Summary
Hier presenteren we een protocol voor het genereren van neutrofiele extracellulaire vallen (netten) en het bedienen van NETQUANT, een volautomatische software optie voor het kwantificeren van netten in immunofluorescentie beelden.
Abstract
Neutrofiele extracellulaire vallen (netten) zijn web-achtige antimicrobiële structuren die bestaan uit DNA en korrels afgeleide antimicrobiële eiwitten. Immunofluorescentie microscopie en op afbeeldingen gebaseerde kwantificeringsmethoden blijven belangrijke instrumenten voor het kwantificeren van neutrofiele extracellulaire trap vorming. Er zijn echter belangrijke beperkingen voor de immunofluorescentie methoden die momenteel beschikbaar zijn voor het kwantificeren van netten. Handmatige methoden van op afbeeldingen gebaseerde netto kwantificering zijn vaak subjectief, gevoelig voor fouten en vervelend voor gebruikers, vooral niet-ervaren gebruikers. Ook, momenteel beschikbare software-opties voor kwantificering zijn ofwel semi-automatische of vereisen opleiding voorafgaand aan de werking. Hier tonen we de implementatie van een geautomatiseerde immunofluorescentie-gebaseerde beeldkwantificerings methode om de netto-vorming genaamd NETQUANT te evalueren. De software is eenvoudig te gebruiken en heeft een gebruiksvriendelijke grafische gebruikersinterface (GUI). Het beschouwt biologisch relevante parameters zoals een toename van het oppervlak en DNA: netto marker eiwit ratio, en nucleaire vervorming om de netto-vorming te definiëren. Bovendien is deze tool gebouwd als een vrij beschikbare app, en maakt het mogelijk om kwantificering en analyse van één cel te herleiden.
Introduction
Neutrofielen zijn cruciale mediatoren van aangeboren gastheer verdediging reacties tegen een breed scala van microbiële pathogenen1. Ze voeren hun antimicrobiële functies uit door hun korrels vrij te geven die een breed scala aan antimicrobiële eiwitten2bevatten, die reactieve zuurstof soorten (Ros) en hypochloriet1produceren, en door fagocytose3. Daarnaast heeft Brinkmann et al. 4 beschreven neutrofiele extracellulaire vallen (netten) als een nieuw mechanisme waarmee neutrofielen vangen en invallende pathogenen elimineren. Sinds hun ontdekking iets meer dan een decennium geleden4, zijn netten betrokken bij een breed scala aan infectieuze5,6 en niet-infectieuze7 morbiiteiten. De netto-vorming is een actief proces en resulteert in de extrusie van chromatine-DNA bedekt met granule afgeleide antimicrobiële eiwitten8. Enkele van de belangrijkste veranderingen in cellulaire en nucleaire morfologie geassocieerd met de netto-vorming omvatten het verlies van nucleaire morfologie, chromatine decondensatie, mobilisatie van korrel eiwitten van cytoplasma tot de Nucleus en een toename van de nucleaire en cellulaire diameter8,9.
De web-achtige netten, die kunnen verschijnen als diffuse structuren iets groter dan de cel of als structuren meerdere malen groter dan een enkele neutrofiele worden beschouwd als indicatoren van netosis5,10. Met behulp van fluorescentiemicroscopie kunnen netten worden gedetecteerd door het indringende DNA met een fluorescerende sonde zoals 4 ', 6-diamidino-2-fenylindole (DAPI) en door immunofluorescentie kleuring tegen netgebonden eiwitten zoals neutrofiele elastase. Kwantificering van overlappende gebieden van kleuring voor DNA en NETGEBONDEN eiwitten bepaalt de totale oppervlakte onder netten in een afbeelding11.
Er zijn een aantal opties voorbeeld analyse beschikbaar voor het uitvoeren van fluorescentie op afbeeldingen gebaseerde kwantificering van netten11,12. Maar deze software opties aanwezig beperkingen in niet gebruiksvriendelijk en/of volledig geautomatiseerd. In dit artikel demonstreren we de werking van NETQUANT13, een vrij beschikbare app die onbevooroordeelde volledig geautomatiseerde immunofluorescentie microscopie beeld gebaseerde netto kwantificering kan uitvoeren. De app heeft een gebruiksvriendelijke grafische interface (GUI) en kan single-cell analyse uitvoeren. De software kwantificeert NETosis in een afbeelding door het detecteren van de morfologische veranderingen in het gebied van DNA-NET-gebonden marker, chromatine decondensatie geassocieerde vervorming van de Nucleus en toename van het DNA: netto-gebonden eiwit ratio. De meervoudige nettodefinitiecriteria maken het mogelijk om op onbevooroordeelde wijze een strikte netto-kwantificering over verschillende gegevensverzamelingen toe te voegen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De ethische commissie van de Universiteit van Lund keurde de verzameling van veneuze bloed van gezonde vrijwilligers goed in overeenstemming met de verklaring van Helsinki (2013/728). Alle vrijwilligers hebben hun schriftelijke geïnformeerde toestemming gegeven.
