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Immunology and Infection

Quantification automatisée basée sur l'image des pièges extracellulaires neutrophiles à l'aide de NETQUANT

doi: 10.3791/58528 Published: November 27, 2019

Summary

Ici, nous présentons un protocole pour générer des pièges extracellulaires neutrophiles (NET) et l'exploitation de NETQUANT, une option logicielle entièrement automatique pour la quantification des NET dans les images d'immunofluorescence.

Abstract

Les pièges extracellulaires de Neutrophile (NET) sont des structures antimicrobiennes web-like se composant de l'ADN et des protéines antimicrobiennes dérivées de granule. La microscopie d'immunofluorescence et les méthodes de quantification basées sur l'image demeurent des outils importants pour quantifier la formation de pièges extracellulaires neutrophiles. Cependant, il y a des limites clés aux méthodes basées sur l'immunofluorescence qui sont actuellement disponibles pour quantifier les ENI. Les méthodes manuelles de quantification NET basée sur l'image sont souvent subjectives, sujettes à l'erreur et fastidieuses pour les utilisateurs, en particulier les utilisateurs non expérimentés. En outre, les options logicielles actuellement disponibles pour la quantification sont soit semi-automatiques ou nécessitent une formation avant l'opération. Ici, nous démontrons la mise en œuvre d'une méthode automatisée de quantification d'image basée sur l'immunofluorescence pour évaluer la formation net appelée NETQUANT. Le logiciel est facile à utiliser et dispose d'une interface utilisateur graphique conviviale (GUI). Il tient compte de paramètres biologiquement pertinents tels qu'une augmentation de la surface et du rapport protéine marqueur DNA:NET, et la déformation nucléaire pour définir la formation de l'EI. En outre, cet outil est conçu comme une application librement disponible, et permet de quantifier et d'analyser la résolution d'une seule cellule.

Introduction

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Les neutrophiles sont des médiateurs cruciaux des réponses innées de défense d'hôte contre une grande variété d'agents pathogènes microbiens1. Ils exécutent leurs fonctions antimicrobiennes en libérant leurs granules contenant un large éventail de protéines antimicrobiennes2, produisant des espèces réactives d'oxygène (ROS) et de l'hypochlorite1, et par phagocytose3. En outre, Brinkmann et coll. 4 ont décrit les pièges extracellulaires de neutrophile (NETs) comme mécanisme nouveau par lequel les neutrophiles piègent et éliminent les pathogènes envahissants. Depuis leur découverte il y a un peu plus d'une décennie4, les TN ont été impliqués dans une grande variété de morbidités infectieusesde 5,6 et non infectieuses7. La formation de NET est un processus actif et entraîne l'extrusion de l'ADN de chromatine enduit de protéines antimicrobiennes dérivées du granule8. Certains des changements clés dans la morphologie cellulaire et nucléaire associée à la formation net comprennent la perte de morphologie nucléaire, la décondensation de chromatine, la mobilisation des protéines granules du cytoplasme au noyau et une augmentation du diamètre nucléaire et cellulaire8,9.

Les NET sain, qui peuvent apparaître comme des structures diffuses légèrement plus grandes que la cellule ou comme des structures plusieurs fois plus grandes qu'un seul neutrophile sont considérées comme des indicateurs de NETosis5,10. À l'aide de la microscopie à fluorescence, les TNE peuvent être détectés en sondant l'ADN à l'aide d'une sonde fluorescente comme l'élastase de 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) et par la coloration immunofluorescence contre les protéines liées au NET comme l'élastase de neutrophile. La quantification des zones de coloration qui se chevauchent pour l'ADN et les protéines liées à l'EI détermine la superficie totale sous les EE dans une image11.

Un certain nombre d'options d'analyse d'image sont disponibles pour effectuer la quantification basée sur l'image de fluorescence des NETs11,12. Mais ces options logicielles présentent des limites en n'étant pas convivialet et/ou entièrement automatisé. Dans cet article, nous démontrons le fonctionnement de NETQUANT13, une application librement disponible qui peut effectuer une microscopie immunofluorescence entièrement automatisée impartiale sur l'image de la quantification NET. L'application dispose d'une interface graphique conviviale (GUI) et peut effectuer une analyse monocellulaire. Le logiciel quantifie neTosis dans une image en détectant les changements morphologiques dans le domaine du marqueur lié à l'ADN-NET, la décondensation de chromatine a associé la déformation du noyau et l'augmentation du rapport protéine LIÉ à l'ADN: NET. Pris ensemble, les multiples critères de définition NET permettent une quantification NET rigoureuse sur plusieurs ensembles de données de manière impartiale.

