Summary
Protein syntese er en kritisk biologisk proces for celler. I hjernen, er det nødvendigt for adaptive ændringer. Måling af satser for proteinsyntese i den intakte hjerne kræver omhyggelige metodologiske overvejelser. Her præsenterer vi L-[1-14C]-leucin kvantitativ autoradiographic metode til bestemmelse af regionale satser for cerebral proteinsyntese in vivo.
Abstract
Protein syntese er nødvendig for udvikling og vedligeholdelse af neuronal funktion og er involveret i adaptive ændringer i nervesystemet. Desuden menes det, at dysregulering af proteinsyntese i nervesystemet kan være en kerne fænotype i nogle udviklingsmæssige lidelser. Nøjagtig måling af raterne af cerebral proteinsyntese i dyremodeller er vigtig for at forstå disse lidelser. Den metode, vi har udviklet, var designet til at blive anvendt til studiet af vågen, opfører dyr. Det er en kvantitativ autoradiographic metode, så det kan give satser i alle regioner af hjernen samtidig. Metoden er baseret på brugen af en Tracer aminosyre, L-[1-14C]-leucin, og en kinetisk model af opførsel af L-leucin i hjernen. Vi valgte L-[1-14C]-leucin som Tracer, fordi det ikke fører til fremmede mærkede metaboliske produkter. Det er enten indarbejdet i protein eller hurtigt metaboliseres til at give 14co2 , som er fortyndet i en stor pulje af ikke-mærket Co2 i hjernen. Metoden og modellen giver også mulighed for bidrag af ikke-mærket leucin afledt af vævs proteolyse til vævs forløberen for proteinsyntese. Metoden har den rumlige opløsning til at bestemme proteinsyntese satser i celle og neuropil lag, samt hypothalamus og kranielle nerve kerner. For at opnå pålidelige og reproducerbare kvantitative data er det vigtigt at overholde proceduremæssige detaljer. Her præsenterer vi de detaljerede procedurer for den kvantitative autoradiographic L-[1-14C]-leucin metode til bestemmelse af regionale satser for proteinsyntese in vivo.
Introduction
Protein syntese er en vigtig biologisk proces, der kræves for langsigtet adaptiv ændring i nervesystemet1. Inhibe ring proteinsyntese blokerer langsigtet hukommelse opbevaring i både hvirvelløse dyr og hvirveldyr2. Protein syntese er afgørende for vedligeholdelse af de sene faser af nogle former for langsigtede potensering (LTP) og langvarig depression (LTD)3, neuronal overlevelse under udvikling4, og for generel vedligeholdelse af neuronen og dens synaptisk tilslutninger5. Måling af satser for hjernen proteinsyntese kan være et vigtigt redskab til at studere adaptive ændringer samt neuroudviklingsmæssige lidelser og lidelser relateret til indlæring og hukommelse.
Vi har udviklet en metode til at kvantificere satserne for cerebral proteinsyntese in vivo i et vågen dyr, der tilbyder iboende fordele i forhold til andre teknikker, der estimerer satser i ex vivo eller in vitro præparater af hjernevæv6. Først og fremmest er anvendeligheden til målinger i den intakte hjerne i et vågen dyr. Dette er en vigtig overvejelse, fordi det giver mulighed for målinger med synaptisk struktur og funktion på plads og uden bekymringer om post mortem effekter. Desuden opnår den kvantitative autoradiografiske tilgang, som vi anvender, en høj grad af rumlig lokalisering. Mens energien af 14C er sådan, at vi ikke kan lokalisere Tracer på subcellulære eller cellulære niveau, kan vi måle satser i cellelag og små hjerneområder som hypothalamus kerner, med ca. en 25 μm opløsning7.
En af udfordringerne ved in vivo-målinger med aktive er at sikre, at radioaktivt mærkede måles i produktet af en reaktion af interesse i stedet for ureageret mærket forløber eller andre fremmede mærkede metaboliske produkter6. Vi valgte L-[1-14C]-leucin som Tracer aminosyre, fordi det enten er indarbejdet i protein eller hurtigt metaboliseres til 14Co2, som er fortyndet i den store pulje af ikke-mærket Co2 i hjernen som følge af den høje hastighed af energimetabolisme8. Desuden findes alle 14c, der ikke er indarbejdet i protein, primært som fri [14c]-leucin, som over 60 minutters forsøgsperiode er næsten helt ryddet fra vævet6. Proteiner er derefter fastgjort til væv med formalin og efterfølgende skylles med vand for at fjerne enhver fri [14C]-leucin før Autoradiografi.
En anden vigtig overvejelse er spørgsmålet om fortynding af den specifikke aktivitet af prækursor aminosyre puljen ved ikke-mærkede aminosyrer afledt af vævs proteolyse. Vi har vist, at i voksne rotte og mus, omkring 40% af forløberen leucin pool for proteinsyntese i hjernen kommer fra aminosyrer afledt af protein opdeling6. Dette skal indgå i beregningen af de regionale satser for cerebral Proteinsyntese (rCPS) og skal bekræftes i undersøgelser, hvor dette forhold kan ændre sig. Metodens teoretiske grundlag og antagelser er blevet præsenteret i detaljer andetsteds6. I dette dokument fokuserer vi på de proceduremæssige spørgsmål i forbindelse med anvendelsen af denne metode.
