Summary
Здесь мы представляем протокол для генерации нейтрофилов внеклеточных ловушек (NET) и операционной NET QuANT, полностью автоматический вариант программного обеспечения для количественной оценки NETs в иммунофлуоресценции изображений.
Abstract
Нейтрофильные внеклеточные ловушки (NET) представляют веб-подобные противомикробные структуры, состоящие из ДНК и гранул, полученных противомикробными белками. Иммунофлуоресцентная микроскопия и методы количественной оценки на основе изображений остаются важными инструментами количественной оценки формирования нейтрофилов внеклеточного люка. Тем не менее, существуют ключевые ограничения для иммунофлуоресценции на основе методов, которые в настоящее время доступны для количественной оценки NETs. Ручные методы количественной оценки NET на основе изображений часто субъективны, склонны к ошибкам и утомительны для пользователей, особенно неопытных пользователей. Кроме того, в настоящее время доступные варианты программного обеспечения для количественной оценки являются либо полуавтоматическими, либо требуют обучения перед эксплуатацией. Здесь мы демонстрируем внедрение автоматизированного метода количественной оценки изображений на основе иммунофлуоресценции для оценки формирования NET, называемого NET'uANT. Программное обеспечение является простым в использовании и имеет удобный графический пользовательский интерфейс (GUI). Он рассматривает биологически значимые параметры, такие как увеличение площади поверхности и коэффициент белка маркера ДНК:NET и ядерная деформация для определения образования NET. Кроме того, этот инструмент построен как свободно доступное приложение, и позволяет одноклеточных резолюции количественной и анализа.
Introduction
Нейтрофилы являются ключевыми посредниками врожденных ответных мер защиты хозяина против широкого спектра микробных патогенов1. Они выполняют свои антимикробные функции, выпустив свои гранулы, содержащие широкий спектр противомикробных белков2, производство реактивных видов кислорода (ROS) и гипохлорит1, и через фагоцитоз3. Кроме того, Бринкманн и др. 4 описанные нейтрофильные внеклеточные ловушки (NET) как новый механизм, с помощью которого нейтрофилы ловушки и ликвидации вторжения патогенов. С момента своего открытия чуть более десяти лет назад4,NETs были вовлечены в широкий спектр инфекционных5,6 и неинфекционных7 заболеваний. NET формирование является активным процессом и приводит к экструзии хроматина ДНК покрыты гранулы полученных противомикробных белков8. Некоторые из ключевых изменений в клеточной и ядерной морфологии, связанные с образованием NET включают потерю ядерной морфологии, хроматин деденденсации, мобилизация гранул белков от цитоплазмы до ядра и увеличение ядерного и клеточного диаметра8,9.
Веб-подобные NET, которые могут появиться как диффузные структуры немного больше, чем клетка или как структуры в несколько раз больше, чем один нейтрофил рассматриваются в качестве индикаторов NETosis5,10. Используя флуоресценцию микроскопии, NETs могут быть обнаружены путем зондирования ДНК с флуоресцентным зондом, таких как 4',6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI) и иммунофлуоресцентных окрашивания против NET-связанных белков, таких как нейтрофил эластаза. Количественная оценка перекрывающихся областей окрашивания для ДНК и сетевых белков определяет общую площадь под NET на изображении11.
Ряд вариантов анализа изображений доступны для выполнения флуоресценции изображения на основе количественной оценки NETs11,12. Но эти варианты программного обеспечения представляют ограничения в не удобной и / или полностью автоматизированной. В этой статье мы демонстрируем работу NET'uANT13, свободно доступное приложение, которое может выполнять объективной полностью автоматизированной иммунофлуоресцентной микроскопии микроскопии net количественной оценки. Приложение имеет удобный графический интерфейс (GUI) и может выполнять одноклеточный анализ. Программное обеспечение количественно NETosis в изображении путем обнаружения морфологических изменений в области ДНК-NET-связанных маркер, хроматин обезвреживание связанных деформации ядра и увеличение в ДНК: NET-связанных белка соотношение. В совокупности многочисленные критерии определения NET позволяют беспрекорнарно проводить строгую количественную оценку NET в нескольких наборах данных.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Комитет по этике Лундского университета одобрил сбор венозной крови здоровых добровольцев в соответствии с Хельсинкской декларацией (2013/728). Все добровольцы предоставили свое письменное информированное согласие.