1. isolatie van perifere bloed neutrofielen met behulp van dichtheid-gradiënt centrifugeren
- Verzamel humaan veneuze bloed in buisjes die heparine bevatten en laat de buisjes op kamertemperatuur komen.
Opmerking: een minimum van 16 mL bloed van een gezonde donor is nodig om een voldoende grote celpellet te kunnen opleveren. - Meng het bloed met een volume van 2% dextran in zoutoplossing (0,9% NaCl) en laat 30 minuten bij kamertemperatuur sediment in een steriele conische centrifugebuis van 50 mL.
- Zuig de supernatant op in een steriele 50 mL conische centrifugebuis en centrifugeer bij 200 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C.
- Vanaf deze stap gaat u door met isoleren op 4 °C of op ijs.
- Regeer de pellet in 5 mL ijskoude zoutoplossing en laag bovenop 5 mL van de isolatie gradiënt van leukocyten (9,1% natriumdiatrizoaat met 5,7% dextran, w/v) in een steriele 15 mL conische centrifugebuis.
- Centrifugeer 30 minuten bij 400 x g bij 4 °C.
- Aspireren het supernatant en gooi het weg.
- Lyse rode bloedcellen door het resuspenseren van de pellet in 3 mL ijskoud water voor 30 s. Voeg onmiddellijk 1 mL 3,6% NaCl toe en vul vervolgens met 10 mL ijskoude zoutoplossing.
- Centrifugeer de celsuspensie gedurende 10 minuten bij 350 x g.
- Verwijder het supernatant, verzamel de celpellet en rebreng het in 1 mL zoutoplossing. Zet 10 μL in een micro centrifugebuis om het aantal cellen en de levensvatbaarheid te beoordelen met trypan Blue in een Bürker-kamer.
- Voeg 10 μL celsuspensie toe aan 90 μL 0,4% trypeen blauwe oplossing. Neem 10 μL celsuspensie in een Bürker-kamer. Tel de cellen in de 4 vierkantjes gebonden door 3 lijnen op elke hoek van de kamer. Cellen die donkerblauw lijken op de opname van kleurstof, zijn niet levensvatbaar, sluiten ze uit van het totale celnummer.
- Het celgetal uitdrukken als cellen/mL zoals gedefinieerd door de onderstaande vergelijking.
Opmerking: hier was kamer factor 10.000, verdunningsfactor was 10 en het totale aantal vierkantjes was 4. - Verdun de resterende celsuspensie tot 10 mL voor een laatste wasstap.
- Centrifugeer 5 min bij 200 x g.
- Respendeer de neutrofielen in RPMI-1640 met 2 mg/mL warmtegeïnactiveerd humaan serumalbumine (HSA) met een concentratie van 5 x 105 cellen/ml.
2. bereiding van de Dekstroken en stimulatie van neutrofielen
- Plaats één dekslip (10 mm, #1) in elke put van een 12-well plaat en mantel de dekslip door toevoeging van 200 μL 0,01% poly-L-lysine oplossing en laat het bij 37 °C 's nachts.
- Was de dekstroken met 300 μL fosfaatbuffer Saline (PBS) eenmaal en laat drogen.
- Voeg 400 μL van 5 x 105 neutrofielen/ml toe aan elk goed en incuberen bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten.
- Verplaats de plaat met neutrofielen naar een incubator bij 37 °C met 5% CO2 gedurende 15 min.
- Verwijder het supernatant. Voeg 400 μL voorverwarmde RPMI-1640 medium met 2 mg/mL HSA toe aan de bedieningsorganen. Voeg 300 μL vooraf opgewarmde rpmi toe met 20 nm forbol 12-Myristate 13-acetaat (PMA) voor stimulatie.
- Stimuleren van neutrofielen voor 150 min bij 37 °C met 5% CO2.
3. visualisatie van netten
- Verwijder de supernatant en was de monsters 2x met 200 μL PBS.
- Fix samples door toevoeging van 200 μL van 4% Paraformaldehyde (PFA) in PBS gedurende 20 min bij 37 °C.
