Summary
Protein syntes är en kritisk biologisk process för celler. I hjärnan, det krävs för adaptiva förändringar. Mätning av frekvenser av proteinsyntes i intakt hjärna kräver noggranna metodologiska överväganden. Här presenterar vi L-[1-14C]-leucine kvantitativ autoradiografiska metod för bestämning av regionala satser av cerebral proteinsyntes in vivo.
Abstract
Protein syntes krävs för utveckling och underhåll av neuronala funktion och är involverad i adaptiva förändringar i nervsystemet. Dessutom, det är tänkt att dysreglering av proteinsyntes i nervsystemet kan vara en kärn fenotyp i vissa utvecklingsstörningar. Noggrann mätning av graden av cerebral proteinsyntes i djurmodeller är viktigt för att förstå dessa sjukdomar. Den metod som vi har utvecklat var avsedd att tillämpas på studiet av vaken, beter sig djur. Det är en kvantitativ autoradiografiska metod, så det kan ge priser i alla regioner i hjärnan samtidigt. Metoden är baserad på användning av en Tracer aminosyra, L-[1-14C]-leucin, och en kinetisk modell av beteendet hos L-leucin i hjärnan. Vi valde L-[1-14C]-leucin som Tracer eftersom det inte leder till främmande märkta metaboliska produkter. Det är antingen införlivas i protein eller snabbt metaboliseras för att ge 14Co2 som späds ut i en stor pool av omärkta Co2 i hjärnan. Metoden och modellen möjliggör också bidrag av omärkta leucin härrör från vävnad proteolys till vävnaden föregångare pool för proteinsyntes. Metoden har den rumsliga upplösningen för att bestämma proteinsyntes hastigheter i cell-och neuropil-skikt, samt hypotalamus och kranialnervkärnor. För att få tillförlitliga och reproducerbara kvantitativa data är det viktigt att följa procedur detaljerna. Här presenterar vi de detaljerade förfarandena för den kvantitativa autoradiografiska L-[1-14C]-leucine metod för bestämning av regionala frekvenser av proteinsyntes in vivo.
Introduction
Protein syntes är en viktig biologisk process som krävs för långsiktig adaptiv förändring i nervsystemet1. Hämmande proteinsyntes blockerar långsiktig minneslagring i både ryggradslösa djur och ryggradsdjur2. Protein syntes är viktigt för underhåll av de sena faserna av vissa former av långsiktig potentiering (LTP) och långvarig depression (LTD)3, neuronala överlevnad under utveckling4, och för allmänt underhåll av neuron och dess synaptiska anslutningar5. Mätning av graden av hjärnans proteinsyntes kan vara ett viktigt verktyg för att studera adaptiva förändringar samt neurologiska utvecklingsstörningar och störningar i samband med inlärning och minne.
Vi har utvecklat en metod för att kvantifiera graden av cerebral proteinsyntes in vivo i ett vaket djur som erbjuder inneboende fördelar jämfört med andra tekniker som uppskattar priser i ex vivo eller in vitro-preparat av hjärnvävnad6. Främst är tillämpligheten till mätningar i intakt hjärna i ett vaket djur. Detta är en viktig faktor eftersom det tillåter mätningar med synaptisk struktur och funktion på plats och utan oro för post mortem-effekter. Dessutom uppnår den kvantitativa autoradiografiska metoden som vi anställer en hög grad av rumslig lokalisering. Energin i 14C är sådan att vi inte kan lokalisera spårämne på subcellulär eller cellulär nivå, vi kan mäta priser i cellskikt och små hjärnregioner såsom hypotalamus kärnor, med cirka 25 μm upplösning7.
En utmaning av in vivo mätningar med radiotracers är att se till att radiomärkas mätt är i produkten av reaktionen av intresserar i stället för unreagerade märkt föregångare eller annan ovidkommande märkta metaboliska produkter6. Vi valde L-[1-14C]-leucin som Tracer aminosyra eftersom det är antingen införlivas i protein eller snabbt metaboliseras till 14Co2, som späds ut i den stora poolen av omärkta Co2 i hjärnan till följd av den höga energimetabolism8. Dessutom finns alla 14c som inte ingår i protein i första hand som fria [14c]-leucin, som under den 60 min experimentella perioden, är nästan helt rensas från vävnaden6. Proteiner är sedan fast till vävnad med formalin och därefter sköljas med noga bort någon fri [14C]-leucin före Autoradiography.
En annan viktig faktor är frågan om utspädning av den specifika aktiviteten av föregångaren aminosyran pool av omärkta aminosyror som härrör från vävnad proteolysis. Vi har visat att hos vuxna råtta och mus, om 40% av föregångaren leucin pool för proteinsyntes i hjärnan kommer från aminosyror som härrör från proteinnedbrytning6. Detta måste ingå i beräkningen av regionala frekvenser av cerebral proteinsyntes (RCP) och måste bekräftas i studier där detta förhållande kan förändras. Den teoretiska grunden och antagandena av metoden har presenterats i detalj någon annanstans6. I detta dokument fokuserar vi på procedurfrågor vid tillämpningen av denna metodik.