Denne metode har været anvendt til bestemmelse af RCPS i jordegern9, får10, rhesus aber11, rotter12,13,14,15,16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21, en musemodel af tuberøs sklerose Complex22, en musemodel af skrøbelige x-syndrom23,24,25,26, skrøbelige x premutation mus27, og en musemodel af fenylketonuri28. I dette manuskript præsenterer vi procedurerne for måling af Rcp'er med den in vivo Auto adiografiske L-[1-14C]-leucin-metode. Vi præsenterer rCPS i hjernen regioner af en vågen kontrol mus. Vi viser også, at in vivo administration af anisomycin, en inhibitor af oversættelse, afskaffer proteinsyntesen i hjernen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bemærk: alle dyr procedurer blev godkendt af National Institute of Mental Health Animal Care og use udvalget og blev udført i henhold til National Institutes of Health retningslinjer om pasning og anvendelse af dyr.
En oversigt over protokollen er præsenteret i figur 1.
1. kirurgisk implantat katetre i en femoral vene og arterie til administration af Tracer og indsamling af tidsindstillede arterielle blodprøver hhv. Gennemfør kirurgi mindst 22 timer før administration af Tracer. Kirurgi kræver ca. 1 h for at fuldføre.
- Saml de nødvendige materialer: sterile kirurgiske instrumenter (kirurgisk saks, mikro-saks, pincet, tre kirurgiske hudkroge), udstyr til isofluran anæstesi (isofluran vaporizer, aktiv gasscavenger, forseglet anæstesi kammer, anæstesi næse kegle), steril kirurgi Stage, pels klippere, 70% ethanol, betadin, steril gaze, kirurgisk tape, kommercielle håndvarmere, kirurgisk mikroskop, steril 0,9% natriumchlorid (saltvand), steril heparin 100 USP enheder/mL i 0,9% natriumchlorid (heparinized saltvand), sterile 5 20-cm strimler af 6-0 absorberbare sutur, sterile 25-cm tråde af PE-8 og PE-10 polyethylen katetre med en ende skåret ved 45o, sterile 1 CC sprøjter, sterile 32 gauge nåle, kautery udstyr, sterile 15-20 cm hule rustfri stålstang (2,5 mm indvendig diameter, 3 mm udvendig diameter), lokalanæstetika (bupivacaine og lidocain salve), og et dyr kabinet med drejelig vedhæng setup (30 cm fjeder tether med knap, drejelig, drejelig Mount og arm, 20 X 13 cm klar cylindrisk container).
- Forbered dyr til kirurgi.
- Sørg for, at der anvendes korrekte aseptiske og sterile teknikker som krævet af din institution.
- Veje dyret. Dyret skal være mindst 25 g for en vellykket operation.
- Dyret placeres i et forseglet plexiglas kammer, og kammeret tilsluttes til isofluran anæstesiapparatet. Indstil strømningshastigheden til 2,5 L/min for mænd og 3,0 L/min for kvinder på 1,5% isofluran i O2. Efter ca. 2 min, Sørg for, at musen er passende bedret af mangel på en tilbagetrækning refleks med en tå knivspids.
- Når bedøvet, fjerne musen fra kammeret og lægge det i en udsat position med sit ansigt inde i anæstesi næse kegle. Indstil næse keglen til at modtage gas fra vaporizer og til at returnere gas til gasscavenger. Scavenger vil fange isofluran i et kulfilter.
- Brug Clippers til at barbere pels mellem skulderbladene. Sørg for at sterilisere den barberede region korrekt, skiftevis tre gange mellem betadin og ethanol Scrubs.
- Vend musen over i en liggende position holde ansigtet i næsen kegle. Tape ned det venstre ben på kirurgi scenen og bruge Clippers at barbere pels fra venstre inderlår til den øvre venstre del af maven. Sørg for at sterilisere den barberede region korrekt, skiftevis tre gange mellem betadin og ethanol Scrubs.
- Skub en aktiveret kommercielt tilgængelig håndvarmer, pakket ind i gaze, under musen. Tape ned i det højre ben på Operations stadiet.
- Indsæt kateteret i den venstre femorale vene.
- Ved hjælp af et kirurgisk mikroskop, bruge kirurgisk saks til at gøre en 1 cm snit fra den øvre mediale del af venstre lår rostrally mod midterlinjen, afslørende femoral arterie og vene.
- Træk løs hud tilbage med kirurgiske hudkroge for yderligere at udsætte vesicles.
- Påfør steril 0,9% natriumchlorid til udsatte områder for at opretholde tilstrækkelig fugt.
- Brug pincet til Blunt dissect, adskillelse bindevæv omkring en lille del af femoralis arterien og vene. Omhyggeligt, adskille arterien og vene (figur 2).
- Brug pincet til at tråde en streng af absorberbare sutur (streng A) under både femoral vene og arterie på det mest laterale punkt af snittet. Træk suturen halvvejs igennem, så enderne er endnu.
- På et mere proksimalt punkt til Lyin, brug pincet til at tråde en anden sutur (streng B) under kun femoral vene. Forsigtigt binde en halv knude, der vil blive brugt til at begrænse blodgennemstrømningen.
- På et punkt mellem linje A og streng B anvendes pincet til at tråde en tredje sutur (streng C) under kun femoral vene. Forsigtigt binde en fuld knude, der vil blive brugt til at begrænse blodgennemstrømningen. Vær omhyggelig med ikke at rive venen.