Opmerking: PFA is giftig en moet voorzichtig worden behandeld. - Was samples 3x met 200 μL PBS.
- Permeabilize de monsters door toevoeging van 50 μL 0,5% Triton X-100 voor 30 s.
- Was de monsters 3x met 200 μL PBS.
- Blokkeer de monsters met 5% geit serum in PBS voor 1 uur bij 37 °C.
- Voeg 300 μL primair konijn-anti-humaan neutrofiele elastase toe in blokkerende oplossing bij een verdunning van 1:500 voor 90 min bij 37 °C.
- Was de monsters 3x met 300 μL PBS.
- Voeg 300 μL secundaire geit anti-konijn fluorescerende stof toe bij een verdunning van 1:1000 voor 90 min bij 37 °C.
- Was de afdek stroken 3x met 300 μL PBS.
- Verwijder de afdek stroken uit de putjes en monteer de Afdeklijst met 10 μL montage medium met DAPI. Bewaar 's nachts bij kamertemperatuur in het donker om de monsters te drogen.
Opmerking: de kleuring van DNA met DAPI is zeker een kritieke stap in de methode. De gebruikers kunnen ook problemen oplossen door exogene DAPI-oplossing toe te voegen in een eindconcentratie bereik van 0,1 \ u 20120.5 μg/mL voor 2 \ u20123 min, gevolgd door 3 wasstappen met 300 μL PBS. - Verkrijg afbeeldingen met een breedveld fluorescentiemicroscoop met een 20X-doelstelling.
4. analyse en kwantificering van netten met NETQUANT
Opmerking: NETQUANT kan worden gedownload door te klikken op het installatiebestand gevonden op het Zenodo github archief of de Nordenfelt Lab website (https://nordlab.med.lu.se/?page_id=34).
- Importeren van gegevenssets voor analyse, naamgeving van kanalen en conversie van afbeeldingen
- Open het tabblad instellen in NETQUANT.
- Kies de bronmap voor analyse door te klikken op de optie pad ophalen in het menu Bron en selecteer de map met de reeksen afbeeldingen die moeten worden geanalyseerd.
- Klik op de optie pad ophalen in het menu doel en selecteer de map voor het opslaan van de gegevens na de analyse van de afbeelding.
- Noem de kanalen zodat "DNA-kanaal" overeenkomt met de DNA-kleuring (bijvoorbeeldDNA of DAPI) en "net-Channel" toont de net-gebonden eiwit kleuring (bijv. netto, neutrofiele elastase) in de beelden. Voor de soepele werking van de software, (aanbevolen) noem de map met de beeldbestanden van de besturing als "controle".
Opmerking: het NET-kanaal verwijst alleen naar de NET-gebonden korrel proteïne marker kleuring. - Voer de metagegevens van de afbeelding in de software door te klikken op de knop afbeeldingsgegevens laden in het submenu afbeeldingsinformatie .
- Selecteer de juiste kanaal volgorde die is opgenomen in de afbeeldingen in het submenu kanaal volgorde . Deze optie is opgenomen als een fail-safe om onbedoelde mismatches te voorkomen.
- Primaire afbeeldingseigenschappen ophalen uit de onbewerkte gegevens en de afbeeldingen converteren door op de knop gegevens voorbereidente klikken. De geconverteerde afbeeldingen worden weergegeven in het submenu sample type . Klik op het menu voorbeeld type voor het weergeven en selecteren van alle gegevenssets die zijn aangeschaft voor analyse.
- Selecteer een afbeelding in het submenu van het voorbeeld type en klik op de knop beeld gegevens weergeven om de beelden in respectievelijk het DNA en het net kanaal te splitsen.
- Segmentatie van cellen in het DNA kanaal en het netto kanaal
- Selecteer de segmentatie methode door op het submenu methode in zowel het DNA-kanaal als het net-kanaal te klikken.
Opmerking: de standaard segmentatie methode is ingesteld op adaptief en is de aanbevolen instelling. Andere opties zijn ook beschikbaar, waaronder Global, Edge en Chan-Vese. Een waterloods optie is ook inbegrepen om onderscheid te kunnen maken tussen nauw geplaatste cellen of netten. - Voer het tabblad segmentatie in om eerst de controle cellen in beide kanalen te segmenteren door op de optie voor beelden van segment controle te klikken.
- Selecteer PMA in het submenu sample type en klik op de batch optie (aanbevolen) om te beginnen met segmenteren van alle afbeeldingen die in de gegevensset zijn opgenomen. Selecteer de afbeeldingen in het voorbeeld type menu en klik op de knop afbeeldingsgegevens weergeven om de binaire afbeeldings MASKERS (DNA-masker en netmasker) die na segmentatie zijn gegenereerd, te visualiseren en te valideren.