Denna metod har använts för bestämning av RCP i mark ekorrar9, får10, rhesusapor11, råttor12,13,14,15,16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21, en musmodell av tuberös skleros Complex22, en musmodell av bräcklig x syndrom23,24,25,26, bräcklig x premutation möss27, och en musmodell av fenylketonuri28. I detta manuskript presenterar vi förfarandena för mätning av RCP med den in vivo autoradiografiska L-[1-14C]-leucine metoden. Vi presenterar RCP i hjärnregioner av en vaken kontroll mus. Vi visar också att i vivo administrering av anisomycin, en hämmare av översättning, avskaffar proteinsyntesen i hjärnan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Anmärkning: alla djur förfaranden godkändes av National Institute of Mental Health Animal Care och användning kommittén och utfördes enligt National Institutes of Health riktlinjer om vård och användning av djur.
En översikt över protokollet presenteras i figur 1.
1. kirurgiskt implantat katetrar i en lår bens ven och artär för administrering av spårämne och insamling av tidsinställda arteriella blodprov, respektive. Fullständig kirurgi minst 22 h före administrering av Tracer. Kirurgi kräver ca 1 h för att slutföra.
- Samla nödvändiga material: sterila kirurgiska instrument (kirurgisk sax, mikro-sax, pincett, tre kirurgiska hud krokar), utrustning för isofluran anestesi (isofluran spridare, Active gas Scavenger, förseglade anestesi kammare, anestesi näsa Cone), steril kirurgi skede, päls Clippers, 70% etanol, Betadine, steril gasväv, kirurgisk tejp, kommersiella Handvärmare, kirurgiska Mikroskop, sterila 0,9% natriumklorid (saltlösning), sterila heparin 100 USP enheter/mL i 0,9% natriumklorid (heparinized saltlösning), steril 5 20-cm remsor av 6-0 resorberbara sutur, sterila 25-cm strängar av PE-8 och PE-10 polyeten katetrar med ena änden skära på 45o, sterila 1 cc sprutor, sterila 32 gauge nålar, diatermi utrustning, steril 15-20 cm Hollow rostfritt stålstång (2,5 mm innerdiameter, 3 mm ytterdiameter), lokalanestetika (bupivacaine och lidokain salva), och en djur låda med vridbar bihang inställning (30 cm fjäder tjuder med knapp, vridbar, vridbar montering och arm, 20 X 13 cm klar cylindrisk behållaren).
- Förbered djur för kirurgi.
- Säkerställ att korrekt aseptisk och steril teknik används som krävs av din institution.
- Väg djuret. Djuret måste vara minst 25 g för en lyckad operation.
- Placera djuret i en sluten plexiglaskammare och Anslut kammaren till isofluran anestesi apparat. Ställ in flödeshastighet till 2,5 L/min för män och 3,0 L/min för kvinnor på 1,5% isofluran i O2. Efter ungefär 2 min, se till att musen är lämpligt Sedated av brist på en tillbakadragande reflex med en tå nypa.
- En gång Sedated, ta bort musen från kammaren och lägga den i en liggande position med ansiktet inne i anestesi näsa konen. Ställ upp näsan konen att ta emot gas från spridare och att återvända gas till gas Gat gasen. Den Scavenger kommer att fånga isofluran i ett kolfilter.
- Använd Clippers för att raka pälsen mellan skulderbladen. Se till att korrekt sterilisera den rakade regionen, omväxlande tre gånger mellan Betadine och etanol Scrubs.
- Vänd musen över till en liggande position hålla ansiktet i näsan konen. Tejpa ner vänster ben på kirurgi scenen och använda Clippers att raka päls från vänster innerlår till övre vänstra buken. Se till att korrekt sterilisera den rakade regionen, omväxlande tre gånger mellan Betadine och etanol Scrubs.
- Skjut en aktiverad kommersiellt tillgänglig Handvärmare, insvept i gasväv, under musen. Tejpa ner det högra benet på Operations stadiet.
- Sätt in katetern i den vänstra femorala venen.
- Med hjälp av ett kirurgiskt Mikroskop, använda kirurgisk sax för att göra en 1 cm snitt från den övre mediala delen av vänster lår rostrally mot mittlinjen, avslöjar lår bens artär och ven.
- Dra tillbaka lös hud med kirurgiska hud krokar för att ytterligare exponera vesiklarna.
- Applicera steril 0,9% natriumklorid till utsatt område för att bibehålla tillräcklig fukt.
- Använd tång för att trubbiga dissekera, separera bindväv runt en liten del av femorala artären och ven. Noggrant, separera artären och ven (figur 2).
- Använd tång för att gänga en del av absorberbara suturen (strand A) under både femorala venen och artären vid den mest laterala punkten av snittet. Dra suturen halvvägs igenom så att ändarna är jämna.
- Vid en mer proximala punkt till ljulsken, Använd tång för att gänga en andra sutur (del B) under endast femorala venen. Försiktigt knyta en halv Knut som kommer att användas för att begränsa blodflödet.
- Vid en punkt mellan del A och del B, Använd pincett för att gänga en tredje sutur (del C) under endast femorala venen. Försiktigt binda en full Knut som kommer att användas för att begränsa blodflödet. Var noga med att inte riva venen.
- Dra försiktigt på strand B för att begränsa blodflödet. Använd en hemostat för att försiktigt dra del B för att bibehålla begränsat blodflöde.
