Summary

Kvantitativ Autoradiographic metode for fastsettelse av regionale priser på cerebral protein syntese in vivo

Published: June 28, 2019
doi:

Summary

Proteinsyntese er en kritisk biologisk prosess for celler. I hjernen er det nødvendig for adaptive endringer. Måling av utbredelsen av proteinsyntese i intakt hjernen krever nøye metodisk betraktninger. Her presenterer vi L-[1-14C]-leucine kvantitative autoradiographic metode for bestemmelse av regionale utbredelsen av cerebral protein syntese in vivo.

Abstract

Proteinsyntese er nødvendig for utvikling og vedlikehold av neuronal funksjon og er involvert i adaptive endringer i nervesystemet. Videre er det antatt at feilregulering av proteinsyntese i nervesystemet kan være en kjerne fenotype i noen utviklingsmessige lidelser. Nøyaktig måling av utbredelsen av cerebral proteinsyntese i dyremodeller er viktig for å forstå disse lidelsene. Metoden som vi har utviklet var designet for å brukes til studiet av våken, oppfører dyr. Det er en kvantitativ autoradiographic metode, slik at den kan gi priser i alle regioner av hjernen samtidig. Metoden er basert på bruk av en Tracer aminosyre, L-[1-14C]-leucine, og en kinetisk modell av oppførselen til L-leucine i hjernen. Vi valgte L-[1-14C]-leucine som Tracer fordi den ikke fører til overflødig merket metabolske produkter. Det er enten innlemmet i protein eller raskt metaboliseres til å gi 14co2 som er fortynnet i en stor pool av umerkede co2 i hjernen. Metoden og modellen også tillate for bidrag av umerkede leucine avledet fra vev proteinolyse til vevet forløper for proteinsyntese. Metoden har romlig oppløsning for å bestemme proteinsyntese i celle-og neuropil lag, samt hypothalamus og skallen nerve kjerner. For å oppnå pålitelige og reproduserbar kvantitative data, er det viktig å følge prosessuelle detaljer. Her presenterer vi detaljerte prosedyrer for den kvantitative autoradiographic L-[1-14C]-leucine metode for fastsettelse av regionale utbredelsen av proteinsyntese i vivo.

Introduction

Proteinsyntese er en viktig biologisk prosess som kreves for langsiktig adaptiv endring i nervesystemet1. Hemme proteinsyntese blokker lang tids minne lagring i både virvelløse dyr og virveldyr2. Proteinsyntese er viktig for vedlikehold av de sene fasene av noen former for langsiktig potensiering (LTP) og langsiktig depresjon (LTD)3, neuronal overlevelse under utbygging4, og for generell vedlikehold av Nevron og dens Synaptic tilkoblinger5. Måling av utbredelsen av hjernen proteinsyntese kan være et viktig verktøy som å studere adaptive endringer samt neurodevelopmental lidelser og lidelser knyttet til læring og hukommelse.

Vi har utviklet en metode for å kvantifisere utbredelsen av cerebral protein syntese in vivo i en våken dyr som tilbyr iboende fordeler fremfor andre teknikker som anslår priser i ex vivo eller in vitro forberedelser av hjernevevet6. Fremst er anvendelsen til målinger i intakt hjernen i et våken dyr. Dette er en viktig faktor fordi den tillater målinger med Synaptic struktur og funksjon på plass og uten bekymringer om etter obduksjon effekter. Videre, den kvantitative autoradiographic tilnærmingen som vi ansetter oppnår en høy grad av romlig lokalisering. Mens energien på 14C er slik at vi ikke kan lokalisere Tracer på subcellulære eller cellenivå, kan vi måle priser i celle lag og små hjerneområder som hypothalamus kjerner, med omtrent en 25 μm oppløsning7.

En utfordring av in vivo målinger med radiotracers er å sikre at radiolabel målt er i produktet av reaksjonen av interesse i stedet for ureagerte merket forløper eller andre overflødige merkede metabolske produkter6. Vi valgte L-[1-14C]-leucine som Tracer amino acid fordi det er enten innlemmet i protein eller raskt metaboliseres til 14co2, som er fortynnet i det store bassenget av umerkede co2 i hjernen som følge av høy hastighet på energi metabolisme8. Videre, noen 14c ikke innlemmet i protein eksisterer først og fremst som fri [14C]-leucine, som over 60 min eksperimentelle perioden, er nesten helt ryddet fra vevet6. Proteiner blir deretter festet til vev med formalin og deretter skylles med vannet fjerne eventuelle fri [14C]-leucine før autoradiografi.