- Forsigtigt slæbebåd på streng B for at begrænse blodgennemstrømningen. Brug en hemostat til forsigtigt at trække streng B for at opretholde begrænset blodgennemstrømning.
- Skær et lille hul i det begrænsede område af femoral vene med mikrosaks, og Indsæt forsigtigt den vinklede ende af PE-8-slangen (tidligere skyllet med heparin-saltvand) mod strand B. Når det er indsat, slip streng B's spænding og guide kateteret længere op i venen. Spænd streng B omkring den vene, der indeholder kateteret.
- Ved hjælp af streng C, binde en ekstra knude omkring kateteret. Sørg for, at denne knude ikke fanger femoralis arterie.
- Træk forsigtigt sprøjtecylinderen tilbage for at fylde slangen delvist med blod for at sikre, at kateteret er implanteret korrekt.
- Efter samme procedure indsættes et PE-10 kateter i den venstre femorale arterie.
- Komplet kirurgisk indgreb.
- Når både femorale vene og arterie katetre er blevet sikret, binde streng A i en knude omkring begge katetre.
- Skær alle overskydende suturer og fjerne hud kroge. Skyl det arterielle kateter med hepariniseret saltvand for at forhindre størkning. Cauterize enderne af begge katetre til at skabe en forsegling.
- Placer musen i den udsatte position og lav et lille snit i bunden af halsen og anvende saltvand til det udsatte område.
- Indsæt hule metalstang subdermally fra halsen indsnit til femoral indsnit. Snake katetre gennem den hule stang og ud af halsen incision. Fjern den hule stang. Implantering katetre subdermally vil forhindre mus i at beskadige katetre.
- Påfør bupivacaine til siderne af såret. Luk femoral indsnit med sutur. Tilsæt lidocain salve over lukket, sutureret sår.
- Snake katetre gennem en 30 cm fleksibel hule slange (fjeder tether) og sutur knappen af foråret tether under huden. Påfør bupivacaine til siderne af såret. Sutur knappen af foråret tether under huden. Tilsæt lidocain salve over lukket, sutureret sår.
- Flyt musen til en klar cylindrisk beholder (20 cm høj, 13 cm diameter) med en drejelig Mount og arm til at huse dyret i restitutionsperioden. Placer en håndvarmere under beholderen for at holde dyret varm.
- Skru toppen af fjederen til en drejning og fastgør drejningen til dreje armen, der er fastgjort til den cylindriske beholder. Sørg for at musen har fuld bevægelsesfrihed og katetre kan tilgås.
- Anbring et kærne låg, der ikke forstyrrer drejemekanismen over dyrets kabinet. Se figur 3 for den fulde opsætning.
- Lad musen til at komme sig. Mindst 22 h anbefales.
2. Forbered L-[1-14C] leucin injektionsvæske, opløsning, og 16% (w/v) 5-sulfosalicyl syre (SSA) dihydrat opløsning til deproteiniserende plasmaprøver. I SSA-opløsningen omfatter også 0,04 mM norleucin og 1 μCi/mL [H3] leucin som interne standarder for aminosyreanalyse og analyse af Tracer koncentrationen i de syre opløselige plasma fraktioner hhv. Opbevar SSA op til to måneder ved 4 °C.
- Køb kommercielt tilgængelige L-[1-14C] leucin (50-60 mCi/mmol), som sælges som en opløsning i 2% ethanol eller 0,1 N HCL. blæse tør en kendt aktivitet af traceren under en blid strøm af kvælstof og rekonstruere i en opløsning af steril normal saltvand lavet op til en koncentration på 100 μCi/mL.
3. Giv L-[1-14C] leucin intravenøst, og saml arterielle blodprøver.
- Saml de nødvendige materialer: 18 1,5 mL mikrorør til deproteiniserende plasmaprøver (tilsæt 70 mL afioniseret vand til hvert rør), 17 250mL hætteglas skær (15 skær til opsamling af arterielle blodprøver og 2 skær til samling af dødt rum blod, der skal reinjiceres. For at begrænse indsamlingen af ekstra og unødvendigt blod, små, tynde hætteglas skær med koniske bunde, der giver mulighed for tilgængelig Pipettering af supernatanten plasma anbefales), 2 microkapillar rør (32 X 0,8 mm, til hæmatokrit måling), 1 heparin og lithiumfluorid-belagt mikrocentrifuge glas (til forebyggelse af henholdsvis størkning og glykolyse), hæmostatika (dækker spidser med tygon slange, så klemmer ikke beskadiger PE-slanger), blodglucosemonitor, blodtryks transducer, 1 mL sterile sprøjter (til saltvands flushes) og kommercielt tilgængelig eutanasi-opløsning (fortyndet 1:1 i deioniseret vand (til mus)).
- Sikre, at dyret befinder sig i en normal fysiologisk tilstand ved begyndelsen af forsøget.
- Klem den arterielle slange omkring 2 cm fra enden og afbrød spidsen, hvilket skaber en åbning for blod til at flyde. Derefter unclamp slange og indsamle dødt rum blod ((c. 30 mL) til at indsamle eventuelle resterende saltvand og/eller blod fra tidligere trækninger), og, i et separat rør, indsamle en kontrolprøve (ca. 30 μL), hæmatokrit prøver (ca. halvdelen af Kapillarrøret volumen), og en glucose prøve (ca. 20 μL).