- Skär ett litet hål i den begränsade delen av lår bens ven med mikrosax och försiktigt in den vinklade änden av PE-8 slangen (tidigare spolas med heparin saltlösning) mot strand B. När den är insatt, släpp strand B: s spänning och vägleda katetern längre upp i venen. Dra åt strand B runt venen som innehåller katetern.
- Med hjälp av del C, knyt en extra Knut runt katetern. Se till att denna Knut inte fånga femorala artären.
- Dra försiktigt tillbaka sprutcylindern för att delvis fylla slangen med blod för att säkerställa att katetern har implanterats ordentligt.
- Efter samma förfarande, infoga en PE-10 kateter i den vänstra femorala artären.
- Komplett kirurgiskt ingrepp.
- När både lår bens ven och artärkatetrar har säkrats, Tie strand A i en Knut runt båda katetrar.
- Skär alla överflödiga suturer och ta bort hud krokar. Spola arteriella katetern med hepariniserad saltlösning för att förhindra koagulering. Cauterize ändarna av båda katetrar för att skapa en tätning.
- Placera musen i liggande läge och göra ett litet snitt vid basen av halsen och applicera saltlösning på utsatt område.
- Sätt ihålig metallstav subdermally från halsen snitt till femorala snittet. Orm katetrar genom ihåliga spö och ur halsen snitt. Ta bort den ihåliga staven. Implantera katetrar subdermally kommer att hindra möss från att skada katetrar.
- Applicera bupivakain på sidorna av såret. Stäng femorala snittet med sutur. Tillsätt lidokain salva över stängda, sys sår.
- Orm katetrar genom en 30-cm flexibel ihåliga röret (våren tjuder) och sutur knappen på våren tjuder under huden. Applicera bupivakain på sidorna av såret. Suture knappen på våren tjuder under huden. Tillsätt lidokain salva över stängda, sys sår.
- Flytta musen till en klar cylindrisk behållare (20 cm hög, 13 cm diameter) med ett vridbart fäste och arm för att husdjuret under återhämtningsperioden. Placera en handvärmare under behållaren för att hålla djuret varmt.
- Skruva fast den övre delen av fjäder tjuder till en vridbar och fäst vridskruven på den vridbara armen som är fäst vid den cylindriska behållaren. Se till att musen har hela rörelseomfång och katetrar kan nås.
- Placera ett slitsat lock som inte stör Vridmekanismen över djur höljet. Se figur 3 för fullständig inställning.
- Låt musen återhämta sig. Minst 22 h rekommenderas.
2. Förbered L-[1-14C] leucin injektionsvätska, lösning och 16% (w/v) 5-sulfosalicylsyra (SSA) dihydrat lösning för deproteiniserande plasmaprover. I SSA-lösningen ingår även 0,04 mM norleucin och 1 μCi/mL [H3] leucin som interna standarder för aminosyreanalys och analys av spår koncentrationen i de syralösliga plasma fraktionerna. Förvara SSA upp till två månader vid 4 ° c.
- Köp kommersiellt tillgängliga L-[1-14C] leucin (50-60 MCI/mmol), som säljs som en lösning i 2% etanol eller 0,1 N HCl. föna en känd aktivitet av spårämne under en mild ström av kväve och Rekonstituera i en lösning av steril, normal upp till en koncentration av 100 μCi/mL.
3. administrera L-[1-14C] leucin intravenöst och samla arteriella blodprov.
- Samla in nödvändiga material: 18 1,5 mL mikrorör för deproteiniserande plasmaprover (tillsätt 70 mL avjoniserat vatten till varje tub), 17 250mL injektionsflaskor av glas (15 skär för insamling av arteriella blodprov och 2 skär för insamling av blodets återinsprutas. För att begränsa insamlingen av extra och onödigt blod, små, tunna glas injektionsflaskor med avsmalnande bottnar som möjliggör tillgänglig pipettering av supernatanten plasma rekommenderas), 2 mikrokapillärrör (32 X 0,8 mm, för hematokrit-mätning), 1 heparin och litium fluorid-belagda microcentrifug röret (för att förhindra koagulering och glykolys, respektive), Peanger (Täck tips med Tygon slang så att klämmor inte kommer att skada PE slang), blodglukos Monitor, blodtrycks givare, 1 ml sterila sprutor (för saltlösning) och kommersiellt tillgänglig eutanasi (utspädd 1:1 i avjoniserat vatten (för möss)).
- Se till att djuret är i ett normalt fysiologiskt tillstånd i början av experimentet.
- Kläm på arteriella slangar ca 2 cm från slutet och skär av spetsen, skapa en öppning för blod att flöda. Sedan spänn slangar och samla in Dead Space blod ((c. 30 ml) för att samla in eventuell kvarvarande saltlösning och/eller blod från tidigare dragningar), och, i ett separat rör, samla ett kontrollprov (ca 30 μl), hematokrit prover (ungefär hälften av kapillärröret volym), och en glukos prov (ca 20 μL).
- Mät hematokrit genom att plugga ena änden med tätningsmedel kitt och centrifugera för 1 min vid 4500 x g. Mät förhållandet mellan volymen av erytrocyter och den totala blodvolymen. Om ett djur har en hematokrit under 30%, Fortsätt inte studien.
- Använd en kommersiellt tillgänglig blodsockermätare för att mäta glukosnivån i en blodtrycksfall.