- Selecteer de segmentatie methode door op het submenu methode in zowel het DNA-kanaal als het net-kanaal te klikken.
- Analyse van identificeerbare eigenschappen met één cel
- Voer het tabblad analyse in en analyseer de controle voorbeelden door te klikken op de knop drempel bepalen .
- Verander het sample type naar PMA en klik op de knop Celeigenschappen ophalen om de analyse van gestimuleerde monsters te voltooien.
- Selecteer een afbeelding in het submenu voorbeeld type en klik op de knop afbeeldingsgegevens weergeven om de overlay en het aantal cellen en de netto vormende cellen in de afbeelding weer te geven.
- Vergelijking van Celeigenschappen om NET vormende cellen te identificeren
- Selecteer sample in het submenu sample type en klik op de knop netten analyseren om de analyse te voltooien. Afzonderlijke afbeeldingen kunnen worden geselecteerd in het submenu voorbeeld type voor analyse of de hele batch afbeeldingen kan worden geanalyseerd door de optie Batch te selecteren (aanbevolen).
- Pas de NETTOCRITERIA handmatig aan om optimale resultaten voor een bepaald monster te geven. Vergelijk de geïdentificeerde netten met de originele afbeeldingen om de kwaliteit van de identificatie te beoordelen.
Opmerking: de netto-criteria kunnen vervolgens worden gebruikt voor alle afbeeldingen in de gegevensset. Alle wijzigingen in de netto-criteria worden gelijktijdig toegepast op alle controlemonsters. Dit beperkt de mogelijkheid van mogelijke verschillen die zich kunnen voordoen als gevolg van overfitting van de netto-parameters. De instellingen in de netto-criteria kunnen worden aangepast aan de vereisten van de gebruiker. De relatie tussen valse Discovery rates en NETQUANT is eerder onderzocht13. Typische bereiken voor gebieds verhoging zijn 2 \ u20124, circulariteit 0,7 \ u 20120.9 en de verhouding DNA/netto te zijn 0.6 – 2.0. - Inspecteer het gegevensoverzicht in het submenu celgegevens , waar het aantal afbeeldingen, de aantallen per afbeelding en het percentage netten per afbeelding worden weergegeven.
Opmerking: het totale percentage van de netten in de gehele gegevensset wordt weergegeven door de "NET-gauge". Het totale aantal afbeeldingen, het aantal cellen, het percentage netten in het monster (netten%) en netten% in het controlemonster worden weergegeven in de tabel met overzichtsstatistieken onder de NET-gauge. Wij raden aan dat de controlegegevens worden gerapporteerd naast de gegevens die zijn verkregen uit gestimuleerde monsters.
- Resultaat uitgangen
- Voer het tabblad uitvoer in om resultaat uitvoer te selecteren en weer te geven.
- Verken en vergelijk de verschillende gegevens uitgangen die zijn gegenereerd op basis van de analyse van Control en PMA door de vorm van de uitvoer te selecteren en op de knop uitvoer resultaten te klikken.
Opmerking: alle gegevens die na de analyse worden gegenereerd voor zowel besturingselementen als stimulaties, worden opgeslagen in de map analyse zoals gekozen in het submenu target. Gegevens worden opgeslagen in CSV-of PDF-indeling. - Start het methode bestand om de versie van de software en de nettocriteria te verkrijgen die worden gebruikt voor de analyse (om te worden opgenomen in de sectie methoden voor publicatiedoeleinden).
- Klik op de tabel met resultaten gegevens om de afzonderlijke gegevenspunten in een bepaald voorbeeld te visualiseren.
- Visualiseer de netto-gebieds verdeling en DNA: nettoverhouding in de monsters. De rode lijn geeft de drempelwaarde in de grafieken aan.
- Bepaal de netto-oppervlakte versus de vorm van het DNA door op het bivariate distributie bestand te klikken.
- Vorige analyse laden en alle stappen batchgewijs uitvoeren
- Laad eerder succesvolle analyse-instellingen in NETQUANT met de knop vorige analyse laden .