1. Изоляция нейтрофилов периферической крови с использованием плотности градиентной центробежки
- Соберите венозную кровь человека в трубках, содержащих гепарин и позволяют трубам достичь комнатной температуры.
Примечание: Минимум 16 мл крови от здорового донора требуется для получения достаточно большой клеточной гранулы. - Смешайте кровь с одним объемом 2% декесцент в сольнике (0,9% NaCl) и дайте осадка при комнатной температуре в течение 30 минут в стерильной 50 мл конической центрифуги трубки.
- Примачивать супернатант в стерильную коническую центрифугу 50 мл и центрифугу при 200 х г в течение 10 мин при 4 градусах Цельсия.
- С этого шага и далее продолжайте изоляцию при 4 градусах Цельсия или на льду.
- Приостановите гранулы в 5 мл ледяного солева и слой на вершине 5 мл градиента изоляции лейкоцитов (9,1% диатризоата натрия с 5,7% декекрон, w/v) в стерильной 15 мл конической центрифуги трубки.
- Центрифуга в течение 30 мин при 400 х г при 4 градусах По Цельсию.
- Аспирируй супернатанта и отбрось те.
- Лысы красных кровяных телец, resuspending гранулы в 3 мл ледяной воды в течение 30 с. Немедленно добавить 1 мл 3,6% NaCl, а затем заполнить с 10 мл ледяного сольника.
- Центрифугия подвески ячейки в течение 10 мин на 350 х г.
- Удалить супернатант, собрать клетку гранулы и resuspend его в 1 мл сольного раствора. Отложите 10 кл в микроцентрифуговой трубке для оценки числа клеток и жизнеспособности с помощью трипан-голубого цвета в камере Бюркера.
- Добавьте 10 qL клеточной подвески к 90 зл0 0,4% trypan синий раствор. Возьмите 10 л суспензии клеток в камере Бюркера. Подсчитайте ячейки в 4 квадратах, связанных по 3 линии в каждом углу камеры. Клетки, которые кажутся темно-синими для поглощения красителя являются нежизнеспособными, исключить их из общего числа клеток.
- Выразите номер ячейки как ячейки/мл, как это определено в уравнении ниже.
Примечание: Здесь камерный фактор составил 10 000, коэффициент разбавления – 10, а общее количество квадратов – 4. - Разбавить оставшуюся подвеску ячейки до 10 мл для заключительного шага стирки.
- Центрифуга в течение 5 мин при 200 х г.
- Приостанавливайте работу нейтрофилов в RPMI-1640 с помощью 2 мг/мл теплоинактивированного сывороточного альбома (HSA) в концентрации 5 х 105 клеток/мл.
2. Подготовка заедок и стимуляция нейтрофилов
- Поместите один coverslip (10 мм, #1) в каждой скважине из 12-хорошо пластины и пальто coverslip, добавив 200 зл и 0,01% поли-L-лизин раствор и оставить его на 37 градусов по Цельсию на ночь.
- Вымойте крышки с 300 л фосфатного буфера солине (PBS) один раз и оставить высохнуть.
- Добавьте 400 л из 5 х 105 нейтрофилов/мл к каждой скважине и инкубировать при комнатной температуре в течение 15 минут.
- Переместите пластину, содержащую нейтрофилы, в инкубатор при 37 градусах Цельсия с 5% CO2 в течение 15 минут.
- Удалите супернатант. Добавьте 400 л предогревой среды RPMI-1640 с 2 мг/мл HSA для управления. Добавьте 300 юаней предварительно разогретого RPMI с 20 нм phorbol 12-миристат 13-ацетат (PMA) для стимуляции.