- Centrifugera kontrollprov för 2 min vid 18 000 x g till separat plasma. Deproteinisera plasmaprover enligt följande: Tillsätt 5 μL plasma till 70 μL avjoniserat vatten i en 1,5 mL mikrotub, tillsätt 25 μL av 16% SSA-lösningen och Vortex. Placera på is i 30 min innan frysning på torris.
- Returnera Dead Space blod till djuret genom den venösa linjen, följt av en hepariniserad saltlösning Flush för att förhindra överskott blodförlust.
- Anslut arteriell linje till en blodtrycks givare för att mäta Genomsnittligt arteriellt blodtryck.
- Efter att ta proverna vara säker på att åter klämma den arteriella linjen och att spola linjen med en liten (50 ml) volym av hepariniserad saltlösning.
- Administrera Tracer intravenöst och samla in tidsinställda arteriella blodprov.
- Använd en Y-kontakt för att fästa en spruta med spårämne (100μCi/kg) och en spruta med 50 mL steril saltlösning för att spola den venösa linjen efter injektion av Tracer. Anslut Y-kontakten till den venösa linjen.
- Initiera studien genom att samtidigt starta ett stoppur och injicera spårämne. Spola den venösa linjen med saltlösning (c. 100mL) omedelbart efter injektionen.
- Samla blodprov 1-7 kontinuerligt under de första 2 min av experimentet på samma sätt. Efter insamling av 7: e provet, samla 30 μL Dead-Space blod före varje återstående prov. Proverna 8-14 samlas in vid 3, 5, 10, 15, 30, 45 respektive 60 min.
- Behandla blodprov omedelbart efter insamling, vilket beskrevs för kontrollprovet. Om det finns en fördröjning, placera proverna på isen. Försiktigt reinjicera Dead Space blod i artären via arteriell kateter och spola med heparin saltlösning.
- Vid något tillfälle under experimentet, bearbeta tre interna standarder genom att tillsätta 25 μL 16% SSA, 0,04 mM norleucin, och 1 mCi/mL [3H] leucin till 75 μl vatten, virvel och plats på is.
- Efter insamling av den 14: e provet vid 60 min, injicera cirka 0,2 mL av B-Euthanasia-D i den venösa linjen att euthanize djuret. Anteckna tiden för döden.
- Skruva loss djuret från det vridbara fästet och ta bort det från djur höljet. Ta försiktigt bort hjärnan, placera på aluminiumfolie, och frysa på torris. Inte frysa hjärnor med flytande kväve som hjärnor kan spricka. Förvara hjärna, prover och interna standarder vid-80 ° c tills den är klar för bearbetning. Bearbetningen kan utföras när som helst efteråt.
4. analysera koncentrationerna av leucin och L-[1-14C] leucin i plasmaprover.
- Tina prover och interna standarder på is, Vortex, och centrifugera 18 000 x g i 5 min vid 2 ° c. Den supernatanten fraktionen kommer att innehålla den fria märkta och omärkta leucin.
- Överför 40 μL av supernatanten till en flytande scintillationskampull och tillsätt scintillationscocktail. Kvantifiera sönderfall per minut (DPM) av 3h och 14c med hjälp av flytande scintillationräkning och en spärr kurva avsedd för samtidig dubbel etikett (3h och 14c) räkning.
- För att kvantifiera plasmakoncentrationer av leucin, Använd ett HPLC-system med en kolumn för natrium katjonbyte och derivatisering efter kolonnen med o-ftaldehyd och fluorometrisk detektion.
- Ställ in HPLC på följande specifikationer: fluorometerexcitation på 330 nm och emission av 465 nm. Den mobila fasen består av natrium eluant, pH 7,40, och natrium eluant + 5% sulfolane, pH 3,15. Ställ in buffertflödet på 0,400 mL/min och derivatiseringsinstrumentets flödeshastighet till 0,300 mL/min. Ställ kolonntemperaturen till 48 ° c och reaktor temperatur till 45 ° c.
- Kalibrera systemet med en rad aminosyrekoncentrationer (inklusive norleucin) mellan 30 och 500 pmol/10mL. Kalibreringskurvan är linjär. Aminosyrekoncentrationerna av de testade 10 mL-injektionsproverna faller inom intervallen för denna kalibreringskurva.
5. utför kvantitativ autoradiografi.
- Förbered hjärnans sektioner 20 μm i tjocklek för Autoradiography. Avsnitt hjärna med hjälp av en kryostat vid-20 ° c.
- Tina Mount Serial Brain sektioner på gelatin-belagda diabilder. Lufttorka.
- Tvätta diabilder i fem förändringar av 10% formalin för 30 min per förändring, följt av ett kontinuerligt flöde av avjoniserat vatten för 1 h. Täck glasen löst med folie för att undvika damm och låt torka i 24 h.
- Ordna diabilder i en X-ray filmkassett (kassetter som passar 20X25 cm mammografi filmer rekommenderas) tillsammans med en uppsättning [14c] Metylmetakrylatstandarder, som tidigare kalibrerats mot vävnad från kända 14c-koncentrationer som beskrivna29. Standarder kan köpas kommersiellt men se till att de täcker en räckvidd på 2-300 mCi/g vävnad och är kalibrerade mot 20 μm vävnad tjocklek. Under rött safelight, placera en bit av mammografi film, emulsion sida ner, ovanpå sektionerna.
