Автоматизированная количественная оценка нейтрофилов с использованием NET-UANT
Summary
Здесь мы представляем протокол для генерации нейтрофилов внеклеточных ловушек (NET) и операционной NET QuANT, полностью автоматический вариант программного обеспечения для количественной оценки NETs в иммунофлуоресценции изображений.
Abstract
Нейтрофильные внеклеточные ловушки (NET) представляют веб-подобные противомикробные структуры, состоящие из ДНК и гранул, полученных противомикробными белками. Иммунофлуоресцентная микроскопия и методы количественной оценки на основе изображений остаются важными инструментами количественной оценки формирования нейтрофилов внеклеточного люка. Тем не менее, существуют ключевые ограничения для иммунофлуоресценции на основе методов, которые в настоящее время доступны для количественной оценки NETs. Ручные методы количественной оценки NET на основе изображений часто субъективны, склонны к ошибкам и утомительны для пользователей, особенно неопытных пользователей. Кроме того, в настоящее время доступные варианты программного обеспечения для количественной оценки являются либо полуавтоматическими, либо требуют обучения перед эксплуатацией. Здесь мы демонстрируем внедрение автоматизированного метода количественной оценки изображений на основе иммунофлуоресценции для оценки формирования NET, называемого NET’uANT. Программное обеспечение является простым в использовании и имеет удобный графический пользовательский интерфейс (GUI). Он рассматривает биологически значимые параметры, такие как увеличение площади поверхности и коэффициент белка маркера ДНК:NET и ядерная деформация для определения образования NET. Кроме того, этот инструмент построен как свободно доступное приложение, и позволяет одноклеточных резолюции количественной и анализа.
Introduction
Нейтрофилы являются ключевыми посредниками врожденных ответных мер защиты хозяина против широкого спектра микробных патогенов1. Они выполняют свои антимикробные функции, выпустив свои гранулы, содержащие широкий спектр противомикробных белков2, производство реактивных видов кислорода (ROS) и гипохлорит1, и через фагоцитоз3. Кроме того, Бринкманн и др. 4 описанные нейтрофильные внеклеточные ловушки (NET) как новый механизм, с помощью которого нейтрофилы ловушки и ликвидации вторжения патогенов. С момента своего открытия чуть более десяти лет назад4,NETs были вовлечены в широкий спектр инфекционных5,6 и неинфекционных7 заболеваний. NET формирование является активным процессом и приводит к экструзии хроматина ДНК покрыты гранулы полученных противомикробных белков8. Некоторые из ключевых изменений в клеточной и ядерной морфологии, связанные с образованием NET включают потерю ядерной морфологии, хроматин деденденсации, мобилизация гранул белков от цитоплазмы до ядра и увеличение ядерного и клеточного диаметра8,9.
Веб-подобные NET, которые могут появиться как диффузные структуры немного больше, чем клетка или как структуры в несколько раз больше, чем один нейтрофил рассматриваются в качестве индикаторов NETosis5,10. Используя флуоресценцию микроскопии, NETs могут быть обнаружены путем зондирования ДНК с флуоресцентным зондом, таких как 4′,6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI) и иммунофлуоресцентных окрашивания против NET-связанных белков, таких как нейтрофил эластаза. Количественная оценка перекрывающихся областей окрашивания для ДНК и сетевых белков определяет общую площадь под NET на изображении11.
Ряд вариантов анализа изображений доступны для выполнения флуоресценции изображения на основе количественной оценки NETs11,12. Но эти варианты программного обеспечения представляют ограничения в не удобной и / или полностью автоматизированной. В этой статье мы демонстрируем работу NET’uANT13, свободно доступное приложение, которое может выполнять объективной полностью автоматизированной иммунофлуоресцентной микроскопии микроскопии net количественной оценки. Приложение имеет удобный графический интерфейс (GUI) и может выполнять одноклеточный анализ. Программное обеспечение количественно NETosis в изображении путем обнаружения морфологических изменений в области ДНК-NET-связанных маркер, хроматин обезвреживание связанных деформации ядра и увеличение в ДНК: NET-связанных белка соотношение. В совокупности многочисленные критерии определения NET позволяют беспрекорнарно проводить строгую количественную оценку NET в нескольких наборах данных.