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Protocol

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Le comité d'éthique de l'Université de Lund a approuvé la collecte de sang veineux auprès de volontaires en bonne santé conformément à la Déclaration d'Helsinki (2013/728). Tous les bénévoles ont donné leur consentement éclairé écrit.

1. Isolement des neutrophiles périphériques de sang utilisant la centrifugation de densité-gradient

  1. Recueillir le sang veineux humain dans des tubes contenant de l'héparine et permettre aux tubes d'atteindre la température ambiante.
    Remarque : Un minimum de 16 ml de sang provenant d'un donneur en bonne santé est nécessaire pour produire une pastille cellulaire suffisamment grande.
  2. Mélanger le sang avec un volume de 2% de dextran dans saline (0,9% NaCl) et laisser les sédiments à température ambiante pendant 30 min dans un tube stérile de centrifugeuse conique de 50 ml.
  3. Aspirez le supernatant dans un tube de centrifugeuse conique stérile de 50 ml et une centrifugeuse à 200 x g pendant 10 min à 4 oC.
  4. À partir de cette étape, continuer l'isolement à 4 oC ou sur la glace.
  5. Resuspendre la pastille dans 5 ml de saline glacée et la couche au-dessus de 5 ml de gradient d'isolement des leucocytes (9,1 % de diatrizoat de sodium avec 5,7 % de dextran, w/v) dans un tube stérile de centrifugeulation conique de 15 mll.
  6. Centrifugeuse de 30 min à 400 x g à 4 oC.
  7. Aspirez le supernatant et jetez-le.
  8. Lyser les globules rouges en rependant les granulés dans 3 ml d'eau glacée pendant 30 s. Ajouter immédiatement 1 ml de 3,6 % de NaCl, puis remplir de 10 ml de salin glacé.
  9. Centrifugelant la suspension cellulaire pendant 10 min à 350 x g.
  10. Retirez le supernatant, collectez le granule cellulaire et suspendez-le en 1 ml de salin. Réserver 10 L dans un tube de microcentrifuge pour l'évaluation du nombre de cellules et de la viabilité à l'aide du bleu trypan dans une chambre de Bûrker.
  11. Ajouter 10 l de suspension cellulaire à 90 'L de 0,4% de solution bleu trypan. Prendre 10 ll de la suspension de la cellule dans une chambre de Bûrker. Comptez les cellules dans les 4 carrés liés par 3 lignes à chaque coin de la chambre. Les cellules qui semblent bleu foncé à l'utilisation de colorant ne sont pas viables, les excluent du nombre total de cellules.
  12. Exprimez le nombre de cellules en tant que cellules/mL tel que défini par l'équation ci-dessous.
    Equation
    Note : Ici, le facteur de chambre était de 10 000, le facteur de dilution était de 10 et le nombre total de carrés était de 4.
  13. Diluer la suspension de la cellule restante à 10 ml pour une dernière étape de lavage.
  14. Centrifugeuse de 5 min à 200 x g.
  15. Resuspendre les neutrophiles dans RPMI-1640 avec 2 mg/mL d'albumine de sérum humain inactivée par la chaleur (HSA) à une concentration de 5 x 105 cellules/mL.

2. Préparation des fiches de couverture et stimulation des neutrophiles

  1. Placez un bordereau (10 mm, #1) dans chaque puits d'une assiette de 12 puits et enrobez le bordereau en ajoutant 200 ll de la solution poly-L-lysine de 0,01 % et laissez-le à 37 oC pendant la nuit.
  2. Laver les feuilles de couverture avec une saline tampon de phosphate de 300 l (PBS) une fois et laisser sécher.
  3. Ajouter 400 oL de 5 x 105 neutrophiles/mL à chaque puits et incuber à température ambiante pendant 15 min.
  4. Déplacer la plaque contenant des neutrophiles vers un incubateur à 37 oC avec 5 % de CO2 pendant 15 min.
  5. Retirez le supernatant. Ajouter 400 ll de rpMI-1640 moyen préréchauffé avec 2 mg/mL HSA pour les contrôles. Ajouter 300 L de RPMI préréchauffé avec 20 nM phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA) pour la stimulation.
  6. Stimuler les neutrophiles pendant 150 min à 37 oC avec 5 % de CO2.