- Försegla kassetterna och placera i en svart Skötväska och förvara i ett skåp för 40-45 dagar.
- Utveckla filmer enligt tillverkarens anvisningar. Obs: automatiserad film utveckling rekommenderas inte eftersom bakgrunden kan vara ojämn och kan påverka kvantifieringen.
6. analysera bilder.
Anmärkning: ett kommersiellt tillgängligt program för bildanalys i kombination med en CCD-kamera och en fluorescerande ljus ruta med jämn belysning rekommenderas. Den relativa optiska densiteterna i den belysta filmen upptäcks av CCD-kameran.
- Konstruera en kalibreringskurva av optisk densitet (OD) v. vävnad 14C koncentration baserad på ODS i uppsättningen av kalibrerade standarder på filmen. Anpassa dessa data (inklusive blank eller bakgrund) till en polynom ekvation. Antingen en andra eller tredje gradens polynom ekvation passar mycket bra.
- För att analysera specifika hjärnregioner, lokalisera regionen av intresse (ROI) i sex till åtta avsnitt i jämförelse med en Brain Atlas. Registrera ODs av pixlarna inom en ROI i alla sektioner och, baserat på kalibreringskurvan, beräkna vävnaden 14C koncentration i varje pixel. Beräkna den genomsnittliga vävnaden 14C koncentration i Roi.
7. beräkning av RCP. Beräkna RCP i varje ROI med hjälp av följande ekvation:
Där P * (t) är den vägda genomsnittliga vävnads koncentrationen av 14c i Roi, cP(t) och c*P(t) är de arteriella plasmakoncentrationerna av omärkta och märkta leucin vid tidpunkten, t, t är den tid som djuret dog ( ca 60 min), och λ är fraktionen av leucin i vävnaden föregångare poolen som kommer från plasman. Utvärdering av λ utförs i ett separat experiment 6. λ har utvärderats i WT, Fmr1 knockout, TSC+/-och PKU-möss 6,22,25,28. Om ett experiment involverar antingen genetiska eller farmakologiska förändringar som kan påverka graden av proteinsyntes, nedbrytning eller metabolism av leucin, ska λ utvärderas under de nya villkoren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Här visar vi ett representativt experiment som visar effekterna av tidigare administrering av en proteinsyntes hämmare på RCP. Anisomycin i normal saltlösning administrerades till en vuxen C57/BL6 manlig vild-typ mus subkutant (100 mg/kg) 30 min före initiering av RCP-bestämning. Effekter av anisomycin behandling jämfört med ett vehikel-behandlat kontrolldjur visar att RCP är nästan omöjlig att upptäcka i den anisomycin-behandlade musen (figur 4). Dessa data utgör en validering som den in vivo autoradiografiska L-[1-14C]-leucine metod mäter klassar av proteinsyntes i hjärna.
Vi presenterar en siffra på L-[1-14C]-leucine autoradiograms på fyra nivåer i hjärnan för att demonstrera upplösningen av metoden (figur 5). Illustrerade är cell lagren i luktbulben (figur 5a och B), Hippocampus (figur 5c) och lillhjärnan (figur 5G). Kärnor i hypotalamus (figur 5D), Pons (figur 5E och F), och hjärnstammen (figur 5H) syns också tydligt i autoradiograms. Vi visar också de kvantitativa regionala frekvenserna av proteinsyntes i frontala cortex (5,88 nmol/g/min) (figur 6a) och dorsala hippocampus (5,35 nmol/g/min) (figur 6b) av ett typiskt kontrolldjur.
Figur 1: schematiskt som representerar stegen i hela rCPS-protokollet. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: bild av exponerad lår bens artär och lår bens ven. Om parallellt med varandra, den femorala artären visas ovanför femorala venen. Den femorala venen har också en djupare röd färg än femorala artären. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: bild av Rekommenderad djur kapslings uppsättning för rCPS-experiment. Den använder en klar cylindrisk djur kapsling med vridbar bihang ansluten till en fjäder tjuder. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: representativa bilder från ett vehikel-behandlat djur (a) jämfört med ett djur som behandlats med anisomycin (100 mg/kg, subkutant) 30 min före administrering av Tracer (B). Frekvens av proteinsyntes är proportionell mot nivån av mörker i bilden. Anisomycin minskar drastiskt de uppmätta frekvenserna av proteinsyntesen som indikerar specificiteten hos denna metod. Skalstapeln uppe till höger i A representerar 1 mm och gäller för båda bilderna. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: digitaliserade autoradiograms från en vaken beter mus på nivån för luktbulben (a, B), hypotalamus (C, D), Pons (E, F), lillhjärnan (g), och hjärnstammen (g, H). De mörkare regionerna har högre RCP. Skalstapeln i panel G gäller för panelerna A, C, E och G. Autoradiograms till höger (B, D, F och H) är förstorade bilder från de områden som anges på bilderna till vänster och skalstapeln i panel H gäller för paneler B , D, F och H. förkortningar är följande: FrA, frontal Association cortex; OB, luktbulben; Ao, främre lukt kärna; GL, glomerulär skikt; EPl, yttre plexiformlagrar; BLA, basolateral amygdala; PY, pyramidala cellskikt; dHi, dorsala Hippocampus; DG, dentate gyrus; MHb, medial habenula; RT, thalamic retikulära kärnan; VMH, ventrala mediala hypotalamus kärna; Båge, arcuatus kärna; EW, Edinger-Westphal kärna; R, röd kärna; PN, Pontine kärna; ML, molekyl skikt; GL, granulat lager; PC, Purkinje cellskikt; Cu, cuneate kärna; AP, område postrema; 10, dorsala motorisk kärna av vagusen; 12, hypoglossus kärna. