisation délicate, il y a un risque inhérent pour la mortalité de l'animal. Pour nous, c'est rare (environ 1%). Au cours de la période de récupération de 22 h qui a suivi, occasionnellement (environ 4 %) un animal sortira un cathéter. Pendant la mesure, il est important que les cathéters soient brevetés et que les animaux soient dans un état physiologique normal. D'après notre expérience récente, le sang artériel ne peut pas être recueilli chez environ 2 % des animaux et environ 1 % des animaux avaient un faible hématocrit (lt; 40 %) ou une faible pression artérielle artérielle (85 mm Hg), suggérant une perte de sang pendant la chirurgie et/ou la récupération.

Dans la préparation des sections du cerveau pour l'autoradiographie, il est important de s'assurer que l'épaisseur de la section est de 20 m parce que c'est l'épaisseur de la section à laquelle [14C]méthylmethacrylate normes ont été calibrés. Faites preuve de prudence pour assurer des sections de bonne qualité, c'est-à-dire sans déchirures, plis ou bulles, car ces imperfections interfèrent avec l'analyse autoradiographique. Nous développons des films autoradiographiques à la main plutôt que dans un processeur de film automatisé parce que nous constatons que la densité optique de fond peut être inégale après le traitement automatisé, et cela peut affecter la quantification.

Dans l'équation pour rCPS, nous incluons un facteur, lambda ( ), qui est la fraction de leucine qui vient du plasma artériel, le reste provient du recyclage des acides aminés dérivés de la dégradation des protéines tissulaires6. Nous avons évalué - dans des expériences distinctes dans WT et Fmr1 KO (modèle X fragile) C57Bl/6J souris et a montré que sa valeur est de 0,603. La valeur de l'espèce, de l'origine génétique ou de la présence d'une mutation génétique peut varier selon l'espèce, le milieu génétique ou la présence d'une mutation génétique. Par conséquent, si la conception d'expériences de synthèse de protéines pour d'autres modèles, il faudra évaluer avant qu'une mesure précise puisse être obtenue.

Nos travaux sur les modèles génétiques de souris de troubles neurodéveloppementaux démontrent que cette méthodologie révèle des changements dans le rCPS dans ces modèles et, dans certains cas, les réponses aux traitements pharmacologiques22,23,25 , 26. Il est également concevable que la mesure de rCPS puisse également surveiller des changements dégénératifs dans le cerveau dans des conditions telles que des modèles de la maladie d'Alzheimer, de la maladie de Parkinson, du syndrome fragile d'ataxie de tremblement de X, des dommages traumatiques de cerveau, etc. dans ces modèles, il pourrait être possible de suivre les changements dégénératifs précoces et peut-être aussi les réponses aux interventions précoces. La méthode rCPS peut être utilisée avec l'immunohistochimie dans des sections parallèles pour examiner plus avant les changements spécifiques du cerveau25. En résumé, la méthode quantitative autoradiographique L-[1-14C]-leucine est idéale pour une détermination précise des valeurs rCPS in vivo. Il offre des avantages considérables en termes de précision et d'applicabilité aux conditions in vivo par rapport aux méthodes existantes.

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Disclosures

Les auteurs n'ont aucun conflit d'intérêts à divulguer.

