Summary

Automatisierte bildbasierte Quantifizierung von neutrophilen extrazellulären Fallen mit NETQUANT

Published: November 27, 2019
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Summary

Hier stellen wir ein Protokoll zur Erzeugung von neutrophilen extrazellulären Fallen (NETs) und zum Betrieb von NETQUANT vor, einer vollautomatischen Softwareoption zur Quantifizierung von NETs in Immunfluoreszenzbildern.

Abstract

Neutrophile extrazelluläre Fallen (NETs) sind webartige antimikrobielle Strukturen, die aus DNA und Granulat abgeleiteten antimikrobiellen Proteinen bestehen. Immunfluoreszenzmikroskopie und bildbasierte Quantifizierungsmethoden bleiben wichtige Werkzeuge zur Quantifizierung der neutrophilen extrazellulären Trapbildung. Es gibt jedoch wesentliche Einschränkungen für die immunfluoreszenzbasierten Methoden, die derzeit für die Quantifizierung von NTs verfügbar sind. Manuelle Methoden der bildbasierten NET-Quantifizierung sind oft subjektiv, fehleranfällig und für Benutzer, insbesondere unerfahrene Benutzer, mühsam. Auch die derzeit verfügbaren Softwareoptionen zur Quantifizierung sind entweder halbautomatisch oder erfordern eine Schulung vor dem Betrieb. Hier zeigen wir die Implementierung einer automatisierten Immunfluoreszenz-basierten Bildquantifizierungsmethode zur Bewertung der NET-Bildung namens NETQUANT. Die Software ist einfach zu bedienen und verfügt über eine benutzerfreundliche grafische Benutzeroberfläche (GUI). Er berücksichtigt biologisch relevante Parameter wie eine Erhöhung der Oberfläche und das DNA:NET-Markerproteinverhältnis und die kerntechnische Verformung, um die NETZbildung zu definieren. Darüber hinaus ist dieses Tool als frei verfügbare App aufgebaut und ermöglicht eine Quantifizierung und Analyse der Einzelzellenauflösung.

Introduction

Neutrophile sind entscheidende Vermittler von angeborenen Wirtsabwehrreaktionen gegen eine Vielzahl von mikrobiellen Erregern1. Sie führen ihre antimikrobiellen Funktionen aus, indem sie ihr Granulat freisetzen, das eine breite Palette von antimikrobiellen Proteinen2enthält, reaktive Sauerstoffspezies (ROS) und Hypochlorit1produziert und durch Phagozytose3. Darüber hinaus Brinkmann et al. 4 beschrieb neutrophile extrazelluläre Fallen (NETs) als einen neuartigen Mechanismus, durch den Neutrophile eindringende Krankheitserreger fangen und beseitigen. Seit ihrer Entdeckung vor etwas mehr als einem Jahrzehnt4,NETs wurden in einer Vielzahl von infektiösen5,6 und nicht-infektiösen7 Morbiditäten verwickelt. DIE NET-Bildung ist ein aktiver Prozess und führt zur Extrusion von Chromatin-DNA, die mit granulabgeleiteten antimikrobiellen Proteinen8beschichtet ist. Einige der wichtigsten Veränderungen in der zellulären und nuklearen Morphologie im Zusammenhang mit der NET-Bildung sind der Verlust der nuklearen Morphologie, Chromatin-Dekondensation, Mobilisierung von Granulatproteinen vom Zytoplasma zum Zellkern und eine Erhöhung des kern- und zellulären Durchmessers8,9.

Die webartigen NETs, die als diffuse Strukturen erscheinen können, die etwas größer als die Zelle sind, oder als Strukturen, die um ein Vielfaches größer sind als ein einzelnes Neutrophiler, werden als Indikatoren für NETosis5,10betrachtet. Mittels Fluoreszenzmikroskopie können NETs durch Diesprossen mit einer fluoreszierenden Sonde wie 4′,6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) und durch Immunfluoreszenzfärbung gegen NET-gebundene Proteine wie neutrophile Elastase nachgewiesen werden. Die Quantifizierung überlappender Gebeikbereiche für DNA und NET-gebundene Proteine bestimmt die Gesamtfläche unter NETs in einem Bild11.