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: digitaliserade autoradiograms från en vaken beter sig kontroll mus i nivå med frontala cortex (a) och dorsala Hippocampus (B). Frekvenser av cerebral proteinsyntes är färgkodade i bilderna enligt färgfältet visas till höger. Skalstapeln längst nere till vänster på en representerar 1 mm och gäller för båda bilderna. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi presenterar en kvantitativ metod för bestämning av regionala frekvenser av cerebral proteinsyntes (RCP) in vivo i försöksdjur. Denna metod har avsevärda fördelar jämfört med befintliga metoder: 1. mätningar görs i den vakna beter djur, så de återspeglar pågående processer i den fungerande hjärnan. 2. mätningar görs med hjälp av kvantitativ autoradiografi som ger möjlighet att bestämma RCP i alla regioner och del regioner i hjärnan samtidigt. 3. den kinetiska modellen av metoden tar hänsyn till möjligheten till återvinning av omärkta aminosyror som härrör från vävnads proteinnedbrytning och dess effekt på föregångaren pool för proteinsyntes6.
Den primära begränsningen av denna metod är att det är tidskrävande och krävande. Det är frestande att använda enklare och högre genomströmnings metoder, men begränsningarna av de erhållna uppgifterna måste erkännas.
På grund av komplexiteten i att mäta RCP i en intakt mus, problem med upprätthållandet av ett normalt fysiologiskt tillstånd, samla in adekvat blodprov, och undvika eventuellt störande förhållanden kan uppstå. Kirurgisk implantation av venösa och arteriella katetrar är utmanande. Som med alla kirurgiska ingrepp, särskilt med hantering av känsliga kärl, det finns en inneboende risk för dödlighet av djuret. För oss är det sällsynt (ca 1%). Under den följande 22 h återhämtningsperioden, ibland (cirka 4%) ett djur kommer att dra en kateter ut. Under mätningen är det viktigt att katetrar är patent och att djuren befinner sig i ett normalt fysiologiskt tillstånd. I vår senaste erfarenhet, arteriell blod kan inte samlas i cirka 2% av djuren och cirka 1% av djuren hade en låg hematokrit (< 40%) eller lågt arteriellt blodtryck (< 85 mm Hg), vilket tyder på blodförlust under kirurgi och/eller återhämtning.
Vid beredning av hjärn sektioner för autoradiografi är det viktigt att se till att snittjockleken är 20 μm, eftersom det är snittjockleken till vilken [14C] Metylmetakrylatstandarder har kalibrerats. Använd försiktighet för att säkerställa god kvalitet sektioner, dvs utan tårar, veck, eller bubblor som dessa brister kommer att störa autoradiografiska analys. Vi utvecklar autoradiografiska filmer för hand snarare än i en automatiserad film processor, eftersom vi anser att den optiska bakgrunds tätheten kan vara ojämn efter automatiserad behandling, vilket kan påverka kvantifieringen.
I ekvationen för RCP inkluderar vi en faktor, lambda (λ), som är den fraktion av leucin som kommer från den arteriella plasman, resten kommer från återvinning av aminosyror som härrör från vävnads proteinnedbrytning6. Vi har utvärderat λ i separata experiment i WT och Fmr1 Ko (bräcklig X-modell) C57BL/6j möss och visat att dess värde är 0,603. Värdet på λ kan variera beroende på art, genetisk bakgrund eller förekomst av en genetisk mutation. Därför, om att designa proteinsyntes experiment för andra modeller, måste man utvärdera λ innan en noggrann mätning kan erhållas.
Vårt arbete med genetiska musmodeller av neurologiska utvecklingsstörningar visar att denna metod avslöjar förändringar i RCP i dessa modeller och i vissa fall svar på farmakologiska behandlingar22,23,25 , 26. det är också tänkbart att RCP-mätningen också kan övervaka degenerativa förändringar i hjärnan under förhållanden som modeller av Alzheimers sjukdom, Parkinsons sjukdom, bräcklig X tremor ataxi syndrom, traumatisk hjärnskada, etc. i dessa modeller, kan det vara möjligt att spåra tidiga degenerativa förändringar och möjligen också svar på tidiga interventioner. Rcp-metoden kan användas tillsammans med immunohistokemi i parallella sektioner för att ytterligare undersöka specifika hjärnförändringar25. Sammanfattningsvis är den kvantitativa autoradiografiska L-[1-14C]-leucine-metoden idealisk för noggrann bestämning av RCP-värden in vivo. Det ger avsevärda fördelar när det gäller noggrannhet och tillämplighet på in vivo-villkor jämfört med befintliga metoder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.