- Gebruik de knop batch alle stappen in het Setup -menu om stap 5 \ u201212 (afbeelding 1, Figuur 2, Figuur 3, Figuur 4, figuur 5) rechtstreeks uit te voeren om de uiteindelijke uitvoer te verkrijgen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
5 x 105 neutrofielen/ml werden in een 12-well plaat geplaatst op de dekstroken en gestimuleerd met 20 nm PMA of ongeprikkeld gelaten voor 150 min. De monsters werden vervolgens bevlekt met behulp van primaire konijn anti-menselijke neutrofiele elastase antilichamen, secundaire geit anti-konijn de geconjugeerde antilichamen en DAPI-een fluorescently gelabelde kleurstof die DNA vlekken (Zie de tabel met materialen voor details). Een minimum van 5 beelden werd vervolgens verworven met behulp van een epifluorescentie Microscoop en een 20X (NA = 0,75) doel. Voorbeeldgegevens die worden gebruikt voor de test analyse in het manuscript kunnen worden gedownload door de link https://nordlab.med.lu.se/?page_id=34 te volgen en op het pictogram voor de voorbeeld dataset te klikken.
Hier beschrijven we het vermogen van de workflow van NETQUANT (Figuur 1) om de netto-vorming in een bepaald monster te kwantificeren. De software tool kan worden geïnstalleerd als een app in MATLAB en kan worden gebruikt zonder enige voorafgaande kennis van deze interface. De GUI van NETQUANT werd gebruikt om de datasets te analyseren zoals hierboven beschreven. Alle afbeeldingen die worden gebruikt voor analyse door NETQUANT worden altijd ongewijzigd gelaten in de bovenliggende map. De GUI is verdeeld in 4 tabs-Setup tab, segmentatie tab, analyse tabblad en resultaten output tab. De monsters werden voorbereid voor analyse op het tabblad Setup (afbeelding 2). De bestandspaden (1), naamgevingsconventies (2), afbeeldingsgegevens (3) en kanaal orders (4) worden door de gebruiker gedefinieerd. De optie gegevens voorbereiden (5) zorgt ervoor dat de conversie en organisatie op een gestandaardiseerde wijze tijdens het experiment. De segmenterings parameters waren de set in het tabblad segmentatie (Figuur 3) om individuele cellen in de monsters te identificeren (6). De controlemonsters worden altijd eerst (7) gesegmenteerd vóór de segmentatie van de gestimuleerde monsters (8). Alle aanbevolen waarden voor segmentatie worden aangegeven op het tabblad software. De eigenschappen die niet-gestimuleerde controle cellen definiëren, worden eerst verworven (9) en vervolgens vergeleken met PMA-gestimuleerde cellen (10) (Figuur 4). Netten worden vervolgens in de monsters geanalyseerd op basis van de netto-criteria (11) en weergegeven met het totale aantal beeld tellingen, het aantal cellen en de bijbehorende netten% in de controlemonsters. De uiteindelijke gegevens uitgangen van de analyse werden geselecteerd en vervolgens gevisualiseerd (Figuur 5). Een optie voor het laden en gebruiken van een eerder succesvolle analyse en een batch-all optie voor het verwerken van groepen van stappen 5-12 (afbeelding 1, Figuur 2, Figuur 3, Figuur 4, figuur 5) zijn ook opgenomen in het tabblad instellen.
Tijdens de analyse werden in totaal 2619 cellen geanalyseerd in het experiment. De PMA-gestimuleerde neutrofielen konden 90,59% netten genereren (netten%) in tegenstelling tot 25,87 netten% in de controlemonsters (Figuur 6). De beeldanalyse werd binnen 10 minuten na het initiëren van de workflow op de software voltooid. Samenvattend biedt NETQUANT een snelle en gemakkelijke optie om de netto-vorming te kwantificeren in afbeeldingen die zijn verkregen met behulp van immunofluorescentie microscopie.