- Стимулировать нейтрофилов в течение 150 мин при 37 градусах Цельсия с 5% CO2.
3. Визуализация NETs
- Удалите супернатант и промойте образцы 2x с 200 Зл Л PBS.
- Исправьте образцы, добавив 200 кЛ 4% параформальдегида (PFA) в PBS в течение 20 мин при 37 градусах Цельсия.
Примечание: PFA является токсичным и должны быть обработаны с осторожностью. - Промойте образцы 3x с 200 Зл Л PBS.
- Пермяки избавите образцы, добавив 50 зл 0,5% Тритон X-100 на 30 с.
- Вымойте образцы 3x с 200 Л Л PBS.
- Блок образцы с 5% козьей сыворотки в PBS для 1 ч при 37 градусов по Цельсию.
- Добавьте 300 л первичного кроличьего античеловеческого нейтрофила эластаза в блокирующий раствор при разбавлении 1:500 на 90 мин при 37 градусах Цельсия.
- Вымойте образцы 3x с 300 Л Л PBS.
- Добавьте 300 л вторичных козла против кролика флуоресцентные антитела при разбавлении 1:1000 в течение 90 минут при 37 градусах Цельсия.
- Вымойте крышки 3x с 300 Л Л PBS.
- Удалите крышки из колодцев и смонтировать крышку с 10 зликатовой средой, содержащей DAPI. Хранить на ночь при комнатной температуре в темноте, чтобы высушить образцы.
Примечание: Окрашивание ДНК с Помощью DAPI, безусловно, является важным шагом в методе. Пользователи также могут устранить неполадки, добавив экзогенный раствор DAPI в конечном диапазоне концентрации 0,1 х u20120.5 мкг/мл в течение 2х20123 мин, а затем 3 стиральные ступени с 300 МЛ PBS. - Приобретайте изображения с широкоугольным флуоресцентным микроскопом с помощью цели 20X.
4. Анализ и количественная оценка НЕТ с использованием НЕТЗУАНТ
Примечание: НЕТЗУАНТ можно загрузить, нажав на файл установки, найденный в архиве Зено до Гитхаба или на веб-сайте Лаборатории Норденфельт(https://nordlab.med.lu.se/?page_id=34).
- Импорт наборов данных для анализа, именования каналов и преобразования изображений
- Откройте вкладку Настройка в НЕТЗУАНТ.
- Выберите исходную папку для анализа, нажав опцию «Получить путь» в исходном меню, и выберите папку, содержащую последовательности изображений для анализа.
- Нажмите на опцию Get Path в целевом меню и выберите папку для сохранения данных после анализа изображений.
- Назовите каналы так, чтобы "канал ДНК" соответствовал окрашиванию ДНК(например,ДНК или DAPI) и "NET-канал" изображает NET-связанных белкового окрашивания(например,NET, нейтрофил эластаза) в изображениях. Для бесперебойного функционирования программного обеспечения (рекомендуемое) назовите папку, содержащую файлы изображения управления, как "контроль".
Примечание: Канал NET относится только к маркеру гранулированного белка, связанного с NET. - Накормите метаданные изображения в программное обеспечение, нажав кнопку информации об изображении Load в подменю информации об изображении.
- Выберите правильный порядок канала, содержащийся в изображениях в подменю заказа канала. Этот вариант был включен в качестве сбоев для предотвращения случайных несоответствий.
- Приобретите первичные свойства изображения из необработанных данных и преобразуйте изображения, нажав кнопку Подготовительные данные. Преобразованные изображения отображаются в подменю типа «Образец». Нажмите на меню типа «Образец» для отображения и выбора всех наборов данных, приобретенных для анализа.
- Выберите изображение из подменю типа Sample и нажмите на кнопку данных изображения Display для отображения изображений, разделенных на ДНК и канал NET соответственно.
- Сегментация клеток в канале ДНК и канале NET
- Выберите метод сегментации, нажав на подменю метода как в канале ДНК, так и в канале NET.