- Mål hæmatokrit ved at tilslutte den ene ende med tætningsmiddel kit og centrifuge i 1 min ved 4500 x g. mål forholdet mellem mængden af røde blodlegemer og den totale mængde af blodet. Hvis et dyr har en hæmatokrit under 30%, skal du ikke fortsætte studiet.
- Brug en kommercielt tilgængelig blodglucosemonitor til at måle Glukoseniveauet i en dråbe blod.
- Centrifugerings prøve i 2 min ved 18.000 x g til separat plasma. Deproteinize plasmaprøver som følger: Tilsæt 5 μL plasma til 70 μL deioniseret vand i et 1,5 mL mikrorør, tilsæt 25 μL af 16% SSA-opløsningen og vortex. Placer på is i 30 minutter før frysning på tøris.
- Returnere dødt rum blod til dyret gennem venøs linje, efterfulgt af en hepariniseret saltvand flush for at forhindre overskydende blodtab.
- Tilslut arteriel linje til en blodtryk transducer til at måle gennemsnitlige arteriel blodtryk.
- Efter at have taget prøverne skal du sørge for at re-klemme arteriel linje og at skylle linjen med en lille (50 ml) volumen af hepariniseret saltvand.
- Administrer Tracer intravenøst og indsamle tidsindstillede arterielle blodprøver.
- Brug Y-stikket til at fastgøre en sprøjte med Tracer (100μCi/kg) og en sprøjte med 50 mL sterilt saltvand for at skylle venøs linje efter injektion af Tracer. Tilslut Y-stikket til venøs-linjen.
- Initiere studiet ved samtidigt at starte et stopur og injicere Tracer. Skyl venøs linje med saltvand (c. 100mL) umiddelbart efter injektionen.
- Saml blodprøver 1-7 kontinuerligt i løbet af de første 2 min af eksperimentet på samme måde. Efter opsamling af 7. prøve, indsamle 30 μL døde-Space blod før hver resterende prøve. Prøverne 8-14 opsamles ved henholdsvis 3, 5, 10, 15, 30, 45 og 60 min.
- Behandl blodprøver umiddelbart efter indsamlingen, som det blev beskrevet for kontrolprøven. Hvis der er en forsinkelse, Placer prøverne på is. Genaktiver dødt rumblod i arterien via det arterielle kateter, og skyl med heparin-saltvand.
- På et tidspunkt under forsøget, proces tre interne standarder ved at tilføje 25 μL 16% SSA, 0,04 mM norleucin, og 1 mCi/mL [3H] leucin til 75 μl vand, vortex og sted på is.
- Efter opsamling af den 14.60 min., indsprøjtes ca 0,2 ml B-euthanasia-D i venøs linje for at aflive dyret. Optag dødstidspunktet.
- Skru dyret af det drejelige beslag og fjern det fra dyrets kabinet. Forsigtigt fjerne hjernen, sted på aluminiumsfolie, og fryse på tøris. Du må ikke fryse hjerner med flydende nitrogen, da hjernen kan knække. Opbevar hjernen, prøverne og de interne standarder ved-80 °C, indtil de er klar til behandling. Behandling kan udføres på ethvert tidspunkt bagefter.
4. Analysér koncentrationerne af leucin og L-[1-14C] leucin i plasmaprøver.
- Tø prøver og interne standarder på is, vortex og centrifuge 18.000 x g i 5 min ved 2 °C. Supernatanten brøken vil indeholde den gratis mærkede og ikke-mærkede leucin.
- Overfør 40 μL af supernatanten til et flydende scintillationshætte glas, og tilsæt scintillationscocktail. Kvantificere disintegrationer pr. minut (DPM) på 3timer og 14c ved hjælp af flydende scintillationstælling og en slukke-kurve, der er designet til samtidig dobbelt etiket (3timer og 14c) tælling.
- For at kvantificere plasma-leucin-koncentrationerne skal der anvendes et HPLC-system med en natrium kation udvekslings kolonne og efter kolonne-derivatisering med o-phthaldehyd og fluorometrisk detektion.
- Indstil HPLC til følgende specifikationer: fluorometer excitation på 330 nm og emission af 465 Nm. Den mobile fase består af natrium eluant, pH 7,40, og natrium eluant + 5% sulfolan, pH 3,15. Indstil buffer strømningshastigheden på 0,400 mL/min og derivatiseringinstrumentets strømningshastighed til 0,300 mL/min. Indstil kolonne temperaturen til 48 °C og reaktor temperatur til 45 °C.
- Kalibrer systemet med en række aminosyre koncentrationer (herunder norleucin) mellem 30 og 500 pmol/10mL. Kalibreringskurven er lineær. Aminosyre koncentrationerne af de testede 10 mL injektions prøver falder inden for denne kalibrerings kurves intervaller.
5. Udfør kvantitativ Autoradiografi.
- Forbered hjernen sektioner 20 μm i tykkelse for autoradiography. Ved hjælp af en kryostat ved-20 °C.
- Tø montere serielle hjerne sektioner på gelatine-belagte slides. Lufttørre.
- Vask slides i fem ændringer af 10% formalin for 30 min pr ændring, efterfulgt af en kontinuerlig strøm af deioniseret vand i 1 h. dæk slidene løst med folie for at undgå støv og lad det tørre i 24 timer.