Figuur 1: overzicht van de NETQUANT-workflow. Fluorescerende micro grafieken van menselijke neutrofielen dubbel gekleurd met anti-elastase en DAPI (DNA) worden eerst verwerkt en omgezet. De beelden worden vervolgens gesegmenteerd, gevolgd door analyse van Celeigenschappen, detectie van netten en resultaat uitgangen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Afbeelding 2: opties tabblad instellen in NETQUANT. Bestandspaden voor de te analyseren gegevenssets en mappen voor gegevensuitvoer worden eerst ingevoerd op het tabblad instellen (1). De naamgevingsconventies worden vervolgens ingevuld om kanaalnamen en de naam van de besturingselement map (2) te definiëren. De afbeeldingsgegevens worden vervolgens overgenomen (3), gevolgd door de juiste kanaal volgorde (4) te benoemen. De juiste instelling van alle velden wordt aanbevolen vóór de verwerking van de gegevenssets (5) voor gestandaardiseerde beeldconversie. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: parameters van het tabblad segmentatie in NETQUANT. De parameters die worden gebruikt voor de segmentatie van zowel DNA-kanaal als NET-eiwit marker omvatten methode, gevoeligheid, iteraties, minimum gebied en waterscheiding (6). Het gebruik van een adaptieve segmentatie methode en waterscheiding wordt aanbevolen. Ook andere instellingen die als voorinstellingen in de software worden geleverd, kunnen voor de meeste doeleinden zonder wijzigingen worden gebruikt. De controlemonsters worden eerst gesegmenteerd (7) en vervolgens worden de gestimuleerde monsters gesegmenteerd (8). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: detectie van netten op het tabblad analyse. De celeigenschappen die niet-gestimuleerde cellen definiëren, worden geanalyseerd en verkregen uit controlemonsters (9). Dit wordt gevolgd door de analyse van Celeigenschappen in de experimentele monsters (10). De criteria voor de nettodefinitie (vouw toename in cellulair gebied, nucleaire vervorming (waarden 0 tot 1) en het DNA-kleurings gebied/NET-marker kleurings gebied) worden toegepast op zowel controle-als gestimuleerde monsters om de netto-vorming te definiëren (11). Het aantal netten, het totale aantal cellen en de hoeveelheid afbeeldingen in beide voorbeelden wordt weergegeven in de sectie samenvattings statistieken. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Afbeelding 5: visualisatie van resultaat uitvoerbestanden in NETQUANT. De resultaten die na de analyse worden verkregen, kunnen door de individuele gebruiker worden geselecteerd. De resultaat uitgangen die kunnen worden gegenereerd met NETQUANT bevat een CSV-bestand met gegevenspunten uit afzonderlijke cellen. Ook worden histogrammen van de verdeling van cellen die een toename in netto (cellulair) gebied ondergaan, vervorming van de Nucleus als gevolg van chromatide decondensatie en DNA: netto-marker ratio, en een 3D-grafiek van netto gebied versus nucleaire vervorming ook gegenereerd in de analyse. Alle uitgangen worden automatisch opgeslagen in de map Analysis die is gekozen op het tabblad instellen als. CSV,. PDF en. txt bestanden. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 6: analyse van de netto-vorming. A) de netten%, het totale aantal cellen en de hoeveelheid afbeeldingen uit de test gegevensset zoals die in de samenvattende statistieken voor controles en door PMA gestimuleerd (20 nm) neutrofielen is waargenomen. B) een vergelijking naast elkaar van histogrammen met een toename van het gebied, nucleaire vervorming (waarden 0 tot 1) en de DNA/netto-ratio in controle-en PMA-gestimuleerde monsters. De rode lijn in de histogrammen drempelwaarden voor de criteria voor de NETTODEFINITIE. C) vergelijking van de 3D-grafiek van de netto-oppervlakte versus de nucleaire vervorming die wordt gegenereerd door de NETQUANT-analyse van controle-en PMA-gestimuleerde monsters. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
NET Formation is een relatief recente toevoeging aan het gevarieerde neutrofiele armamentarium4 en er is een opvallende Golf van belang om de implicatie van netten te bestuderen in een breed scala aan onderzoeksgebieden5,7,14,15. Het verwerven van beelden met behulp van immunofluorescentie microscopie en daaropvolgende kwantificering op basis van afbeeldingen is een veelgebruikte methode om netten te kwantificeren. Deze aanpak heeft als voordeel dat cellen die netten vormen op één celniveau kunnen worden opgespoord en daardoor het achtergrond signaal beter kan verminderen. Handmatige kwantificeringsmethoden kunnen uitputtend, traag en onderhevig aan gebruikers bias zijn. Een paar semi-automatische opties bestaan die gebruikers hebben voorzien van betrouwbare analyse11,12. Ze kunnen echter aanzienlijke technische vaardigheid vereisen voor gebruik of vereisen verschillende handmatige stappen voor kwantificering. Dit is een uitdaging vooral voor eerder niet-ervaren gebruikers. In een recente publicatie is een volautomatische rekenmethode gebruikt om de netto-formatie te kwantificeren met behulp van flow cytometrie-gebaseerde beeldvorming en dunne weefsel secties. Het kan echter alleen worden toegepast op specifieke scenario's en vereist ook een aanzienlijke kennis van programmering voor operatie16. Momenteel is volledig geautomatiseerde beeldkwantificerings software die is gewijd aan algemene netto-kwantificering die eenvoudig te gebruiken is en beschikt over een enkele-cel resolutie capaciteit niet beschikbaar voor onderzoekers.