3. Visualisation des EI

  1. Retirer le supernatant et laver les échantillons 2x avec 200 L de PBS.
  2. Fixer les échantillons en ajoutant 200 oL de 4 % de paraformaldéhyde (PFA) en PBS pendant 20 min à 37 oC.
    Remarque : L'APF est toxique et doit être manipuléavec soin.
  3. Laver les échantillons 3x avec 200 l de PBS.
  4. Perméabilisez les échantillons en ajoutant 50 L de 0,5 % Triton X-100 pour 30 s.
  5. Laver les échantillons 3x avec 200 l de PBS.
  6. Bloquer les échantillons avec 5% de sérum de chèvre en PBS pendant 1 h à 37 oC.
  7. Ajouter 300 l d'élastase de neutrophile anti-humain primaire de lapin dans la solution de blocage à une dilution de 1:500 pendant 90 min à 37 oC.
  8. Laver les échantillons 3x avec 300 l l de PBS.
  9. Ajouter 300 l d'anticorps fluorescents anti-lapin de chèvre secondaire à une dilution de 1:1000 pendant 90 min à 37 oC.
  10. Laver les couvertures 3x avec 300 L de PBS.
  11. Retirez les couvertures des puits et montez la glissière de couverture avec un support de montage de 10 l contenant du DAPI. Conserver toute la nuit à température ambiante dans l'obscurité pour sécher les échantillons.
    Note: La coloration de l'ADN avec DAPI est certainement une étape critique dans la méthode. Les utilisateurs peuvent également dépanner en ajoutant une solution DAPI exogène à une plage de concentration finale de 0,1 'u20120.5 'g/mL pour 2'u20123 min, suivie de 3 étapes de lavage avec 300 'L PBS.
  12. Acquérir des images avec un microscope à fluorescence à large champ à l'aide d'un objectif 20X.

4. Analyse et quantification des NETÀ à l'aide de NETQUANT

Remarque : NETQUANT peut être téléchargé en cliquant sur le fichier d'installation trouvé sur les archives Zenodo Github ou sur le site Web du Nordenfelt Lab(https://nordlab.med.lu.se/?page_id=34).