- Arranger slides i en røntgenfilm kassette (kassetter, der passer til 20X25 cm mammografi film anbefales) sammen med et sæt af [14C] methylmethacrylat standarder, som tidligere var kalibreret mod væv af kendte 14c koncentrationer som beskrevet29. Standarder kan købes kommercielt, men sikre, at de dækker en række 2-300 mCi/g væv og er kalibreret mod 20 μm vævs tykkelse. Under rødt safelight, Placer et stykke mammografi film, emulsion side ned, på toppen af sektionerne.
- Forsegl kassetterne og Placer dem i en sort pusle pose, og opbevar dem i et kabinet i 40-45 dage.
- Udvikle film i henhold til producentens anvisninger. Bemærk: automatiseret film udvikling anbefales ikke, fordi baggrunden kan være ujævn og kan påvirke kvantificeringen.
6. Analysér billeder.
Bemærk: et kommercielt tilgængeligt program til billedanalyse kombineret med et CCD-kamera og en fluorescerende lysboks med jævn belysning anbefales. De relative optiske tætheder i den oplyste film detekteres af CCD-kameraet.
- Konstruere en kalibreringskurve for optisk densitet (OD) v. tissue 14C koncentration baseret på ODs af sættet af kalibrerede standarder på filmen. Tilpas disse data (herunder blank eller baggrund) til en polynomium ligning. Enten en anden eller tredje grad polynomium ligning passer meget godt.
- For at analysere specifikke hjerneområder skal du finde interesseområdet (ROI) i seks til otte sektioner i forhold til et hjerne Atlas. Registrere ODs of the pixels inden for et ROI i alle sektioner og, baseret på kalibreringskurven, beregne vævs 14C koncentrationen i hver pixel. Beregne den gennemsnitlige vævs 14C koncentration i Roi.
7. beregning af Rcp'er. Beregn rCPS i hvert ROI ved hjælp af følgende ligning:
Hvor P * (t) er den vejede gennemsnitlige vævskoncentration på 14c i ROI, cP(t) og c*P(t) er de arterielle plasmakoncentrationer af umærkede og mærkede leucin på tid, t, t er det tidspunkt, hvor dyret døde ( ca. 60 min.), og λ er den fraktion af leucin i vævs forløberen, der kommer fra plasmaet. Evaluering af λ foretages i et særskilt eksperiment 6. λ er blevet evalueret i WT, Fmr1 knockout, TSC+/-og PKU-mus 6,22,25,28. Hvis et eksperiment involverer enten genetiske eller farmakologiske ændringer, der kan påvirke satserne for proteinsyntese, nedbrydning eller metabolisme af leucin, bør λ evalueres under de nye betingelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Her viser vi et repræsentativt eksperiment, der viser virkningerne af tidligere administration af en proteinsyntese hæmmer på Rcp'er. Anisomycin i normalt saltvand blev administreret til en voksen C57/BL6 mandlig vild-type mus subkutant (100 mg/kg) 30 min før initiering af rCPS-bestemmelse. Virkningerne af anisomycin-behandling sammenlignet med et køretøjs behandlet kontrol dyr viser, at Rcp'er næsten ikke er målbart i den anisomycin-behandlede mus (figur 4). Disse data udgør en validering af, at in vivo Auto-adiographic L-[1-14C]-leucin-metoden måler rater for proteinsyntese i hjernen.
Vi præsenterer en figur af L-[1-14C]-leucin autoradiogrammer på fire niveauer af hjernen til at demonstrere opløsningen af metoden (figur 5). Illustreret er celle lagene i den olfaktoriske pære (figur 5a og B), hippocampus (figur 5c) og cerebellum (figur 5g). Kerner i hypothalamus (figur 5D), Pons (figur 5E og F), og hjernen stammen (figur 5H) er også tydeligt set i autoradiogrammer. Vi viser også de kvantitative regionale satser for proteinsyntese i den frontale cortex (5,88 nmol/g/min) (figur 6a) og dorsale hippocampus (5,35 nmol/g/min) (figur 6b) af et typisk kontroldyr.