Hier presenteren we NETQUANT, een volledig geautomatiseerde netto kwantificerings software die vrij beschikbaar is. Deze software is speciaal ontwikkeld om de netto-vorming te kwantificeren met een hoge stringentie met behulp van immunofluorescentie microscopie beelden, en met de mogelijkheid om één cel analyse en kwantificering uit te voeren. Afgezien van de toename van het gebied van vlekken onder netten, houdt NETQUANT ook rekening met nucleaire vervorming als gevolg van chromatische decondensatie en een toename van het DNA/NET-marker eiwit co-lokalisatie om de netto-vorming in een bepaald monster te definiëren. Dit maakt het mogelijk om cellen te onderscheiden die alleen nucleaire decondensatie hebben ondergaan van cellen die een volledige netto-vorming hebben ondergaan. De in het NETQUANT-algoritme opgenomen NETTODEFINITIECRITERIA maken een hogere striktheid in kwantificering mogelijk in vergelijking met veel eerdere kwantificerings benaderingen die uitsluitend afhankelijk zijn van een toename van het gebied van de netkleuring.
De GUI is bedoeld om gebruiksvriendelijk en eenvoudig te gebruiken. Elke stap van de analyse is genummerd om ervoor te zorgen dat gebruikers de werkstroom kunnen volgen. Een van de belangrijkste functies in de software is de segmentatie tool/tabblad die NETQUANT toelaat om eencellige analyses uit te voeren in afbeeldingen, wat de hoogst mogelijke gevoeligheid is die kan worden bereikt. Dit maakt NETQUANT een van de weinige beschikbare opties die een kwantificering van één cel kan uitvoeren om de netto-vorming te kwantificeren. Daarnaast hebben Mohanty et al. aangetoond dat de software zich ook kan aanpassen aan beeld variaties en acquisitie parameters13. Vanwege de flexibiliteit die wordt geboden in de segmentatie-en NETDEFINITIECRITERIA kunnen donor-en plaat variaties worden ondergebracht. NETQUANT kan grote datasets adequaat verwerken en kan worden gebruikt voor betrouwbare beeldanalyse met hoge doorvoer13.
Hoewel we de werkstroom hebben gevonden om robuuste resultaten van meerdere donoren te leveren, raden we aan dat de gebruiker de juiste waarden bepaalt op basis van de afzonderlijke voorbeelden. In theorie kan de gegenereerde gegevens na analyse ook worden beïnvloed door een hoge celdichtheid. Bovendien kan een buitensporige aggregatie van netten resulteren in de vermindering van het aantal geconstateerde netten. Dit komt omdat het segmentatie algoritme geen verstrengelde netten kan onderscheiden in afzonderlijke gebeurtenissen. Een soortgelijk probleem met segmentatie kan ook ontstaan wanneer ongestimuleerde neutrofielen worden gevangen in de netten. Het gebruik van beelden verkregen bij 20X en 40X wordt momenteel aanbevolen omdat de prestaties van NETQUANT niet zijn getest op andere vergrotingsniveaus. Zolang de pixelgrootte juist is ingesteld (handmatig of vanuit metagegevens in het gedeelte afbeelding info laden), moet de software de gebieds berekeningen nauwkeurig aanpassen aan hogere of lagere vergroingen. De juiste kleuring van het DNA en de submodule marker is een kritische factor. Slechte kleuring of slechte beeldkwaliteit in beide kanalen zal resulteren in suboptimale resultaten. Daarom wordt aanbevolen dat de gebruiker een geschikt celnummer, kleurings procedure en antilichaamtiter moet bepalen om optimale resultaten te kunnen opleveren.
NETQUANT is alleen getest op netten die in vitro zijn afgeleid van menselijke neutrofielen. Netten van andere soorten kunnen ook gekwantificeerd worden met correcte correcties in de criteria. De netto kwantificering kan worden uitgevoerd op vaste monsters in kamer glaasjes of multi-well glazen bodemplaten. Hoge kwaliteit beelden van monsters gekleurd voor DNA en korrel eiwit markers zijn van cruciaal belang. NETQUANT kan ook worden aangepast om andere vormen van extracellulaire vallen (ET)-ose te kwantificeren, bijvoorbeeld, zoals tentoongesteld door eosinofielen. Kwantificeren van ETs in niet-granulocyten zoals monocyten is momenteel niet mogelijk als cytoplasmatische korrel kleuring gebied is vereist voor de segmentatie-algoritme.