  1. Importation de jeux de données pour l'analyse, la dénomination des canaux et la conversion d'images
    1. Ouvrez l'onglet Setup dans NETQUANT.
    2. Choisissez le dossier source pour l'analyse en cliquant sur l'option Get path dans le menu source et sélectionnez le dossier contenant les séquences d'images à analyser.
    3. Cliquez sur l'option Get Path dans le menu cible et sélectionnez le dossier pour enregistrer les données suivant l'analyse d'image.
    4. Nommez les canaux de sorte que le « canal d'ADN » correspond à la coloration de l'ADN(par exemple,ADN ou DAPI) et « NET-canal » représente la coloration de protéine LIÉE à NET(par exemple,NET, elastase de neutrophile) dans les images. Pour le bon fonctionnement du logiciel, (recommandé) nom du dossier contenant les fichiers d'image de contrôle comme «contrôle».
      Remarque : Le canal NET fait référence à la coloration du marqueur de protéine granule lié à NET seulement.
    5. Alimentez les métadonnées d'image dans le logiciel en cliquant sur le bouton d'information d'image de charge sur le sous-menu d'informations d'image.
    6. Sélectionnez l'ordre de canal correct contenu dans les images dans le sous-menu de l'ordre Channel. Cette option a été incluse comme un coffre-fort pour prévenir les inadéquations accidentelles.
    7. Acquérir des propriétés d'image primaire à partir des données brutes et convertir les images en cliquant sur le bouton De données Préparer. Les images converties apparaissent dans le sous-menu de type Exemple. Cliquez sur le menu type Exemple pour afficher et sélectionner tous les jeux de données acquis pour analyse.
    8. Sélectionnez une image du menu sous-modèle de type Exemple et cliquez sur le bouton de données d'image Display pour afficher les images divisées en ADN et net respectivement.
  2. Segmentation des cellules dans le canal de l'ADN et le canal NET
    1. Sélectionnez la méthode de segmentation en cliquant sur le sous-menu Méthode dans le canal DNA et le canal NET.
      Remarque : La méthode de segmentation par défaut est adaptée et constitue le paramètre recommandé. D'autres options sont également disponibles, y compris global, edge et Chan-Vese. Une option de bassin versant est également incluse pour aider à distinguer les cellules étroitement placées ou les NET.
    2. Entrez l'onglet Segmentation pour segmenter les cellules de contrôle d'abord dans les deux canaux en cliquant sur l'option Échantillons de contrôle segment.
    3. Sélectionnez PMA dans le sous-menu de type d'échantillon et cliquez sur l'option Batch (recommandé) pour commencer la segmentation de toutes les images incluses dans l'ensemble de données. Sélectionnez les images dans le menu de type échantillon et cliquez sur le bouton de données d'image Display pour visualiser et valider les masques d'image binaires (masque d'ADN et masque NET) générés post-segmentation.
  3. Analyse unicellulaire des propriétés identifiables
    1. Entrez l'onglet d'analyse et analysez les échantillons de contrôle en cliquant sur le bouton Déterminer le seuil.
    2. Changez le type d'échantillon en PMA et cliquez sur le bouton Obtenir les propriétés cellulaires pour compléter l'analyse des échantillons stimulés.
    3. Sélectionnez une image du sous-menu de type Exemple et cliquez sur le bouton de données d'image Display pour afficher la superpose et le nombre de cellules et de cellules de formation NET dans l'image.
  4. Comparaison des propriétés cellulaires pour identifier les cellules qui forment net
    1. Sélectionnez l'échantillon du sous-menu de type d'échantillon et cliquez sur le bouton Analyse NETs pour compléter l'analyse. Les images individuelles peuvent être sélectionnées à partir du sous-menu de type d'échantillon pour analyse ou l'ensemble du lot d'images peut être analysé en sélectionnant l'option de lot (recommandé).
    2. Ajuster manuellement les critères NET pour obtenir des résultats optimaux pour un échantillon donné. Comparez les ENE identifiés avec les images originales afin d'évaluer la qualité de l'identification.
      Remarque : Les critères NET peuvent ensuite être utilisés sur toutes les images de l'ensemble de données. Toute modification des critères NET est appliquée simultanément dans tous les échantillons témoins. Cela limite la possibilité de toute différence potentielle qui peut survenir en raison du sur-ajustement des paramètres NET. Les paramètres des critères NET peuvent être ajustés en fonction des exigences de l'utilisateur. La relation entre les taux de fausses découvertes et NETQUANT a été explorée précédemment13. Les plages typiques pour l'augmentation de la superficie sont de 2 u20124, la circularité à 0,7 u20120.9 et le ratio ADN/NET à 0,6-2,0.
    3. Inspectez le résumé des données dans le sous-menu de données cellulaires où le nombre d'images, le nombre de cellules par image et le pourcentage de NETs par image sont affichés.
      Remarque : Le pourcentage total d'EE dans l'ensemble des données est affiché par la « jauge NET ». Nombre total d'images, nombre de cellules, pourcentage d'EE dans l'échantillon (NET%) et les NET% de l'échantillon témoin sont affichés dans le tableau des statistiques sommaires sous la jauge NET. Nous recommandons que les données de contrôle soient communiquées parallèlement aux données obtenues à partir d'échantillons stimulés.
  5. Résultats Sorties
    1. Entrez l'onglet Sortie pour sélectionner et afficher les sorties de résultats.
    2. Explorez et comparez les différentes sorties de données générées par l'analyse du contrôle et de la PMA en sélectionnant la forme de la sortie et en cliquant sur le bouton Résultats de sortie.
      Remarque : Toutes les données générées après l'analyse pour les contrôles et les stimulations sont enregistrées dans le dossier d'analyse choisi dans le sous-menu cible. Les données sont enregistrées dans des formats .csv ou .pdf.
    3. Lancer le fichier Méthode pour obtenir la version du logiciel et des critères NET utilisés pour l'analyse (à inclure dans la section méthodes à des fins de publication).
    4. Cliquez sur le tableau des données Résultats pour visualiser les points de données individuels d'un échantillon donné.
    5. Visualisez la distribution de la zone NET et le rapport ADN:NET dans les échantillons. La ligne rouge indique la valeur seuil dans les graphiques.
    6. Déterminez la zone NET par rapport à la forme de l'ADN en cliquant sur le fichier de distribution Bivariate.
  6. Chargement de l'analyse précédente et de la production de toutes les étapes
    1. Chargez les paramètres d'analyse précédemment réussis dans NETQUANT à l'aide du bouton d'analyse précédente Charge.
    2. Utilisez le bouton Batch toutes les étapes inclus dans le menu de configuration pour exécuter les étapes 5-u201212 (Figure 1, Figure 2, Figure 3, Figure 4, Figure 5) directement pour obtenir la sortie finale.