Acknowledgments
Författarna vill erkänna Zengyan Xia för genotypning av möss, Tom Burlin för bearbetning av aminosyror och filmer, och Mei Qin för att utföra några av de RCP experiment. Denna forskning stöddes av intramural forsknings program av NIMH, ZIA MH00889. RMS stöddes också av en autism talar postdoktor Fellowship 8679 och en FRAXA postdoktor gemenskap.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | The Jackson Laboratory | 003024 | Fmr1 knockout breeding pairs |
| Anisomycin | Tocris Bioscience | 1290 | |
| Microhematocrit Tubes | Drummond Scientific | 1-000-3200-H | capillary tubes |
| Critoseal Capillary Tube Sealant | Leica Microsystems | 39215003 | sealant putty |
| Glass vial inserts | Agilent | 5183-2089 | used to collect blood samples |
| Digi-Med Blood Pressure Analyzer | Micro-Med Inc. | BPA-400 | blood pressure analyzer |
| Bayer Breeze 2 Blood Glucose Monitoring System | Bayer Breeze | 9570A | glucose meter |
| Gastight syringe | Hamilton Co. | 1710 | tuberculin glass syringe |
| HeatMax HotHands-2 Hand Warmers | HeatMax | Model HH2 | warming pads |
| Heparin Lock Flush Solution | Fresenius Kabi USA, LLC | 504505 | heparin saline |
| Clear animal container | Instech | MTANK/W | animal enclosure |
| Spring tether | Instech | PS62 | catheter tube/rodent attachment |
| Swivel | Instech | 375/25 | hooks to spring tether |
| Swivel arm and mount | Instech | SMCLA | hooks to swivel and animal enclosure |
| Tether button | Instech | VAB62BS/22 | attaches to bottom of spring tether |
| Stainless steel tube | Made in-house | N/A | used to snake catheters through mouse |
| Matrx VIP 3000 | Matrx | 91305430 | isoflurane vaporizer |
| Isoflurane | Stoelting Co. | 50207 | isoflurane/halothane adsorber |
| Clippers | Oster Finisher | Model 59 | |
| Surgical skin hooks | Made in-house (??) | N/A (??) | |
| 0.9% Sodium Chloride Saline | APP Pharmaceuticals LLC | 918610 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11274-20 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| Microscissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| UNIFY silk surgical sutures | AD Surgical | #S-S618R13 | 6-0 USP, non-absorbable |
| PE-8 polyethylene tubing | SAI Infusion Technologies | PE-8-25 | |
| Syringe | Becton Dickinson and Co. | 309659 | 1cc/mL |
| PE-10 polyethylene tubing | Clay Adams | 427400 | |
| MCID Analysis | Imaging Research Inc. | Version 7.0 | optical density analysis |
| Gelatin-coated slides (75x25mm) | FD Neurotechnologies | PO101 | |
| Cryostat | Leica | CM1850 | |
| Super RX-N medical x-ray film | Fuji | 47410-19291 | |
| Hypercassettes (8x10 in) | Amersham Pharmacia Biotech | 11649 | |
| [1-14C]leucine | Moravek | MC404E | |
| Microcentrifuge tube | Sarstedt Aktiengesellschaft & Co. | 72.692.005 | used to deproteinize blood samples |
| Glass pasteur pipette | Wheaton | 357335 | |
| Glass wool | Sigma-Aldrich | 18421 | |
| Nitrogen | NIH Supply Center | 6830009737285 | |
| Scintillation fluid | CytoScint | 882453 | |
| Liquid scintilllation counter | Packard Tri-Carb | 2250CA | |
| Amino acid analyzer | Pickering Laboratories | Pinnacle PCX | |
| HPLC unit | Agilent Technologies | 1260 Infinity | include 1260 Bio-Inert Pump |
| Surgical microscope | Wild Heerbrugg | M650 | |
| Sulfosalicylic acid | Sigma-Aldrich | MKBS1634V | 5-sulfosalicylic acid dihydrate |
| Norleucine | Sigma | N8513 | |
| 1.0 N HCl | Sigma-Aldrich | H9892 | |
| [H3]leucine | Moraevk | MC672 | |
| Falcon tube | Thermo Scientific | 339652 | 50 mL conical centrifuge tubes |
| Stopwatch | Heuer Microsplit | Model 1000 | 1/100 min |
| Euthanasia Solution | Vet One | H6438 | |
| Northern Light Precision Illuminator | Imaging Research Inc. | Model B95 | fluorescent light box |
| Micro-NIKKOR 55mm f/2.8 | Nikon | 1442 | CDD camera |
References
- West, A. E., et al. Calcium regulation of neuronal gene expression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 11024-11031 (2001).
- Siegel, G., Agranoff, B., Albers, R. W., Fisher, S., Uhler, M. Basic Neurochemistry. , 6th ed, Lippincott-Raven. New York. (1999).
- Nguyen, P. V., Abel, T., Kandel, E. R. Requirement of a critical period of transcription for induction of a late phase of LTP. Science. 265, 1104-1107 (1994).
- Mao, Z., Bonni, A., Xia, F., Nadal-Vicens, M., Greenberg, M. E. Neuronal activity-dependent cell survival mediated by transcription factor MEF2. Science. 286, 785-790 (1999).
- Pfeiffer, B. E., Huber, K. M. Current advances in local protein synthesis and synaptic plasticity. The Journal of Neuroscience: the Official Journal of the Society for Neuroscience. 26, 7147-7150 (2006).