Für die Fluoreszenzbild-basierte Quantifizierung von NETs11,12stehen eine Reihe von Bildanalyseoptionen zur Verfügung. Diese Softwareoptionen stellen jedoch Einschränkungen dar, da sie nicht benutzerfreundlich und/oder vollautomatisiert sind. In diesem Artikel zeigen wir den Betrieb von NETQUANT13, einer frei verfügbaren App, die unvoreingenommene vollautomatische Immunfluoreszenzmikroskopie bildbasierte NET-Quantifizierung durchführen kann. Die App verfügt über eine benutzerfreundliche grafische Oberfläche (GUI) und kann eine Einzelzellenanalyse durchführen. Die Software quantifiziert NETosis in einem Bild, indem sie die morphologischen Veränderungen im Bereich des DNA-NET-gebundenen Markers, der Chromatindekondensation im Zusammenhang mit der Verformung des Kerns und der Erhöhung des DNA:NET-gebundenen Proteinverhältnisses erkennt. Zusammengenommen ermöglichen die kriterien für mehrere NET-Definitionen eine strenge NET-Quantifizierung über mehrere Datensätze hinweg in unvoreingenommener Weise.

Protocol

Die Ethikkommission der Universität Lund genehmigte die Entnahme von Venenblut von gesunden Freiwilligen gemäß der Erklärung von Helsinki (2013/728). Alle Freiwilligen erteilten ihre schriftliche Einwilligung in Kenntnis der Sachlage. 1. Isolierung von peripheren Blutneutrophilen mit Dichte-Gradientzentrifugation Sammeln Sie menschliches venöses Blut in Schläuchen, die Heparin enthalten, und lassen Sie die Röhren Raumtemperatur erreichen.Hinweis: Mindestens 16 ml Blut von …

Representative Results

5 x 105 Neutrophile/ml wurden auf Decklippen gesät, die in einer 12-Well-Platte platziert und entweder mit 20 nM PMA stimuliert oder 150 min unstimuliert blieben. Die Proben wurden dann mit Primärkaninchen anti-human etrophil Elastase Antikörper, sekundäre Ziege Anti-Kaninchen Fluorophor konjugierte Antikörper und DAPI – ein fluoreszierend gekennzeichneter Farbstoff, der DNA färbt gefärbt (Siehe Tabelle der Materialien für Details). Mindestens 5 Bilder …

Discussion

NET-Bildung ist eine relativ neue Ergänzung zu den verschiedenen neutrophilen Armamentarium4 und es gab eine spürbare Zunahme des Interesses, die Implikation von NETs in einer breiten Palette von Forschungsbereichen5,7,14,15zu studieren. Die Erfassung von Bildern mittels Immunfluoreszenzmikroskopie und anschließender bildbasierter Quantifizierung ist eine weit verbrei…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Finanziert wurde die Arbeit von der Crafoord Foundation (TM und PN), dem Schwedischen Regierungsforschungsstipendium (PN, TM), dem Schwedischen Forschungsrat (PN) und der Groschinsky Foundation (TM, PN).

Materials

BD Vacutainer Heparinised plastic tubes BD Biosciences 367885
Lymphoprep Axis-Shield 114547
RPMI-1640 with L-Glutamine Gibco 11835-030
50mL conical flasks Sarstedt 62.547.004
15mL conical flasks Sarstedt 62.554.002
12-well Tissue culture plates Falcon 10626491
#1 Coverslips 10mm Menzel Glaser CS10100
Glass slides Menzel Glaser 631-0098
Primary anti-human elastase DAKO DAKO rabbit 1373, contract immunization
Secondary fluorophore conjugated goat anti-rabbit Life technologies A-11072, A-11070
PROLONG-Gold Antifade reagent with DAPI Life technologies P36930 Mounting medium
Goat serum Sigma-Aldrich G9023
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) Sigma-Aldrich 79346
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787
Nikon Ti-E Epifluorescence microscope Nikon
CCD camera Andor Zyla
Plan Apochromat 20x, 40x objectives Nikon
Windows 10 Microsoft Operating system
macOS Sierra 10.12 Apple Operating system
MATLAB Mathworks

References

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Cite This Article
Mohanty, T., Nordenfelt, P. Automated Image-Based Quantification of Neutrophil Extracellular Traps Using NETQUANT. J. Vis. Exp. (153), e58528, doi:10.3791/58528 (2019).

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