Automatisert image-basert kvantifisering av nøytrofile ekstracellulære feller bruke NETQUANT
Summary
Her presenterer vi en protokoll for generering av nøytrofile ekstracellulære feller (NETs) og drift av NETQUANT, et helautomatisk programvare alternativ for kvantifisering av NETs i immunofluorescence bilder.
Abstract
Nøytrofile ekstracellulære feller (NETs) er Web-lignende antimikrobielle strukturer bestående av DNA og granule avledet antimikrobielle proteiner. Immunofluorescence mikroskopi og bildebasert kvantifisering metoder er fortsatt viktige verktøy for å quantitate nøytrofile ekstracellulære felle formasjon. Det er imidlertid viktige begrensninger for de immunofluorescence metodene som for øyeblikket er tilgjengelige for kvantifisere NETs. Manuelle metoder for avbildningsbasert NET kvantifisering er ofte subjektive, utsatt for feil og kjedelige for brukere, spesielt ikke-erfarne brukere. Også for øyeblikket tilgjengelige programvarealternativer for kvantifisering er enten semi-automatisk eller krever opplæring før drift. Her viser vi implementeringen av en automatisert immunofluorescence bilde kvantifisering metode for å evaluere NET-formasjonen kalt NETQUANT. Programvaren er enkel å bruke og har en brukervennlig grafisk brukergrensesnitt (GUI). Det anser biologisk relevante parametre som en økning i areal og DNA: NET markør protein ratio, og kjernefysisk deformasjon å definere NET formasjon. Videre er dette verktøyet bygget som en fritt tilgjengelig app, og gir mulighet for én celle oppløsning kvantifisering og analyse.
Introduction
Nøytrofile er avgjørende meglere av medfødt vert forsvaret svar mot en rekke mikrobielle patogener1. De utfører sine antimikrobielle funksjoner ved å slippe sine granulater inneholder et bredt utvalg av antimikrobielle proteiner2, produsere reaktive oksygen arter (ros) og natriumhypokloritt1, og gjennom fagocytose3. I tillegg Brinkmann et al. 4 beskrevet nøytrofile ekstracellulære feller (Nets) som en roman mekanisme der nøytrofile felle og eliminere invaderende patogener. Siden deres oppdagelse litt over et ti år siden4, har Nets vært innblandet i et bredt utvalg av smittsomme5,6 og ikke-smittsomme7 morbidities. NET formasjon er en aktiv prosess og resulterer i ekstrudering av kromatin DNA belagt med granule-avledet antimikrobielle proteiner8. Noen av de viktigste endringene i cellulære og kjernefysiske morfologi forbundet med netto formasjon inkluderer tap av kjernefysisk morfologi, kromatin decondensation, mobilisering av granule proteiner fra cytoplasma til kjernen og en økning i kjernefysiske og cellulære diameter8,9.
De Web-lignende garn, som kan vises som diffuse strukturer litt større enn cellen eller som strukturer flere ganger større enn en enkelt nøytrofile regnes som indikatorerpå NETosis. Ved hjelp av fluorescens mikroskopi, kan NETs oppdages ved å undersøke DNA med en fluorescerende sonde som 4 ‘, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) og ved immunofluorescence farging mot netto bundne proteiner som nøytrofile elastase. Kvantifisering av overlappende områder av farging for DNA og NET-Bound proteiner bestemmer det totale arealet under NETs i et bilde11.
En rekke bildeanalyse alternativer er tilgjengelige for å utføre fluorescens bildebasert kvantifisering av garn11,12. Bortsett fra disse programvare valgmulighetene gave begrensninger inne ikke tilværelse bruker-vennlig og/eller fullt ut automatisert. I denne artikkelen viser vi driften av NETQUANT13, en fritt tilgjengelig app som kan utføre upartiske helautomatisk immunofluorescence mikroskopi bilde-basert net kvantifisering. Programmet har et brukervennlig grafisk grensesnitt (GUI) og kan utføre enkelt celle analyse. Programvaren kvantifiserer NETosis i et bilde ved å detektere de morfologiske endringene i området DNA-NET-Bound markør, kromatin decondensation tilhørende deformasjon av kjernen og økning i DNA: NET-Bound protein ratio. Til sammen gir flere NET definisjons kriterier strenge NET-kvantifisering på tvers av flere datasett på en upartisk måte.