Примечание: Метод сегментации по умолчанию настроен на адаптивный и является рекомендуемой настройкой. Другие варианты также доступны, включая глобальные, края и Chan-Vese. Вариант водораздела также включен, чтобы помочь различать тесно расположенные клетки или NETs. - Введите вкладку Сегментации, чтобы сначала сегментировать контрольные ячейки в обоих каналах, нажав на опцию управления сегментом.
- Выберите PMA из подменю типа образца и нажмите на опцию Пакета (рекомендуется), чтобы начать сегментацию всех изображений, включенных в набор данных. Выберите изображения в меню типа образца и нажмите на кнопку данных изображения Display, чтобы визуализировать и проверить двоичные маски изображения (маска ДНК и маска NET), генерируемые после сегментации.
- Выберите метод сегментации, нажав на подменю метода как в канале ДНК, так и в канале NET.
- Одноклеточный анализ идентифицируемых свойств
- Введите вкладку анализа и проанализируйте контрольные образцы, нажав на кнопку «Определить порог».
- Измените тип образца на PMA и нажмите на кнопку Свойства ячейки Get, чтобы завершить анализ стимулируемых образцов.
- Выберите изображение из подменю типа Sample и нажмите на кнопку данных изображения Display для отображения наложения и количества ячеек и клеток NET на изображении.
- Сравнение свойств клеток для выявления NET-образующих ячеек
- Выберите образец из подменю типа образца и нажмите на кнопку «Анализ NET», чтобы завершить анализ. Отдельные изображения могут быть выбраны из подменю типа образца для анализа или весь пакет изображений могут быть проанализированы путем выбора варианта партии (рекомендуется).
- Отрегулируйте критерии NET вручную, чтобы дать оптимальные результаты для данной выборки. Сравните идентифицированные NET с оригинальными изображениями для оценки качества идентификации.
Примечание: Критерии NET могут быть использованы во всех изображениях в наборе данных. Любые изменения в NET-критериях применяются одновременно во всех контрольных образцах. Это ограничивает возможность любых потенциальных различий, которые могут возникнуть из-за чрезмерной установки параметров NET. Настройки в критериях NET могут быть скорректированы в соответствии с требованиями пользователя. Взаимосвязь между ложными показателями обнаружения и NET'UANT была исследована ранее13. Типичные диапазоны для увеличения площади 2 кв20124, круговость составит 0,7 кв20120,9 и соотношение ДНК / NET, чтобы быть 0,6-2,0. - Проинспектировать резюме данных в подменю данных ячейки, где отображается количество изображений, количество клеток на изображение и процент NET на изображение.
Примечание: Общий процент NET во всем наборе данных отображается "NET-gauge". Общее количество изображений, количество клеток, процент NET в выборке (NETs%) и NETs% в контрольной выборке отображаются в таблице сводной статистики ниже NET-калибра. Мы рекомендуем сообщать данные контроля наряду с данными, полученными из стимулируемых образцов.
- Результаты
- Введите вкладку «Выход» для выбора и просмотра результатов.
- Изучите и сравните различные результаты данных, полученные в результате анализа управления и PMA, выбрав форму вывода и нажав на кнопку результатов вывода.
Примечание: Все данные, генерируемые после анализа как элементов управления, так и стимуляции, сохраняются в папке анализа, выбранной в целевом подменю. Данные сохраняются в форматах .csv или .pdf. - Запуск файла Метод для получения версии программного обеспечения и NET-критериев, используемых для анализа (для включения в раздел методы для целей публикации).
- Нажмите на таблицу данных Результатов, чтобы визуализировать отдельные точки данных в данном образце.
- Визуализируйте распределение площади NET и соотношение ДНК:NET в образцах. Красная линия указывает пороговое значение на графиках.
- Определите область NET по сравнению с формой ДНК, нажав на файл распределения Bivariate.
- Загрузка предыдущего анализа и пакет все шаги
- Загрузите ранее успешные настройки анализа в NET'UANT с помощью кнопки предыдущего анализа Load.
