Summary

Geautomatiseerde kwantificering van neutrofiele extracellulaire traps met behulp van NETQUANT

Published: November 27, 2019
doi:

Summary

Hier presenteren we een protocol voor het genereren van neutrofiele extracellulaire vallen (netten) en het bedienen van NETQUANT, een volautomatische software optie voor het kwantificeren van netten in immunofluorescentie beelden.

Abstract

Neutrofiele extracellulaire vallen (netten) zijn web-achtige antimicrobiële structuren die bestaan uit DNA en korrels afgeleide antimicrobiële eiwitten. Immunofluorescentie microscopie en op afbeeldingen gebaseerde kwantificeringsmethoden blijven belangrijke instrumenten voor het kwantificeren van neutrofiele extracellulaire trap vorming. Er zijn echter belangrijke beperkingen voor de immunofluorescentie methoden die momenteel beschikbaar zijn voor het kwantificeren van netten. Handmatige methoden van op afbeeldingen gebaseerde netto kwantificering zijn vaak subjectief, gevoelig voor fouten en vervelend voor gebruikers, vooral niet-ervaren gebruikers. Ook, momenteel beschikbare software-opties voor kwantificering zijn ofwel semi-automatische of vereisen opleiding voorafgaand aan de werking. Hier tonen we de implementatie van een geautomatiseerde immunofluorescentie-gebaseerde beeldkwantificerings methode om de netto-vorming genaamd NETQUANT te evalueren. De software is eenvoudig te gebruiken en heeft een gebruiksvriendelijke grafische gebruikersinterface (GUI). Het beschouwt biologisch relevante parameters zoals een toename van het oppervlak en DNA: netto marker eiwit ratio, en nucleaire vervorming om de netto-vorming te definiëren. Bovendien is deze tool gebouwd als een vrij beschikbare app, en maakt het mogelijk om kwantificering en analyse van één cel te herleiden.

Introduction

Neutrofielen zijn cruciale mediatoren van aangeboren gastheer verdediging reacties tegen een breed scala van microbiële pathogenen1. Ze voeren hun antimicrobiële functies uit door hun korrels vrij te geven die een breed scala aan antimicrobiële eiwitten2bevatten, die reactieve zuurstof soorten (Ros) en hypochloriet1produceren, en door fagocytose3. Daarnaast heeft Brinkmann et al. 4 beschreven neutrofiele extracellulaire vallen (netten) als een nieuw mechanisme waarmee neutrofielen vangen en invallende pathogenen elimineren. Sinds hun ontdekking iets meer dan een decennium geleden4, zijn netten betrokken bij een breed scala aan infectieuze5,6 en niet-infectieuze7 morbiiteiten. De netto-vorming is een actief proces en resulteert in de extrusie van chromatine-DNA bedekt met granule afgeleide antimicrobiële eiwitten8. Enkele van de belangrijkste veranderingen in cellulaire en nucleaire morfologie geassocieerd met de netto-vorming omvatten het verlies van nucleaire morfologie, chromatine decondensatie, mobilisatie van korrel eiwitten van cytoplasma tot de Nucleus en een toename van de nucleaire en cellulaire diameter8,9.

De web-achtige netten, die kunnen verschijnen als diffuse structuren iets groter dan de cel of als structuren meerdere malen groter dan een enkele neutrofiele worden beschouwd als indicatoren van netosis5,10. Met behulp van fluorescentiemicroscopie kunnen netten worden gedetecteerd door het indringende DNA met een fluorescerende sonde zoals 4 ‘, 6-diamidino-2-fenylindole (DAPI) en door immunofluorescentie kleuring tegen netgebonden eiwitten zoals neutrofiele elastase. Kwantificering van overlappende gebieden van kleuring voor DNA en NETGEBONDEN eiwitten bepaalt de totale oppervlakte onder netten in een afbeelding11.

Er zijn een aantal opties voorbeeld analyse beschikbaar voor het uitvoeren van fluorescentie op afbeeldingen gebaseerde kwantificering van netten11,12. Maar deze software opties aanwezig beperkingen in niet gebruiksvriendelijk en/of volledig geautomatiseerd. In dit artikel demonstreren we de werking van NETQUANT13, een vrij beschikbare app die onbevooroordeelde volledig geautomatiseerde immunofluorescentie microscopie beeld gebaseerde netto kwantificering kan uitvoeren. De app heeft een gebruiksvriendelijke grafische interface (GUI) en kan single-cell analyse uitvoeren. De software kwantificeert NETosis in een afbeelding door het detecteren van de morfologische veranderingen in het gebied van DNA-NET-gebonden marker, chromatine decondensatie geassocieerde vervorming van de Nucleus en toename van het DNA: netto-gebonden eiwit ratio. De meervoudige nettodefinitiecriteria maken het mogelijk om op onbevooroordeelde wijze een strikte netto-kwantificering over verschillende gegevensverzamelingen toe te voegen.