En annen viktig faktor er spørsmålet om fortynning av den spesifikke aktiviteten av forløperen aminosyre pool av umerkede aminosyrer avledet fra vev proteinolyse. Vi har vist at i voksen rotte og mus, ca 40% av forløperen leucine pool for proteinsyntese i hjernen kommer fra aminosyrer avledet fra protein sammenbrudd6. Dette må inkluderes i beregningen av regionale utbredelsen av cerebral proteinsyntese (rCPS) og må bekreftes i studier der dette forholdet kan endres. Det teoretiske grunnlaget og forutsetningene for metoden har blitt presentert i detalj andre steder6. I denne utredningen fokuserer vi på de prosessuelle spørsmålene i anvendelsen av denne metodikken.

Denne metoden har vært ansatt for fastsettelse av rCPS i bakken ekorn9, sau10, rhesus Monkeys11, rotter12,13, 14,15,16 , 17 i , 18 av år , 19 andre priser , 20 priser og , 21, en mus modell av tuberous sklerose kompleks22, en mus modell av skjøre x syndrom23,24,25,26, skjøre x premutation mus27, og en musemodell av Fenylketonuri28. I dette manuskriptet presenterer vi prosedyrene for måling av rCPS med in vivo autoradiographic L-[1-14C]-leucine metode. Vi stede rCPS i hjernen regioner av en våken kontroll musen. Vi viser også at in vivo administrasjon av anisomycin, en hemmer av oversettelsen, opphever proteinsyntese i hjernen.

Protocol

Note alle dyr prosedyrer var anerkjent av det nasjonal off av mental sunnhet dyr bekymre og bruk komité og var utført alt etter med det nasjonal Institutes av sunnhet retningslinjene opp på bekymre og bruk av dyrene. En oversikt over protokollen er presentert i figur 1. 1. kirurgisk implantat katetre i en lår blodåre og arterie for administrasjon av Tracer og samling av tidsbestemte arteriell blodprøver, henholdsvis. Komplett kirurg…

Representative Results

Her viser vi et representativt eksperiment som demonstrerer virkningene av tidligere administrering av en protein syntese inhibitor på rCPS. Anisomycin i normal saltvann ble administrert til en voksen C57/BL6 mannlig vill-type mus subkutant (100 mg/kg) 30 min før initiering av rCPS bestemmelse. Effekter av anisomycin behandling sammenlignet med en kjøretøy-behandlet kontroll dyr viser at rCPS er nesten undetectable i anisomycin-behandlet musen (Figur 4). …

Discussion

Vi presenterer en kvantitativ metode for fastsettelse av regionale utbredelsen av cerebral protein syntese (rCPS) in vivo i forsøksdyr. Denne metoden har betydelige fordeler i forhold til eksisterende metoder: 1. målingene er gjort i våken oppfører dyret, slik at de reflekterer pågående prosesser i fungerende hjernen. 2. målinger er gjort ved hjelp av kvantitative autoradiografi som gir muligheten til å bestemme rCPS i alle regioner og regioner i hjernen samtidig. 3. kinetisk modell av metoden tar hensyn til muli…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Forfatterne ønsker å erkjenne Zengyan Xia for genotyperingteknologi av mus, tom Burlin for behandling av aminosyrer og filmer, og Mei Qin for å utføre noen av de rCPS eksperimenter. Denne forskningen ble støttet av intramural Research program for NIMH, ZIA MH00889. RMS ble også støttet av en Autism snakker postdoktor Fellowship 8679 og en FRAXA postdoktor Fellowship.