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Representative Results

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5 x 105 neutrophiles/mL ont été ensepépins sur des feuilles de couverture placées dans une plaque de 12 puits et stimulées avec 20 nM PMA ou laissées non stimulées pendant 150 min. Les échantillons ont ensuite été tachés à l'aide d'anticorps primaires d'élastase de neutrophiles de lapin, d'anticorps conjugués secondaires de fluorophore anti-lapin de chèvre et d'anticorps conjugués d'API - un colorant fluorescent étiqueté qui tache l'ADN (voir le tableau des matériaux pour plus de détails). Un minimum de 5 images ont ensuite été acquises à l'aide d'un microscope à épifluorescence et d'un objectif de 20X (NA - 0,75). Les données d'échantillon utilisées pour l'analyse de test dans le manuscrit peuvent être téléchargées en suivant le lien https://nordlab.med.lu.se/?page_id=34 et en cliquant sur l'icône de l'échantillon de jeu de données.

Nous décrivons ici la capacité du flux de travail NETQUANT (figure 1) de quantifier la formation de NET dans un échantillon donné. L'outil logiciel peut être installé comme une application dans MATLAB et peut être utilisé sans aucune connaissance préalable de cette interface. L'interface graphique de NETQUANT a été utilisée pour analyser les ensembles de données décrits ci-dessus. Toutes les images utilisées pour l'analyse par NETQUANT sont toujours laissées inchangées dans l'annuaire parent. L'interface graphique est divisée en 4 onglets — onglet de configuration, onglet de segmentation, onglet d'analyse et onglet de sortie des résultats. Les échantillons ont été préparés pour analyse dans l'onglet de configuration (Figure 2). Les trajectoires de fichier (1), les conventions de nommage (2), les informations d'image (3) et les ordres de canal (4) sont définies par l'utilisateur. L'option de préparation des données (5) garantit que la conversion et l'organisation de manière normalisée tout au long de l'expérience. Les paramètres de segmentation étaient les paramètres fixés dans l'onglet de segmentation (figure 3) pour identifier les cellules individuelles dans les échantillons (6). Les échantillons témoins sont toujours segmentés en premier (7) avant la segmentation des échantillons stimulés (8). Toutes les valeurs recommandées pour la segmentation sont indiquées dans l'onglet logiciel. Les propriétés qui définissent les cellules témoins non stimulées sont d'abord acquises (9) puis comparées aux cellules stimulées par PMA (10) (Figure 4). Les NET sont ensuite analysés dans les échantillons en fonction des critères NET (11) et affichés avec le nombre total d'images, le nombre de cellules et les EA correspondants% dans les échantillons témoins. Les résultats finaux de l'analyse ont été sélectionnés puis visualisés (Figure 5). Une option pour le chargement et l'utilisation d'une analyse précédemment réussie, et une option de traitement par lots d'étapes 5-12 (Figure 1, Figure 2, Figure 3, Figure 4, Figure 5) ont également été incluses dans l'onglet configuration.