Protocol
Representative Results
Discussion
Netto formasjon er et relativt nylig tillegg til de ulike nøytrofile armamentarium4 og det har vært en merkbar bølge av interesse å studere konsekvensen av garn i et bredt spekter av forskningsområder5,7,14,15. Anskaffelse av bilder ved hjelp av Immunofluorescence mikroskopi og påfølgende bildebasert kvantifisering er en mye brukt metode for å kvantifisere NETs. …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Arbeidet ble finansiert av Crafoord Foundation (TM og PN), svensk stats forskningsstipend (PN, TM), svensk forskningsråd (PN) og Groschinsky Foundation (TM, PN).
Materials
| BD Vacutainer Heparinised plastic tubes | BD Biosciences | 367885 | |
| Lymphoprep | Axis-Shield | 114547 | |
| RPMI-1640 with L-Glutamine | Gibco | 11835-030 | |
| 50mL conical flasks | Sarstedt | 62.547.004 | |
| 15mL conical flasks | Sarstedt | 62.554.002 | |
| 12-well Tissue culture plates | Falcon | 10626491 | |
| #1 Coverslips 10mm | Menzel Glaser | CS10100 | |
| Glass slides | Menzel Glaser | 631-0098 | |
| Primary anti-human elastase | DAKO | DAKO rabbit 1373, contract immunization | |
| Secondary fluorophore conjugated goat anti-rabbit | Life technologies | A-11072, A-11070 | |
| PROLONG-Gold Antifade reagent with DAPI | Life technologies | P36930 | Mounting medium |
| Goat serum | Sigma-Aldrich | G9023 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | 79346 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Nikon Ti-E Epifluorescence microscope | Nikon | ||
| CCD camera | Andor Zyla | ||
| Plan Apochromat 20x, 40x objectives | Nikon | ||
| Windows 10 | Microsoft | Operating system | |
| macOS Sierra 10.12 | Apple | Operating system | |
| MATLAB | Mathworks |
References
- Nauseef, W. M., Borregaard, N. Neutrophils at work. Nature Immunology. 15 (7), 602-611 (2014).
- Borregaard, N., Cowland, J. B. Granules of the human neutrophilic polymorphonuclear leukocyte. Blood. 89 (10), 3503-3521 (1997).
- Nordenfelt, P., Tapper, H. Phagosome dynamics during phagocytosis by neutrophils. Journal of Leukocyte Biology. 90 (2), 271-284 (2011).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Sorensen, O. E., Borregaard, N. Neutrophil extracellular traps – the dark side of neutrophils. Journal of Clinical Investigation. 126 (5), 1612-1620 (2016).
- Yipp, B. G., Kubes, P. NETosis: how vital is it?. Blood. 122 (16), 2784-2794 (2013).
- Jorch, S. K., Kubes, P. An emerging role for neutrophil extracellular traps in noninfectious disease. Nature Medicine. 23 (3), 279-287 (2017).
- Fuchs, T. A., et al. Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps. J Cell Biol. 176 (2), 231-241 (2007).
- Mohanty, T., et al. A novel mechanism for NETosis provides antimicrobial defense at the oral mucosa. Blood. 126 (18), 2128-2137 (2015).
- Hakkim, A., et al. Activation of the Raf-MEK-ERK pathway is required for neutrophil extracellular trap formation. Nature Chemical Biology. 7 (2), 75-77 (2011).
- Brinkmann, V., Goosmann, C., Kuhn, L. I., Zychlinsky, A. Automatic quantification of in vitro NET formation. Frontiers in Immunology. 3, 413 (2012).
- Coelho, L. P., et al. Automatic determination of NET (neutrophil extracellular traps) coverage in fluorescent microscopy images. Bioinformatics. 31 (14), 2364-2370 (2015).
- Mohanty, T., Sorensen, O. E., Nordenfelt, P. NETQUANT: Automated Quantification of Neutrophil Extracellular Traps. Frontiers in Immunology. 8, 1999 (2017).
- Kaplan, M. J., Radic, M. Neutrophil extracellular traps: double-edged swords of innate immunity. Journal of Immunology. 189 (6), 2689-2695 (2012).
- Cedervall, J., Olsson, A. K. Immunity Gone Astray – NETs in Cancer. Trends in Cancer. 2 (11), 633-634 (2016).
- Ginley, B. G., et al. Computational detection and quantification of human and mouse neutrophil extracellular traps in flow cytometry and confocal microscopy. Scientific Reports. 7 (1), 17755 (2017).