Materials

Mice The Jackson Laboratory 003024 Fmr1 knockout breeding pairs
Anisomycin Tocris Bioscience 1290
Microhematocrit Tubes Drummond Scientific 1-000-3200-H capillary tubes
Critoseal Capillary Tube Sealant Leica Microsystems 39215003 sealant putty
Glass vial inserts Agilent 5183-2089 used to collect blood samples
Digi-Med Blood Pressure Analyzer Micro-Med Inc. BPA-400 blood pressure analyzer
Bayer Breeze 2 Blood Glucose Monitoring System Bayer Breeze 9570A glucose meter
Gastight syringe Hamilton Co. 1710 tuberculin glass syringe
HeatMax HotHands-2 Hand Warmers HeatMax Model HH2 warming pads
Heparin Lock Flush Solution Fresenius Kabi USA, LLC 504505 heparin saline
Clear animal container Instech MTANK/W animal enclosure
Spring tether Instech PS62 catheter tube/rodent attachment
Swivel Instech 375/25 hooks to spring tether
Swivel arm and mount Instech SMCLA hooks to swivel and animal enclosure
Tether button Instech VAB62BS/22 attaches to bottom of spring tether
Stainless steel tube Made in-house N/A used to snake catheters through mouse
Matrx VIP 3000 Matrx 91305430 isoflurane vaporizer
Isoflurane Stoelting Co. 50207 isoflurane/halothane adsorber
Clippers Oster Finisher Model 59
Surgical skin hooks Made in-house (??) N/A (??)
0.9% Sodium Chloride Saline APP Pharmaceuticals LLC 918610
Forceps Fine Science Tools 11274-20
Surgical scissors Fine Science Tools 14058-11
Microscissors Fine Science Tools 15000-00
UNIFY silk surgical sutures AD Surgical #S-S618R13 6-0 USP, non-absorbable
PE-8 polyethylene tubing SAI Infusion Technologies PE-8-25
Syringe Becton Dickinson and Co. 309659 1cc/mL
PE-10 polyethylene tubing Clay Adams 427400
MCID Analysis Imaging Research Inc. Version 7.0 optical density analysis
Gelatin-coated slides (75x25mm) FD Neurotechnologies PO101
Cryostat Leica CM1850
Super RX-N medical x-ray film Fuji 47410-19291
Hypercassettes (8×10 in) Amersham Pharmacia Biotech 11649
[1-14C]leucine Moravek MC404E
Microcentrifuge tube Sarstedt Aktiengesellschaft & Co. 72.692.005 used to deproteinize blood samples
Glass pasteur pipette Wheaton 357335
Glass wool Sigma-Aldrich 18421
Nitrogen NIH Supply Center 6830009737285
Scintillation fluid CytoScint 882453
Liquid scintilllation counter Packard Tri-Carb 2250CA
Amino acid analyzer Pickering Laboratories Pinnacle PCX
HPLC unit Agilent Technologies 1260 Infinity include 1260 Bio-Inert Pump
Surgical microscope Wild Heerbrugg M650
Sulfosalicylic acid Sigma-Aldrich MKBS1634V 5-sulfosalicylic acid dihydrate
Norleucine Sigma N8513
1.0 N HCl Sigma-Aldrich H9892
[H3]leucine Moraevk MC672
Falcon tube Thermo Scientific 339652 50 mL conical centrifuge tubes
Stopwatch Heuer Microsplit Model 1000 1/100 min
Euthanasia Solution Vet One H6438
Northern Light Precision Illuminator Imaging Research Inc. Model B95 fluorescent light box
Micro-NIKKOR 55mm f/2.8 Nikon 1442 CDD camera