- Используйте кнопку Пакета все шаги, включенные в меню настройки, чтобы выполнить шаги 5'u201212(Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5)непосредственно для получения конечного вывода.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
5 х 105 нейтрофилов/мл были посеяны на крышки, помещенные в 12-колодую пластину и стимулируемые либо 20 нМ PMA или оставленные нестимулированными в течение 150 мин. Образцы были затем окрашены с использованием первичных кролика анти-человеческих антитела нейтрофилов, вторичный коза анти-кроличьи флюорофора конъюгированных антител и DAPI - флуоресцентно помечены красителя, который пятна ДНК (см. таблицу материалов для деталей). Минимум 5 изображений были получены с помощью эпифлюоресцентного микроскопа и цели 20X (NA 0,75). Примеры данных, используемых для анализа в рукописи, можно загрузить, следуя ссылке https://nordlab.med.lu.se/?page_id=34 и нажав на значок набора данных образца.
Здесь мы описываем способность рабочего процесса NET-UANT(рисунок 1) количественно количественно формироваться NET в данном образце. Программный инструмент может быть установлен в качестве приложения в MATLAB и может быть использован без каких-либо предыдущих знаний этого интерфейса. ГУИ НЕТЗУАНТ использовался для анализа наборов данных, описанных выше. Все изображения, используемые для анализа NET'uANT, всегда остаются неизменными в родительском каталоге. GUI разделен на 4 вкладки - вкладка настройки, вкладка сегментации, вкладка анализа и вывод результатов. Образцы были подготовлены для анализа в вкладке установки(рисунок 2). Пути файла (1), именования конвенций (2), информации изображения (3) и заказов каналов (4) определяются пользователем. Вариант подготовки данных (5) гарантирует, что преобразование и организация в стандартизированном виде на протяжении всего эксперимента. Параметры сегментации были установлены во вкладке сегментации(рисунок 3)для идентификации отдельных ячеек в образцах (6). Контрольные образцы всегда сегментируются первыми (7) до сегментации стимулированных образцов (8). Все рекомендуемые значения для сегментации указаны во вкладке программного обеспечения. Свойства, определяющие нестимулированные контрольные клетки, сначала приобретаются (9), а затем сравниваются с PMA стимулировали клетки (10)(рисунок 4). NET затем анализируются в образцах на основе критериев NET (11) и отображаются с общим количеством изображений, количеством клеток и соответствующими NET% в контрольных образцах. Окончательные результаты данных из анализа были отобраны, а затем визуализированы(рисунок 5). Вариант для загрузки и использования ранее успешного анализа, а также пакет-все вариант для обработки групп шагов 5-12(Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4 , Рисунок 5) также были включены в вкладку настройки.
В ходе анализа в ходе эксперимента было проанализировано в общей сложности 2619 клеток. PMA стимулировали нейтрофилов смогли генерировать 90,59% NETs (NETs%) в отличие от 25,87 NETs% в контрольных образцах(рисунок 6). Анализ изображений был завершен в течение 10 минут после инацирования рабочего процесса на программном обеспечении. Таким образом, NET UANT предоставляет быструю и удобную возможность количественной оценки образования NET в изображениях, которые были приобретены с помощью иммунофлуоресцентной микроскопии.