Protocol

De ethische commissie van de Universiteit van Lund keurde de verzameling van veneuze bloed van gezonde vrijwilligers goed in overeenstemming met de verklaring van Helsinki (2013/728). Alle vrijwilligers hebben hun schriftelijke geïnformeerde toestemming gegeven. 1. isolatie van perifere bloed neutrofielen met behulp van dichtheid-gradiënt centrifugeren Verzamel humaan veneuze bloed in buisjes die heparine bevatten en laat de buisjes op kamertemperatuur komen.Opmerking: een mini…

Representative Results

5 x 105 neutrofielen/ml werden in een 12-well plaat geplaatst op de dekstroken en gestimuleerd met 20 nm PMA of ongeprikkeld gelaten voor 150 min. De monsters werden vervolgens bevlekt met behulp van primaire konijn anti-menselijke neutrofiele elastase antilichamen, secundaire geit anti-konijn de geconjugeerde antilichamen en DAPI-een fluorescently gelabelde kleurstof die DNA vlekken (Zie de tabel met materialen voor details). Een minimum van 5 beelden werd ver…

Discussion

NET Formation is een relatief recente toevoeging aan het gevarieerde neutrofiele armamentarium4 en er is een opvallende Golf van belang om de implicatie van netten te bestuderen in een breed scala aan onderzoeksgebieden5,7,14,15. Het verwerven van beelden met behulp van immunofluorescentie microscopie en daaropvolgende kwantificering op basis van afbeeldingen is een veel…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Het werk werd gefinancierd door de Crafoord Foundation (TM en PN), de Zweedse overheids onderzoeksbeurs (PN, TM), de Zweedse Onderzoeksraad (PN) en de Groschinsky Foundation (TM, PN).

Materials

BD Vacutainer Heparinised plastic tubes BD Biosciences 367885
Lymphoprep Axis-Shield 114547
RPMI-1640 with L-Glutamine Gibco 11835-030
50mL conical flasks Sarstedt 62.547.004
15mL conical flasks Sarstedt 62.554.002
12-well Tissue culture plates Falcon 10626491
#1 Coverslips 10mm Menzel Glaser CS10100
Glass slides Menzel Glaser 631-0098
Primary anti-human elastase DAKO DAKO rabbit 1373, contract immunization
Secondary fluorophore conjugated goat anti-rabbit Life technologies A-11072, A-11070
PROLONG-Gold Antifade reagent with DAPI Life technologies P36930 Mounting medium
Goat serum Sigma-Aldrich G9023
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) Sigma-Aldrich 79346
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787
Nikon Ti-E Epifluorescence microscope Nikon
CCD camera Andor Zyla
Plan Apochromat 20x, 40x objectives Nikon
Windows 10 Microsoft Operating system
macOS Sierra 10.12 Apple Operating system
MATLAB Mathworks

References

  1. Nauseef, W. M., Borregaard, N. Neutrophils at work. Nature Immunology. 15 (7), 602-611 (2014).
  2. Borregaard, N., Cowland, J. B. Granules of the human neutrophilic polymorphonuclear leukocyte. Blood. 89 (10), 3503-3521 (1997).
  3. Nordenfelt, P., Tapper, H. Phagosome dynamics during phagocytosis by neutrophils. Journal of Leukocyte Biology. 90 (2), 271-284 (2011).
  4. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
  5. Sorensen, O. E., Borregaard, N. Neutrophil extracellular traps – the dark side of neutrophils. Journal of Clinical Investigation. 126 (5), 1612-1620 (2016).
  6. Yipp, B. G., Kubes, P. NETosis: how vital is it?. Blood. 122 (16), 2784-2794 (2013).
  7. Jorch, S. K., Kubes, P. An emerging role for neutrophil extracellular traps in noninfectious disease. Nature Medicine. 23 (3), 279-287 (2017).
  8. Fuchs, T. A., et al. Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps. J Cell Biol. 176 (2), 231-241 (2007).
  9. Mohanty, T., et al. A novel mechanism for NETosis provides antimicrobial defense at the oral mucosa. Blood. 126 (18), 2128-2137 (2015).
  10. Hakkim, A., et al. Activation of the Raf-MEK-ERK pathway is required for neutrophil extracellular trap formation. Nature Chemical Biology. 7 (2), 75-77 (2011).
  11. Brinkmann, V., Goosmann, C., Kuhn, L. I., Zychlinsky, A. Automatic quantification of in vitro NET formation. Frontiers in Immunology. 3, 413 (2012).
  12. Coelho, L. P., et al. Automatic determination of NET (neutrophil extracellular traps) coverage in fluorescent microscopy images. Bioinformatics. 31 (14), 2364-2370 (2015).
  13. Mohanty, T., Sorensen, O. E., Nordenfelt, P. NETQUANT: Automated Quantification of Neutrophil Extracellular Traps. Frontiers in Immunology. 8, 1999 (2017).
  14. Kaplan, M. J., Radic, M. Neutrophil extracellular traps: double-edged swords of innate immunity. Journal of Immunology. 189 (6), 2689-2695 (2012).
  15. Cedervall, J., Olsson, A. K. Immunity Gone Astray – NETs in Cancer. Trends in Cancer. 2 (11), 633-634 (2016).
  16. Ginley, B. G., et al. Computational detection and quantification of human and mouse neutrophil extracellular traps in flow cytometry and confocal microscopy. Scientific Reports. 7 (1), 17755 (2017).

Play Video

Cite This Article
Mohanty, T., Nordenfelt, P. Automated Image-Based Quantification of Neutrophil Extracellular Traps Using NETQUANT. J. Vis. Exp. (153), e58528, doi:10.3791/58528 (2019).

View Video