Figur 1: skematisk, der repræsenterer trinene i hele rCPS-protokollen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: billede af eksponeret femoral arterie og femoral vene. Sideløbende med hinanden, er femoral arterien vist over femoral vene. Den femorale vene har også en dybere rød farve end femoralis arterien. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: billede af anbefalet dyre kabinet set-up for rCPS-eksperiment. Det udnytter en klar cylindrisk dyr kabinet med drejelig vedhæng forbundet til en fjeder tether. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: repræsentative billeder fra et køretøj behandlet dyr (a) sammenlignet med et dyr, der blev behandlet med anisomycin (100 mg/kg, subkutant) 30 min før administration af Tracer (B). Satser for proteinsyntese er proportional med niveauet af mørket i billedet. Anisomycin reducerer drastisk de målte satser for proteinsyntese, hvilket indikerer specificiteten af denne metode. Skala bjælken øverst til højre på A repræsenterer 1 mm og gælder for begge billeder. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: digitaliserede autoradiogrammer fra en vågen opfører musen på niveauet af olfaktoriske pære (A, B), hypothalamus (C, D), Pons (E, F), cerebellum (g), og hjernestammen (g, H). De mørkere regioner har højere rCPS. Skalalinjen i panel G gælder for paneler A, C, E og G. Autoradiogrammer til højre (B, D, F og H) er forstørrede billeder fra de områder, der er angivet på billederne til venstre, og skala bjælken i panel H gælder for paneler B , D, F og H. forkortelser er som følger: FrA, frontal Association cortex; OB, olfaktoriske pære; Ao, forreste olfaktoriske Nucleus; GL, glomerulær lag; EPl, eksternt plexiformlag; BLA, basolaterale amygdala; py, pyramideformet celle lag; dHi, dorsale hippocampus; GD, dentate gyrus; MHb, mediale habenula; RT, thalamisk retikulær kerne; VMH, ventrale mediale hypothalamus kerne; ARC, bueformede Nucleus; EW, Edinger-Westphal kerne; R, rød kerne; PN, Pontine kerne; ML, Molekylær lag; GL, granulært lag; PC, Purkinje cellelag; Cu, cuneate Nucleus; AP, område postrema; 10, dorsale motor kerne af vagus; 12, hypogloal kerne. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: digitaliseret autoradiogrammer fra en vågen opfører kontrol mus på niveauet af frontal cortex (A) og dorsale hippocampus (B). Satserne for cerebral proteinsyntese er farvekodet i billederne i henhold til farvebjælken vist til højre. Skala bjælken nederst til venstre på A repræsenterer 1 mm og gælder for begge billeder. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi fremlægger en kvantitativ metode til bestemmelse af de regionale satser for cerebral Proteinsyntese (rCPS) in vivo i forsøgsdyr. Denne metode har betydelige fordele i forhold til eksisterende metoder: 1. Målingerne foretages i vågen opfører dyret, så de afspejler igangværende processer i den fungerende hjerne. 2. Målingerne foretages ved hjælp af kvantitativ Autoradiografi, der giver mulighed for at bestemme Rcp'er i alle regioner og subregioner af hjernen samtidigt. 3. metodens kinetiske model tager hensyn til muligheden for genanvendelse af ikke-mærkede aminosyrer afledt af vævsprotein nedbrydning og dens virkning på prækursorens pulje for proteinsyntese6.
Den primære begrænsning af denne metode er, at det er tidskrævende og krævende. Der henviser til, at det er fristende at anvende enklere og højere metoder til gennemstrømning, og at begrænsningerne af de indhentede data skal anerkendes.
På grund af kompleksiteten af at måle rCPS i en intakt mus, problemer med vedligeholdelse af en normal fysiologisk tilstand, indsamling af passende blodprøver, og undgå eventuelt interfererende betingelser kan opstå. Kirurgisk implantation af venøse og arterielle katetre er udfordrende. Som med enhver kirurgisk procedure, især med håndteringen af delikat vaskulatur, der er en iboende risiko for dødelighed af dyret. For os er det sjældent (ca. 1%). I løbet af den efterfølgende 22 h restitutionsperiode, lejlighedsvis (ca. 4%) et dyr vil trække et kateter ud. Under målingen er det vigtigt, at katetre er patent, og at dyrene befinder sig i en normal fysiologisk tilstand. I vores seneste erfaring, kan arteriel blod ikke opsamles i omkring 2% af dyrene og omkring 1% af dyrene havde en lav hæmatokrit (< 40%) eller lavt arterielt blodtryk (< 85 mm Hg), hvilket tyder på blodtab under kirurgi og/eller bedring.
Ved fremstilling af hjerne sektioner for Autoradiografi er det vigtigt at sikre, at snittykkelsen er 20 μm, fordi det er den snittykkelse, som [14C] methylmethacrylat standarder er blevet kalibreret. Vær forsigtig med at sikre god kvalitet sektioner, dvs uden tårer, folder, eller bobler som disse ufuldkommenheder vil forstyrre den autoradiographic analyse. Vi udvikler autoradiographic film i hånden snarere end i en automatiseret film processor, fordi vi finder, at baggrunds optisk tæthed kan være ujævn efter automatiseret behandling, og dette kan påvirke kvantificeringen.
I ligningen for rCPS omfatter vi en faktor, lambda (λ), det er den fraktion af leucin, der kommer fra arteriel plasma, resten kommer fra genanvendelse af aminosyrer afledt af vævsprotein nedbrydning6. Vi har evalueret λ i separate eksperimenter i WT og Fmr1 ko (skrøbelig X model) C57Bl/6j mus og vist, at dens værdi er 0,603. Værdien af λ kan variere afhængigt af art, genetisk baggrund eller tilstedeværelsen af en genetisk mutation. Derfor, hvis designe proteinsyntese eksperimenter for andre modeller, vil man nødt til at evaluere λ før en nøjagtig måling kan opnås.