Acknowledgments

Les auteurs aimeraient remercier Zengyan Xia pour le génotypage des souris, Tom Burlin pour le traitement des acides aminés et des films, et Mei Qin pour avoir effectué certaines des expériences rCPS. Cette recherche a été appuyée par le Programme de recherche intra-muros du NIMH, ZIA MH00889. RMS a également reçu un programme de bourses postdoctorales Autism Speaks 8679 et une bourse postdoctorale FRAXA.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Mice The Jackson Laboratory 003024 Fmr1 knockout breeding pairs
Anisomycin Tocris Bioscience 1290
Microhematocrit Tubes Drummond Scientific 1-000-3200-H capillary tubes
Critoseal Capillary Tube Sealant Leica Microsystems 39215003 sealant putty
Glass vial inserts Agilent 5183-2089 used to collect blood samples
Digi-Med Blood Pressure Analyzer Micro-Med Inc. BPA-400 blood pressure analyzer
Bayer Breeze 2 Blood Glucose Monitoring System Bayer Breeze 9570A glucose meter
Gastight syringe Hamilton Co. 1710 tuberculin glass syringe
HeatMax HotHands-2 Hand Warmers HeatMax Model HH2 warming pads
Heparin Lock Flush Solution Fresenius Kabi USA, LLC 504505 heparin saline
Clear animal container Instech MTANK/W animal enclosure
Spring tether Instech PS62 catheter tube/rodent attachment
Swivel Instech 375/25 hooks to spring tether
Swivel arm and mount Instech SMCLA hooks to swivel and animal enclosure
Tether button Instech VAB62BS/22 attaches to bottom of spring tether
Stainless steel tube Made in-house N/A used to snake catheters through mouse
Matrx VIP 3000 Matrx 91305430 isoflurane vaporizer
Isoflurane Stoelting Co. 50207 isoflurane/halothane adsorber
Clippers Oster Finisher Model 59
Surgical skin hooks Made in-house (??) N/A (??)
0.9% Sodium Chloride Saline APP Pharmaceuticals LLC 918610
Forceps Fine Science Tools 11274-20
Surgical scissors Fine Science Tools 14058-11
Microscissors Fine Science Tools 15000-00
UNIFY silk surgical sutures AD Surgical #S-S618R13 6-0 USP, non-absorbable
PE-8 polyethylene tubing SAI Infusion Technologies PE-8-25
Syringe Becton Dickinson and Co. 309659 1cc/mL
PE-10 polyethylene tubing Clay Adams 427400
MCID Analysis Imaging Research Inc. Version 7.0 optical density analysis
Gelatin-coated slides (75x25mm) FD Neurotechnologies PO101
Cryostat Leica CM1850
Super RX-N medical x-ray film Fuji 47410-19291
Hypercassettes (8x10 in) Amersham Pharmacia Biotech 11649
[1-14C]leucine Moravek MC404E
Microcentrifuge tube Sarstedt Aktiengesellschaft & Co. 72.692.005 used to deproteinize blood samples
Glass pasteur pipette Wheaton 357335
Glass wool Sigma-Aldrich 18421
Nitrogen NIH Supply Center 6830009737285
Scintillation fluid CytoScint 882453
Liquid scintilllation counter Packard Tri-Carb 2250CA
Amino acid analyzer Pickering Laboratories Pinnacle PCX
HPLC unit Agilent Technologies 1260 Infinity include 1260 Bio-Inert Pump
Surgical microscope Wild Heerbrugg M650
Sulfosalicylic acid Sigma-Aldrich MKBS1634V 5-sulfosalicylic acid dihydrate
Norleucine Sigma N8513
1.0 N HCl Sigma-Aldrich H9892
[H3]leucine Moraevk MC672
Falcon tube Thermo Scientific 339652 50 mL conical centrifuge tubes
Stopwatch Heuer Microsplit Model 1000 1/100 min
Euthanasia Solution Vet One H6438
Northern Light Precision Illuminator Imaging Research Inc. Model B95 fluorescent light box
Micro-NIKKOR 55mm f/2.8 Nikon 1442 CDD camera

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References

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Neurosciences Numéro 148 Synthèse des protéines cerveau dégradation des protéines autoradiographie traduction acides aminés anisomycine
Méthode autoradiographique quantitative pour la détermination des taux régionaux de synthèse des protéines cérébrales In Vivo
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Saré, R. M., Torossian, A.,… More

Saré, R. M., Torossian, A., Rosenheck, M., Huang, T., Beebe Smith, C. Quantitative Autoradiographic Method for Determination of Regional Rates of Cerebral Protein Synthesis In Vivo. J. Vis. Exp. (148), e58503, doi:10.3791/58503 (2019).

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