Рисунок 1: Обзор рабочего процесса НЕТЗУАНТ. Флуоресцентные микрографы человеческих нейтрофилов, в два раза окрашенных антиэластазой и DAPI (ДНК) сначала обрабатываются и преобразуются. Затем изображения сегментируются, после чего следует анализ свойств клеток, обнаружение NET и результаты результатов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Настройка вариантов вкладки в NET'UANT. Пути файлов для анализа наборов данных и папок вывода данных вводятся в вкладку настройки (1). Затем заполняются соглашения о именовании для определения имен каналов и имени папки управления (2). Затем приобретается информация об изображении (3), после чего следует именование правильного порядка канала (4). Надлежащая настройка всех полей рекомендуется до обработки наборов данных (5) для стандартизированного преобразования изображений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Параметры вкладки сегментации в NET'UANT. Параметры, используемые для сегментации как канала ДНК, так и NET-белкового маркера, включают метод, чувствительность, итерации, минимальную площадь и водораздел (6). Рекомендуется использовать метод адаптивной сегментации и водораздел. Кроме того, другие настройки, представленные в качестве пресетов в программном обеспечении, могут быть использованы без изменений для большинства целей. Контрольные образцы сначала сегментируются (7), а затем стимулируемые образцы сегментируются (8). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Обнаружение NET s во вкладке анализа. Свойства клеток, определяющие нестимулированные клетки, анализируются и приобретаются из контрольных образцов (9). Затем следует анализ свойств клеток в экспериментальных образцах (10). Критерии определения NET (увеличение площади клеток, ядерная деформация (значения от 0 до 1) и область окрашивания ДНК/область окрашивания NET/NET-маркера) применяются как к контрольным, так и к стимулированным образцам для определения образования NET (11). Количество NET, общее количество клеток и количество изображений в обоих образцах отображаются в разделе сводной статистики. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: Визуализация выводных файлов результатов в NET ЗУАНТ. Результаты, полученные после анализа, могут быть выбраны отдельным пользователем. Результаты, которые могут быть получены с помощью NET'uANT, включают файл .csv, содержащий точки данных из отдельных ячеек. Кроме того, в анализе также генерируются гистограммы, изображающие распределение клеток, подвергающихся увеличению в области NET (клеточной), деформация ядра из-за обезвреживания хроматина и соотношения ДНК:NET-маркера, а также 3D-график области NET против ядерной деформации. Все выводы автоматически сохраняются в папке анализа, выбранной в вкладке настройки как файлы .csv, .pdf и .txt. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 6: Анализ формирования NET. (A) NETs%, общее количество клеток и количество изображений из набора тестовых данных, как это отмечено в сводной статистике управления и пМР-стимулировали (20 нм) нейтрофилов. (B) состороннее сравнение гистограмм, изображающих увеличение площади, ядерную деформацию (значения 0 к 1) и соотношение ДНК/NET в контролье и pmA-стимулировали образцы. Красная линия в пороговых значениях гистограмм для критериев определения NET. (C) Сравнение 3D-графика области NET и ядерной деформации, порожденной анализом контрольных и стимулируемых ПМА проб. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
NET формирования является относительно недавним дополнением к разнообразным нейтрофил вооружения4 и наблюдается заметный всплеск интереса к изучению последствий NETs в широком спектре областей исследований5,7,14,15. Приобретение изображений с использованием иммунофлуоресцентной микроскопии и последующая количественная оценка изображений является широко используемым методом количественной оценки NET. Преимущество этого подхода заключается в том, что он может обнаруживать клетки, образующие NET на одноклеточном уровне, и поэтому может лучше уменьшить фоновый сигнал. Ручные методы количественной оценки могут быть исчерпывающими, медленными и подверженными необъективности пользователей. Существует несколько полуавтоматических опций, которые предоставили пользователям надежный анализ11,12. Однако для их эксплуатации могут потребоваться значительные технические навыки или может потребоваться несколько ручных шагов для количественной оценки. Это является сложной задачей, особенно для ранее не опытных пользователей. В недавней публикации, полностью автоматический вычислительный метод был использован для количественной оценки образования NET с использованием потока цитометрии на основе изображений, а также тонкие секции тканей. Тем не менее, он может быть применен только к конкретным сценариям, а также требует значительных знаний программирования для операции16. В настоящее время полностью автоматизированное программное обеспечение для количественной оценки изображений, предназначенное для общей количественной оценки NET, которая проста в использовании и обладает одноклеточным разрешением, недоступно исследователям.