Vores arbejde i genetiske musemodeller af neuroudviklingsmæssige lidelser viser, at denne metode afslører ændringer i RCPS i disse modeller og i nogle tilfælde respons på farmakologiske behandlinger22,23,25 , 26. det er også tænkeligt, at RCPS-målingen også kan overvåge degenerative ændringer i hjernen under forhold såsom modeller af Alzheimers sygdom, Parkinsons sygdom, skrøbelige X tremor ataksi syndrom, traumatisk hjerneskade, etc. i disse modeller, kan det være muligt at spore tidlige degenerative forandringer og muligvis også reaktioner på tidlige interventioner. RCPS-metoden kan anvendes sammen med Immunhistokemi i parallelle sektioner for yderligere at undersøge specifikke hjerneændringer25. Kort sagt er den kvantitative autoradiografiske L-[1-14C]-leucin-metode ideel til nøjagtig bestemmelse af RCPS-værdier in vivo. Det giver betydelige fordele med hensyn til nøjagtighed og anvendelighed på in vivo-betingelser i forhold til eksisterende metoder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne anerkende Zengyan XIa for genotypebestemmelse af musene, Tom Burlin til behandling af aminosyrer og film, og Mei Qin for at udføre nogle af de rCPS eksperimenter. Denne forskning blev støttet af Intramural Research program af NIMH, ZIA MH00889. RMS blev også støttet af en autisme taler postdoc Fellowship 8679 og en FRAXA postdoc stipendium.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | The Jackson Laboratory | 003024 | Fmr1 knockout breeding pairs |
| Anisomycin | Tocris Bioscience | 1290 | |
| Microhematocrit Tubes | Drummond Scientific | 1-000-3200-H | capillary tubes |
| Critoseal Capillary Tube Sealant | Leica Microsystems | 39215003 | sealant putty |
| Glass vial inserts | Agilent | 5183-2089 | used to collect blood samples |
| Digi-Med Blood Pressure Analyzer | Micro-Med Inc. | BPA-400 | blood pressure analyzer |
| Bayer Breeze 2 Blood Glucose Monitoring System | Bayer Breeze | 9570A | glucose meter |
| Gastight syringe | Hamilton Co. | 1710 | tuberculin glass syringe |
| HeatMax HotHands-2 Hand Warmers | HeatMax | Model HH2 | warming pads |
| Heparin Lock Flush Solution | Fresenius Kabi USA, LLC | 504505 | heparin saline |
| Clear animal container | Instech | MTANK/W | animal enclosure |
| Spring tether | Instech | PS62 | catheter tube/rodent attachment |
| Swivel | Instech | 375/25 | hooks to spring tether |
| Swivel arm and mount | Instech | SMCLA | hooks to swivel and animal enclosure |
| Tether button | Instech | VAB62BS/22 | attaches to bottom of spring tether |
| Stainless steel tube | Made in-house | N/A | used to snake catheters through mouse |
| Matrx VIP 3000 | Matrx | 91305430 | isoflurane vaporizer |
| Isoflurane | Stoelting Co. | 50207 | isoflurane/halothane adsorber |
| Clippers | Oster Finisher | Model 59 | |
| Surgical skin hooks | Made in-house (??) | N/A (??) | |
| 0.9% Sodium Chloride Saline | APP Pharmaceuticals LLC | 918610 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11274-20 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| Microscissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| UNIFY silk surgical sutures | AD Surgical | #S-S618R13 | 6-0 USP, non-absorbable |
| PE-8 polyethylene tubing | SAI Infusion Technologies | PE-8-25 | |
| Syringe | Becton Dickinson and Co. | 309659 | 1cc/mL |
| PE-10 polyethylene tubing | Clay Adams | 427400 | |
| MCID Analysis | Imaging Research Inc. | Version 7.0 | optical density analysis |
| Gelatin-coated slides (75x25mm) | FD Neurotechnologies | PO101 | |
| Cryostat | Leica | CM1850 | |
| Super RX-N medical x-ray film | Fuji | 47410-19291 | |
| Hypercassettes (8x10 in) | Amersham Pharmacia Biotech | 11649 | |
| [1-14C]leucine | Moravek | MC404E | |
| Microcentrifuge tube | Sarstedt Aktiengesellschaft & Co. | 72.692.005 | used to deproteinize blood samples |
| Glass pasteur pipette | Wheaton | 357335 | |
| Glass wool | Sigma-Aldrich | 18421 | |
| Nitrogen | NIH Supply Center | 6830009737285 | |
| Scintillation fluid | CytoScint | 882453 | |
| Liquid scintilllation counter | Packard Tri-Carb | 2250CA | |
| Amino acid analyzer | Pickering Laboratories | Pinnacle PCX | |
| HPLC unit | Agilent Technologies | 1260 Infinity | include 1260 Bio-Inert Pump |
| Surgical microscope | Wild Heerbrugg | M650 | |
| Sulfosalicylic acid | Sigma-Aldrich | MKBS1634V | 5-sulfosalicylic acid dihydrate |
| Norleucine | Sigma | N8513 | |
| 1.0 N HCl | Sigma-Aldrich | H9892 | |
| [H3]leucine | Moraevk | MC672 | |
| Falcon tube | Thermo Scientific | 339652 | 50 mL conical centrifuge tubes |
| Stopwatch | Heuer Microsplit | Model 1000 | 1/100 min |
| Euthanasia Solution | Vet One | H6438 | |
| Northern Light Precision Illuminator | Imaging Research Inc. | Model B95 | fluorescent light box |
| Micro-NIKKOR 55mm f/2.8 | Nikon | 1442 | CDD camera |
References
- West, A. E., et al. Calcium regulation of neuronal gene expression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 11024-11031 (2001).
- Siegel, G., Agranoff, B., Albers, R. W., Fisher, S., Uhler, M. Basic Neurochemistry. , 6th ed, Lippincott-Raven. New York. (1999).
- Nguyen, P. V., Abel, T., Kandel, E. R. Requirement of a critical period of transcription for induction of a late phase of LTP. Science. 265, 1104-1107 (1994).
- Mao, Z., Bonni, A., Xia, F., Nadal-Vicens, M., Greenberg, M. E. Neuronal activity-dependent cell survival mediated by transcription factor MEF2. Science. 286, 785-790 (1999).