- Smith, C. B., Deibler, G. E., Eng, N., Schmidt, K., Sokoloff, L. Measurement of local cerebral protein synthesis in vivo: influence of recycling of amino acids derived from protein degradation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85, 9341-9345 (1988).
- Schmidt, K. C., Smith, C. B. Resolution, sensitivity and precision with autoradiography and small animal positron emission tomography: implications for functional brain imaging in animal research. Nuclear Medicine and Biology. 32, 719-725 (2005).
- Banker, G., Cotman, C. W. Characteristics of different amino acids as protein precursors in mouse brain: advantages of certain carboxyl-labeled amino acids. Archives of Biochemistry and Biophysics. 142, 565-573 (1971).
- Frerichs, K. U., et al. Suppression of protein synthesis in brain during hibernation involves inhibition of protein initiation and elongation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 14511-14516 (1998).
- Abrams, R. M., Burchfield, D. J., Sun, Y., Smith, C. B. Rates of local cerebral protein synthesis in fetal and neonatal sheep. The American Journal of Physiology. 272, R1235-R1244 (1997).
- Nakanishi, H., et al. Positive correlations between cerebral protein synthesis rates and deep sleep in Macaca mulatta. The European Journal of Neuroscience. 9, 271-279 (1997).
- Sun, Y., Deibler, G. E., Sokoloff, L., Smith, C. B. Determination of regional rates of cerebral protein synthesis adjusted for regional differences in recycling of leucine derived from protein degradation into the precursor pool in conscious adult rats. Journal of Neurochemistry. 59, 863-873 (1992).
- Scammell, T. E., Schwartz, W. J., Smith, C. B. No evidence for a circadian rhythm of protein synthesis in the rat suprachiasmatic nuclei. Brain Research. 494, 155-158 (1989).
- Smith, C. B., Eintrei, C., Kang, J., Sun, Y. Effects of thiopental anesthesia on local rates of cerebral protein synthesis in rats. The American Journal of Physiology. 274, E852-E859 (1998).
- Sun, Y., Deibler, G. E., Smith, C. B. Effects of axotomy on protein synthesis in the rat hypoglossal nucleus: examination of the influence of local recycling of leucine derived from protein degradation into the precursor pool. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 13, 1006-1012 (1993).
- Smith, C. B., Yu, W. H. Rates of protein synthesis in the regenerating hypoglossal nucleus: effects of testosterone treatment. Neurochemical Research. 19, 623-629 (1994).
- Orzi, F., Sun, Y., Pettigrew, K., Sokoloff, L., Smith, C. B. Effects of acute and delayed effects of prior chronic cocaine administration on regional rates of cerebral protein synthesis in rats. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 272, 892-900 (1995).
- Nadel, J., et al. Voluntary exercise regionally augments rates of cerebral protein synthesis. Brain Research. 1537, 125-131 (2013).
- Sun, Y., et al. Rates of local cerebral protein synthesis in the rat during normal postnatal development. The American Journal of Physiology. 268, R549-R561 (1995).
- Smith, C. B., Sun, Y., Sokoloff, L. Effects of aging on regional rates of cerebral protein synthesis in the Sprague-Dawley rat: examination of the influence of recycling of amino acids derived from protein degradation into the precursor pool. Neurochemistry International. 27, 407-416 (1995).
- Ingvar, M. C., Maeder, P., Sokoloff, L., Smith, C. B. The effects of aging on local rates of cerebral protein synthesis in rats. Monographs in Neural Sciences. 11, 47-50 (1984).
- Sare, R. M., Huang, T., Burlin, T., Loutaev, I., Smith, C. B. Decreased rates of cerebral protein synthesis measured in vivo in a mouse model of Tuberous Sclerosis Complex: unexpected consequences of reduced tuberin. Journal of Neurochemistry. 145, 417-425 (2018).
- Liu, Z. H., Huang, T., Smith, C. B. Lithium reverses increased rates of cerebral protein synthesis in a mouse model of fragile X syndrome. Neurobiology of Disease. 45, 1145-1152 (2012).
- Qin, M., et al. Altered cerebral protein synthesis in fragile X syndrome: studies in human subjects and knockout mice. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 33, 499-507 (2013).
- Qin, M., Kang, J., Burlin, T. V., Jiang, C., Smith, C. B. Postadolescent changes in regional cerebral protein synthesis: an in vivo study in the FMR1 null mouse. The Journal of Neuroscience: the Official Journal of the Society for Neuroscience. 25, 5087-5095 (2005).
- Qin, M., et al. R-Baclofen Reverses a Social Behavior Deficit and Elevated Protein Synthesis in a Mouse Model of Fragile X Syndrome. The International Journal of Neuropsychopharmacology. 18, pyv034 (2015).
- Qin, M., et al. Cerebral protein synthesis in a knockin mouse model of the fragile X premutation. ASN Neuro. 6, (2014).
- Smith, C. B., Kang, J. Cerebral protein synthesis in a genetic mouse model of phenylketonuria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 11014-11019 (2000).
- Reivich, M., Jehle, J., Sokoloff, L., Kety, S. S. Measurement of regional cerebral blood flow with antipyrine-14C in awake cats. Journal of Applied Physiology. 27, 296-300 (1969).