Здесь мы представляем NET UANT, полностью автоматизированное программное обеспечение для количественной оценки NET, которое находится в свободном доступе. Это программное обеспечение было разработано специально для количественной оценки формирования NET с высокой строгостью с использованием иммунофлуоресцентных микроскопических изображений, а также с возможностью выполнения одноклеточного анализа и количественной оценки. Помимо рассмотрения увеличения площади окрашивания под NETs, НЕТЗУАНТ также учитывает ядерную деформацию из-за обезвреживания хроматина и увеличение совместной локализации белка ДНК/NET-маркера для определения образования NET в данном образце. Это позволяет различать клетки, которые только подверглись ядерному оденденции из клеток, которые подверглись полному образованию NET. Критерии определения NET, включенные в алгоритм NET'UANT, позволяют повысить строгость в количественной оценке по сравнению со многими более ранними подходами к количественной оценке, которые опираются исключительно на увеличение площади net окрашивания.
Графический интерфейс предназначен для удобного и простого в использовании. Каждый шаг анализа пронумеровался для того, чтобы пользователи могли следить за рабочим процессом. Одной из ключевых особенностей, представленных в программном обеспечении, является инструмент сегментации/вкладка, который позволяет NET'uANT выполнять одноклеточный анализ в изображениях, что является максимально возможной чувствительностью, которая может быть достигнута. Это делает NET'UANT одним из немногих доступных вариантов, которые могут выполнять одноклеточную количественную оценку для количественной оценки формирования NET. Кроме того, Mohanty et al. продемонстрировали, что программное обеспечение также может адаптироваться к изменениям изображения и параметрам приобретения13. Благодаря гибкости, предлагаемой в критериях сегментации и определения NET, могут быть учтены вариации доноров и пластин. НЕТЗУАНТ может адекватно обрабатывать большие наборы данных и может быть использован для надежного анализа изображений с высокой пропускной прибылью13.
Хотя мы обнаружили, что рабочий процесс дает надежные результаты от нескольких доноров, мы рекомендуем пользователю принять решение о соответствующих значениях на основе отдельных образцов. Теоретически на данные, генерируемые после анализа, может также влиять высокая плотность клеток. Кроме того, чрезмерное скопление NETs может привести к сокращению числа обнаруженных NET. Это связано с тем, что алгоритм сегментации не может различать запутанные NET-на отдельные события. Аналогичная проблема с сегментацией может возникнуть и в том случае, если нестимулированные нейтрофилы оказались в ловушке в пределах NET. Использование изображений, полученных на 20X и 40X в настоящее время рекомендуется, как производительность NET'uANT не была протестирована на других уровнях увеличения. Тем не менее, до тех пор, пока размер пикселей устанавливается правильно (либо вручную, либо из метаданных в разделе информации о изображении нагрузки), программное обеспечение должно точно адаптировать расчеты области к более высоким или более низким увеличениям. Правильное окрашивание ДНК и гранул маркер является критическим фактором. Плохое окрашивание или низкое качество изображения в любом канале приведет к неоптимальным результатам. Поэтому рекомендуется, чтобы пользователь должен определить подходящий номер ячейки, процедуры окрашивания и антитела титр, чтобы дать оптимальные результаты.
НЕТКУАНТ был протестирован только на NET, полученных от человеческих нейтрофилов в пробирке. NETs от других видов могут также количественно с надлежащей корректировки в критериях. Количественная оценка NET может быть выполнена на стационарных образцах в камерных слайдах или многоколодцных стеклянных нижних пластинах. Высокое качество изображения образцов окрашенных для ДНК и гранулы маркеры белка имеют решающее значение. Кроме того,можно адаптировать для количественной оценки других форм внеклеточных ловушек (ET)-osis, например, в том виде, в каком они проявляют эозинофилы. Количественная оценка ЭТ в негранулоцитах, таких как моноциты, в настоящее время невозможна, так как для алгоритма сегментации требуется цитоплазматическая область гранул.
В заключение, NET UANT является простым, автоматическим и быстрым инструментом для точной идентификации формирования NET, который позволяет проводить одноклеточный анализ и количественную оценку. Мы считаем, что это программное обеспечение может снизить барьер для выполнения автоматической количественной оценки NET и что научное сообщество выиграет от этого свободно доступного приложения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ТМ и PN имеют патент, связанный с алгоритмами, используемыми в NET'UANT.