Protocol
Representative Results
Discussion
NET формирования является относительно недавним дополнением к разнообразным нейтрофил вооружения4 и наблюдается заметный всплеск интереса к изучению последствий NETs в широком спектре областей исследований5,7,14,<sup class=…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Работа финансировалась Фондом Crafoord (TM и PN), Шведским правительственным исследовательским грантом (PN, TM), Шведским исследовательским советом (PN) и Фондом Грощинского (TM, PN).
Materials
| BD Vacutainer Heparinised plastic tubes | BD Biosciences | 367885 | |
| Lymphoprep | Axis-Shield | 114547 | |
| RPMI-1640 with L-Glutamine | Gibco | 11835-030 | |
| 50mL conical flasks | Sarstedt | 62.547.004 | |
| 15mL conical flasks | Sarstedt | 62.554.002 | |
| 12-well Tissue culture plates | Falcon | 10626491 | |
| #1 Coverslips 10mm | Menzel Glaser | CS10100 | |
| Glass slides | Menzel Glaser | 631-0098 | |
| Primary anti-human elastase | DAKO | DAKO rabbit 1373, contract immunization | |
| Secondary fluorophore conjugated goat anti-rabbit | Life technologies | A-11072, A-11070 | |
| PROLONG-Gold Antifade reagent with DAPI | Life technologies | P36930 | Mounting medium |
| Goat serum | Sigma-Aldrich | G9023 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | 79346 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Nikon Ti-E Epifluorescence microscope | Nikon | ||
| CCD camera | Andor Zyla | ||
| Plan Apochromat 20x, 40x objectives | Nikon | ||
| Windows 10 | Microsoft | Operating system | |
| macOS Sierra 10.12 | Apple | Operating system | |
| MATLAB | Mathworks |
References
- Nauseef, W. M., Borregaard, N. Neutrophils at work. Nature Immunology. 15 (7), 602-611 (2014).
- Borregaard, N., Cowland, J. B. Granules of the human neutrophilic polymorphonuclear leukocyte. Blood. 89 (10), 3503-3521 (1997).
- Nordenfelt, P., Tapper, H. Phagosome dynamics during phagocytosis by neutrophils. Journal of Leukocyte Biology. 90 (2), 271-284 (2011).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Sorensen, O. E., Borregaard, N. Neutrophil extracellular traps – the dark side of neutrophils. Journal of Clinical Investigation. 126 (5), 1612-1620 (2016).
- Yipp, B. G., Kubes, P. NETosis: how vital is it?. Blood. 122 (16), 2784-2794 (2013).
- Jorch, S. K., Kubes, P. An emerging role for neutrophil extracellular traps in noninfectious disease. Nature Medicine. 23 (3), 279-287 (2017).
- Fuchs, T. A., et al. Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps. J Cell Biol. 176 (2), 231-241 (2007).
- Mohanty, T., et al. A novel mechanism for NETosis provides antimicrobial defense at the oral mucosa. Blood. 126 (18), 2128-2137 (2015).
- Hakkim, A., et al. Activation of the Raf-MEK-ERK pathway is required for neutrophil extracellular trap formation. Nature Chemical Biology. 7 (2), 75-77 (2011).
- Brinkmann, V., Goosmann, C., Kuhn, L. I., Zychlinsky, A. Automatic quantification of in vitro NET formation. Frontiers in Immunology. 3, 413 (2012).
- Coelho, L. P., et al. Automatic determination of NET (neutrophil extracellular traps) coverage in fluorescent microscopy images. Bioinformatics. 31 (14), 2364-2370 (2015).
- Mohanty, T., Sorensen, O. E., Nordenfelt, P. NETQUANT: Automated Quantification of Neutrophil Extracellular Traps. Frontiers in Immunology. 8, 1999 (2017).
- Kaplan, M. J., Radic, M. Neutrophil extracellular traps: double-edged swords of innate immunity. Journal of Immunology. 189 (6), 2689-2695 (2012).
- Cedervall, J., Olsson, A. K. Immunity Gone Astray – NETs in Cancer. Trends in Cancer. 2 (11), 633-634 (2016).
- Ginley, B. G., et al. Computational detection and quantification of human and mouse neutrophil extracellular traps in flow cytometry and confocal microscopy. Scientific Reports. 7 (1), 17755 (2017).