Kortom, NETQUANT is een eenvoudig, automatisch en snel hulpmiddel voor het nauwkeurig identificeren van de netto-vorming die een analyse en kwantificering van één cel mogelijk maakt. Wij geloven dat deze software de barrière voor het uitvoeren van automatische netto kwantificering kan verlagen en dat de onderzoeksgemeenschap zal profiteren van deze gratis beschikbare app.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
TM en PN hebben een patent in behandeling met betrekking tot de algoritmen die worden gebruikt in NETQUANT.
Acknowledgments
Het werk werd gefinancierd door de Crafoord Foundation (TM en PN), de Zweedse overheids onderzoeksbeurs (PN, TM), de Zweedse Onderzoeksraad (PN) en de Groschinsky Foundation (TM, PN).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Vacutainer Heparinised plastic tubes | BD Biosciences | 367885 | |
| Lymphoprep | Axis-Shield | 114547 | |
| RPMI-1640 with L-Glutamine | Gibco | 11835-030 | |
| 50mL conical flasks | Sarstedt | 62.547.004 | |
| 15mL conical flasks | Sarstedt | 62.554.002 | |
| 12-well Tissue culture plates | Falcon | 10626491 | |
| #1 Coverslips 10mm | Menzel Glaser | CS10100 | |
| Glass slides | Menzel Glaser | 631-0098 | |
| Primary anti-human elastase | DAKO | DAKO rabbit 1373, contract immunization | |
| Secondary fluorophore conjugated goat anti-rabbit | Life technologies | A-11072, A-11070 | |
| PROLONG-Gold Antifade reagent with DAPI | Life technologies | P36930 | Mounting medium |
| Goat serum | Sigma-Aldrich | G9023 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | 79346 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Nikon Ti-E Epifluorescence microscope | Nikon | ||
| CCD camera | Andor Zyla | ||
| Plan Apochromat 20x, 40x objectives | Nikon | ||
| Windows 10 | Microsoft | Operating system | |
| macOS Sierra 10.12 | Apple | Operating system | |
| MATLAB | Mathworks |
References
- Nauseef, W. M., Borregaard, N. Neutrophils at work. Nature Immunology. 15 (7), 602-611 (2014).
- Borregaard, N., Cowland, J. B. Granules of the human neutrophilic polymorphonuclear leukocyte. Blood. 89 (10), 3503-3521 (1997).
- Nordenfelt, P., Tapper, H. Phagosome dynamics during phagocytosis by neutrophils. Journal of Leukocyte Biology. 90 (2), 271-284 (2011).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Sorensen, O. E., Borregaard, N. Neutrophil extracellular traps - the dark side of neutrophils. Journal of Clinical Investigation. 126 (5), 1612-1620 (2016).
- Yipp, B. G., Kubes, P. NETosis: how vital is it? Blood. 122 (16), 2784-2794 (2013).
- Jorch, S. K., Kubes, P. An emerging role for neutrophil extracellular traps in noninfectious disease. Nature Medicine. 23 (3), 279-287 (2017).
- Fuchs, T. A., et al. Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps. J Cell Biol. 176 (2), 231-241 (2007).
- Mohanty, T., et al. A novel mechanism for NETosis provides antimicrobial defense at the oral mucosa. Blood. 126 (18), 2128-2137 (2015).
- Hakkim, A., et al. Activation of the Raf-MEK-ERK pathway is required for neutrophil extracellular trap formation. Nature Chemical Biology. 7 (2), 75-77 (2011).
- Brinkmann, V., Goosmann, C., Kuhn, L. I., Zychlinsky, A. Automatic quantification of in vitro NET formation. Frontiers in Immunology. 3, 413 (2012).
- Coelho, L. P., et al. Automatic determination of NET (neutrophil extracellular traps) coverage in fluorescent microscopy images. Bioinformatics. 31 (14), 2364-2370 (2015).
- Mohanty, T., Sorensen, O. E., Nordenfelt, P. NETQUANT: Automated Quantification of Neutrophil Extracellular Traps. Frontiers in Immunology. 8, 1999 (2017).
- Kaplan, M. J., Radic, M. Neutrophil extracellular traps: double-edged swords of innate immunity. Journal of Immunology. 189 (6), 2689-2695 (2012).
- Cedervall, J., Olsson, A. K. Immunity Gone Astray - NETs in Cancer. Trends in Cancer. 2 (11), 633-634 (2016).
- Ginley, B. G., et al. Computational detection and quantification of human and mouse neutrophil extracellular traps in flow cytometry and confocal microscopy. Scientific Reports. 7 (1), 17755 (2017).