Acknowledgments
Работа финансировалась Фондом Crafoord (TM и PN), Шведским правительственным исследовательским грантом (PN, TM), Шведским исследовательским советом (PN) и Фондом Грощинского (TM, PN).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Vacutainer Heparinised plastic tubes | BD Biosciences | 367885 | |
| Lymphoprep | Axis-Shield | 114547 | |
| RPMI-1640 with L-Glutamine | Gibco | 11835-030 | |
| 50mL conical flasks | Sarstedt | 62.547.004 | |
| 15mL conical flasks | Sarstedt | 62.554.002 | |
| 12-well Tissue culture plates | Falcon | 10626491 | |
| #1 Coverslips 10mm | Menzel Glaser | CS10100 | |
| Glass slides | Menzel Glaser | 631-0098 | |
| Primary anti-human elastase | DAKO | DAKO rabbit 1373, contract immunization | |
| Secondary fluorophore conjugated goat anti-rabbit | Life technologies | A-11072, A-11070 | |
| PROLONG-Gold Antifade reagent with DAPI | Life technologies | P36930 | Mounting medium |
| Goat serum | Sigma-Aldrich | G9023 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | 79346 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Nikon Ti-E Epifluorescence microscope | Nikon | ||
| CCD camera | Andor Zyla | ||
| Plan Apochromat 20x, 40x objectives | Nikon | ||
| Windows 10 | Microsoft | Operating system | |
| macOS Sierra 10.12 | Apple | Operating system | |
| MATLAB | Mathworks |
References
- Nauseef, W. M., Borregaard, N. Neutrophils at work. Nature Immunology. 15 (7), 602-611 (2014).
- Borregaard, N., Cowland, J. B. Granules of the human neutrophilic polymorphonuclear leukocyte. Blood. 89 (10), 3503-3521 (1997).
- Nordenfelt, P., Tapper, H. Phagosome dynamics during phagocytosis by neutrophils. Journal of Leukocyte Biology. 90 (2), 271-284 (2011).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Sorensen, O. E., Borregaard, N. Neutrophil extracellular traps - the dark side of neutrophils. Journal of Clinical Investigation. 126 (5), 1612-1620 (2016).
- Yipp, B. G., Kubes, P. NETosis: how vital is it? Blood. 122 (16), 2784-2794 (2013).
- Jorch, S. K., Kubes, P. An emerging role for neutrophil extracellular traps in noninfectious disease. Nature Medicine. 23 (3), 279-287 (2017).
- Fuchs, T. A., et al. Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps. J Cell Biol. 176 (2), 231-241 (2007).
- Mohanty, T., et al. A novel mechanism for NETosis provides antimicrobial defense at the oral mucosa. Blood. 126 (18), 2128-2137 (2015).
- Hakkim, A., et al. Activation of the Raf-MEK-ERK pathway is required for neutrophil extracellular trap formation. Nature Chemical Biology. 7 (2), 75-77 (2011).
- Brinkmann, V., Goosmann, C., Kuhn, L. I., Zychlinsky, A. Automatic quantification of in vitro NET formation. Frontiers in Immunology. 3, 413 (2012).
- Coelho, L. P., et al. Automatic determination of NET (neutrophil extracellular traps) coverage in fluorescent microscopy images. Bioinformatics. 31 (14), 2364-2370 (2015).
- Mohanty, T., Sorensen, O. E., Nordenfelt, P. NETQUANT: Automated Quantification of Neutrophil Extracellular Traps. Frontiers in Immunology. 8, 1999 (2017).
- Kaplan, M. J., Radic, M. Neutrophil extracellular traps: double-edged swords of innate immunity. Journal of Immunology. 189 (6), 2689-2695 (2012).
- Cedervall, J., Olsson, A. K. Immunity Gone Astray - NETs in Cancer. Trends in Cancer. 2 (11), 633-634 (2016).
- Ginley, B. G., et al. Computational detection and quantification of human and mouse neutrophil extracellular traps in flow cytometry and confocal microscopy. Scientific Reports. 7 (1), 17755 (2017).