- Pfeiffer, B. E., Huber, K. M. Current advances in local protein synthesis and synaptic plasticity. The Journal of Neuroscience: the Official Journal of the Society for Neuroscience. 26, 7147-7150 (2006).
- Smith, C. B., Deibler, G. E., Eng, N., Schmidt, K., Sokoloff, L. Measurement of local cerebral protein synthesis in vivo: influence of recycling of amino acids derived from protein degradation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85, 9341-9345 (1988).
- Schmidt, K. C., Smith, C. B. Resolution, sensitivity and precision with autoradiography and small animal positron emission tomography: implications for functional brain imaging in animal research. Nuclear Medicine and Biology. 32, 719-725 (2005).
- Banker, G., Cotman, C. W. Characteristics of different amino acids as protein precursors in mouse brain: advantages of certain carboxyl-labeled amino acids. Archives of Biochemistry and Biophysics. 142, 565-573 (1971).
- Frerichs, K. U., et al. Suppression of protein synthesis in brain during hibernation involves inhibition of protein initiation and elongation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 14511-14516 (1998).
- Abrams, R. M., Burchfield, D. J., Sun, Y., Smith, C. B. Rates of local cerebral protein synthesis in fetal and neonatal sheep. The American Journal of Physiology. 272, R1235-R1244 (1997).
- Nakanishi, H., et al. Positive correlations between cerebral protein synthesis rates and deep sleep in Macaca mulatta. The European Journal of Neuroscience. 9, 271-279 (1997).
- Sun, Y., Deibler, G. E., Sokoloff, L., Smith, C. B. Determination of regional rates of cerebral protein synthesis adjusted for regional differences in recycling of leucine derived from protein degradation into the precursor pool in conscious adult rats. Journal of Neurochemistry. 59, 863-873 (1992).
- Scammell, T. E., Schwartz, W. J., Smith, C. B. No evidence for a circadian rhythm of protein synthesis in the rat suprachiasmatic nuclei. Brain Research. 494, 155-158 (1989).
- Smith, C. B., Eintrei, C., Kang, J., Sun, Y. Effects of thiopental anesthesia on local rates of cerebral protein synthesis in rats. The American Journal of Physiology. 274, E852-E859 (1998).
- Sun, Y., Deibler, G. E., Smith, C. B. Effects of axotomy on protein synthesis in the rat hypoglossal nucleus: examination of the influence of local recycling of leucine derived from protein degradation into the precursor pool. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 13, 1006-1012 (1993).
- Smith, C. B., Yu, W. H. Rates of protein synthesis in the regenerating hypoglossal nucleus: effects of testosterone treatment. Neurochemical Research. 19, 623-629 (1994).
- Orzi, F., Sun, Y., Pettigrew, K., Sokoloff, L., Smith, C. B. Effects of acute and delayed effects of prior chronic cocaine administration on regional rates of cerebral protein synthesis in rats. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 272, 892-900 (1995).
- Nadel, J., et al. Voluntary exercise regionally augments rates of cerebral protein synthesis. Brain Research. 1537, 125-131 (2013).
- Sun, Y., et al. Rates of local cerebral protein synthesis in the rat during normal postnatal development. The American Journal of Physiology. 268, R549-R561 (1995).
- Smith, C. B., Sun, Y., Sokoloff, L. Effects of aging on regional rates of cerebral protein synthesis in the Sprague-Dawley rat: examination of the influence of recycling of amino acids derived from protein degradation into the precursor pool. Neurochemistry International. 27, 407-416 (1995).
- Ingvar, M. C., Maeder, P., Sokoloff, L., Smith, C. B. The effects of aging on local rates of cerebral protein synthesis in rats. Monographs in Neural Sciences. 11, 47-50 (1984).
- Sare, R. M., Huang, T., Burlin, T., Loutaev, I., Smith, C. B. Decreased rates of cerebral protein synthesis measured in vivo in a mouse model of Tuberous Sclerosis Complex: unexpected consequences of reduced tuberin. Journal of Neurochemistry. 145, 417-425 (2018).
- Liu, Z. H., Huang, T., Smith, C. B. Lithium reverses increased rates of cerebral protein synthesis in a mouse model of fragile X syndrome. Neurobiology of Disease. 45, 1145-1152 (2012).
- Qin, M., et al. Altered cerebral protein synthesis in fragile X syndrome: studies in human subjects and knockout mice. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 33, 499-507 (2013).
- Qin, M., Kang, J., Burlin, T. V., Jiang, C., Smith, C. B. Postadolescent changes in regional cerebral protein synthesis: an in vivo study in the FMR1 null mouse. The Journal of Neuroscience: the Official Journal of the Society for Neuroscience. 25, 5087-5095 (2005).
- Qin, M., et al. R-Baclofen Reverses a Social Behavior Deficit and Elevated Protein Synthesis in a Mouse Model of Fragile X Syndrome. The International Journal of Neuropsychopharmacology. 18, pyv034 (2015).
- Qin, M., et al. Cerebral protein synthesis in a knockin mouse model of the fragile X premutation. ASN Neuro. 6, (2014).
- Smith, C. B., Kang, J. Cerebral protein synthesis in a genetic mouse model of phenylketonuria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 11014-11019 (2000).
- Reivich, M., Jehle, J., Sokoloff, L., Kety, S. S. Measurement of regional cerebral blood flow with antipyrine-14C in awake cats. Journal of Applied Physiology. 27, 296-300 (1969).