References

  1. West, A. E., et al. Calcium regulation of neuronal gene expression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 11024-11031 (2001).
  2. Siegel, G., Agranoff, B., Albers, R. W., Fisher, S., Uhler, M. . Basic Neurochemistry. , (1999).
  3. Nguyen, P. V., Abel, T., Kandel, E. R. Requirement of a critical period of transcription for induction of a late phase of LTP. Science. 265, 1104-1107 (1994).
  4. Mao, Z., Bonni, A., Xia, F., Nadal-Vicens, M., Greenberg, M. E. Neuronal activity-dependent cell survival mediated by transcription factor MEF2. Science. 286, 785-790 (1999).
  5. Pfeiffer, B. E., Huber, K. M. Current advances in local protein synthesis and synaptic plasticity. The Journal of Neuroscience: the Official Journal of the Society for Neuroscience. 26, 7147-7150 (2006).
  6. Smith, C. B., Deibler, G. E., Eng, N., Schmidt, K., Sokoloff, L. Measurement of local cerebral protein synthesis in vivo: influence of recycling of amino acids derived from protein degradation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85, 9341-9345 (1988).
  7. Schmidt, K. C., Smith, C. B. Resolution, sensitivity and precision with autoradiography and small animal positron emission tomography: implications for functional brain imaging in animal research. Nuclear Medicine and Biology. 32, 719-725 (2005).
  8. Banker, G., Cotman, C. W. Characteristics of different amino acids as protein precursors in mouse brain: advantages of certain carboxyl-labeled amino acids. Archives of Biochemistry and Biophysics. 142, 565-573 (1971).
  9. Frerichs, K. U., et al. Suppression of protein synthesis in brain during hibernation involves inhibition of protein initiation and elongation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 14511-14516 (1998).
  10. Abrams, R. M., Burchfield, D. J., Sun, Y., Smith, C. B. Rates of local cerebral protein synthesis in fetal and neonatal sheep. The American Journal of Physiology. 272, R1235-R1244 (1997).
  11. Nakanishi, H., et al. Positive correlations between cerebral protein synthesis rates and deep sleep in Macaca mulatta. The European Journal of Neuroscience. 9, 271-279 (1997).
  12. Sun, Y., Deibler, G. E., Sokoloff, L., Smith, C. B. Determination of regional rates of cerebral protein synthesis adjusted for regional differences in recycling of leucine derived from protein degradation into the precursor pool in conscious adult rats. Journal of Neurochemistry. 59, 863-873 (1992).
  13. Scammell, T. E., Schwartz, W. J., Smith, C. B. No evidence for a circadian rhythm of protein synthesis in the rat suprachiasmatic nuclei. Brain Research. 494, 155-158 (1989).
  14. Smith, C. B., Eintrei, C., Kang, J., Sun, Y. Effects of thiopental anesthesia on local rates of cerebral protein synthesis in rats. The American Journal of Physiology. 274, E852-E859 (1998).
  15. Sun, Y., Deibler, G. E., Smith, C. B. Effects of axotomy on protein synthesis in the rat hypoglossal nucleus: examination of the influence of local recycling of leucine derived from protein degradation into the precursor pool. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 13, 1006-1012 (1993).
  16. Smith, C. B., Yu, W. H. Rates of protein synthesis in the regenerating hypoglossal nucleus: effects of testosterone treatment. Neurochemical Research. 19, 623-629 (1994).
  17. Orzi, F., Sun, Y., Pettigrew, K., Sokoloff, L., Smith, C. B. Effects of acute and delayed effects of prior chronic cocaine administration on regional rates of cerebral protein synthesis in rats. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 272, 892-900 (1995).
  18. Nadel, J., et al. Voluntary exercise regionally augments rates of cerebral protein synthesis. Brain Research. 1537, 125-131 (2013).
  19. Sun, Y., et al. Rates of local cerebral protein synthesis in the rat during normal postnatal development. The American Journal of Physiology. 268, R549-R561 (1995).
  20. Smith, C. B., Sun, Y., Sokoloff, L. Effects of aging on regional rates of cerebral protein synthesis in the Sprague-Dawley rat: examination of the influence of recycling of amino acids derived from protein degradation into the precursor pool. Neurochemistry International. 27, 407-416 (1995).
  21. Ingvar, M. C., Maeder, P., Sokoloff, L., Smith, C. B. The effects of aging on local rates of cerebral protein synthesis in rats. Monographs in Neural Sciences. 11, 47-50 (1984).
  22. Sare, R. M., Huang, T., Burlin, T., Loutaev, I., Smith, C. B. Decreased rates of cerebral protein synthesis measured in vivo in a mouse model of Tuberous Sclerosis Complex: unexpected consequences of reduced tuberin. Journal of Neurochemistry. 145, 417-425 (2018).
  23. Liu, Z. H., Huang, T., Smith, C. B. Lithium reverses increased rates of cerebral protein synthesis in a mouse model of fragile X syndrome. Neurobiology of Disease. 45, 1145-1152 (2012).
  24. Qin, M., et al. Altered cerebral protein synthesis in fragile X syndrome: studies in human subjects and knockout mice. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 33, 499-507 (2013).
  25. Qin, M., Kang, J., Burlin, T. V., Jiang, C., Smith, C. B. Postadolescent changes in regional cerebral protein synthesis: an in vivo study in the FMR1 null mouse. The Journal of Neuroscience: the Official Journal of the Society for Neuroscience. 25, 5087-5095 (2005).
  26. Qin, M., et al. R-Baclofen Reverses a Social Behavior Deficit and Elevated Protein Synthesis in a Mouse Model of Fragile X Syndrome. The International Journal of Neuropsychopharmacology. 18, pyv034 (2015).
  27. Qin, M., et al. Cerebral protein synthesis in a knockin mouse model of the fragile X premutation. ASN Neuro. 6, (2014).
  28. Smith, C. B., Kang, J. Cerebral protein synthesis in a genetic mouse model of phenylketonuria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 11014-11019 (2000).
  29. Reivich, M., Jehle, J., Sokoloff, L., Kety, S. S. Measurement of regional cerebral blood flow with antipyrine-14C in awake cats. Journal of Applied Physiology. 27, 296-300 (1969).

Play Video

Cite This Article
Saré, R. M., Torossian, A., Rosenheck, M., Huang, T., Beebe Smith, C. Quantitative Autoradiographic Method for Determination of Regional Rates of Cerebral Protein Synthesis In Vivo. J. Vis. Exp. (148), e58503, doi:10.3791/58503 (2019).

View Video