Au cours de l'analyse, un total de 2619 cellules ont été analysées dans l'expérience. Les neutrophiles stimulés par la PMA ont été en mesure de générer 90,59 % d'EA (NET%) contre 25,87 NET% dans les échantillons témoins (figure 6). L'analyse d'image a été effectuée dans les 10 minutes suivant l'lancement du flux de travail sur le logiciel. En résumé, NETQUANT offre une option rapide et pratique pour quantifier la formation de NET dans les images qui ont été acquises à l'aide de la microscopie d'immunofluorescence.

Figure 1
Figure 1 : Aperçu du flux de travail NETQUANT. Les micrographies fluorescentes de neutrophiles humains doublement tachés d'anti-élastase et de DAPI (ADN) sont d'abord traitées et converties. Les images sont ensuite segmentées, suivies d'une analyse des propriétés cellulaires, de la détection des EE et des sorties de résultats. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Options d'onglets de configuration dans NETQUANT. Les trajectoires de fichiers pour les jeux de données à analyser et les dossiers de sortie de données sont entrés dans l'onglet de configuration d'abord (1). Les conventions de nommage sont ensuite remplies pour définir les noms de canal et le nom du dossier de contrôle (2). Les informations d'image sont ensuite acquises (3) suivies par le nomdeur de l'ordre de canal correct (4). La configuration appropriée de tous les champs est recommandée avant le traitement des jeux de données (5) pour la conversion d'image standardisée. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : Paramètres de l'onglet de segmentation dans NETQUANT. Les paramètres utilisés pour la segmentation du canal d'ADN et du marqueur NET-protéine comprennent la méthode, la sensibilité, les itérations, la superficie minimale et le bassin versant (6). L'utilisation d'une méthode de segmentation adaptative et d'un bassin versant est recommandée. En outre, d'autres paramètres fournis comme préréglages dans le logiciel peuvent être utilisés sans modification pour la plupart des fins. Les échantillons témoins sont d'abord segmentés (7) puis les échantillons stimulés sont segmentés (8). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4 : Détection des EE dans l'onglet d'analyse. Les propriétés cellulaires définissant les cellules non stimulées sont analysées et acquises à partir d'échantillons témoins (9). Elle est suivie de l'analyse des propriétés cellulaires dans les échantillons expérimentaux (10). Les critères de définition de l'EI (augmentation de la surface cellulaire, déformation nucléaire (valeurs 0 à 1) et zone de coloration de l'ADN/zone de coloration du marqueur NET) sont appliqués aux échantillons témoins et stimulés pour définir la formation de l'EI (11). La quantité d'EE, le nombre total de cellules et le nombre d'images dans les deux échantillons sont affichés dans la section des statistiques sommaires. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5
Figure 5 : Visualisation des fichiers de sortie de résultats dans NETQUANT. Les résultats obtenus après l'analyse peuvent être sélectionnés par l'utilisateur individuel. Les sorties de résultats qui peuvent être générées avec NETQUANT comprennent un fichier .csv contenant des points de données provenant de cellules individuelles. En outre, des histogrammes représentant la distribution des cellules subissant une augmentation de la zone NET (cellulaire), la déformation du noyau due à la décondensation de chromatine et au rapport ADN:NET-marqueur, et un graphique 3D de la surface net par rapport à la déformation nucléaire sont également générés dans l'analyse. Toutes les sorties sont automatiquement enregistrées dans le dossier d'analyse choisi dans l'onglet configuration comme .csv, .pdf et .txt fichiers. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 6
Figure 6 : Analyse de la formation de l'EI. (A) Les NET, le nombre total de cellules et le nombre d'images de l'ensemble de données d'essai, tels qu'observés dans les statistiques sommaires pour les contrôles et les neutrophiles stimulés par les PMA (20 nM). (B) Comparaison côte à côte des histogrammes représentant l'augmentation de la zone, la déformation nucléaire (valeurs 0 à 1) et le ratio ADN/NET dans les échantillons témoins et stimulés par les PMA. La ligne rouge dans les valeurs de seuil d'histogrammes pour les critères net-définition. (C) Comparaison du graphique 3D de la surface net par rapport à la déformation nucléaire générée par l'analyse NETQUANT des échantillons de contrôle et stimulés par les PMA. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Discussion

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La formation de NET est un ajout relativement récent à l'armamentarium neutrophile diversifié4 et il y a eu un regain d'intérêt notable pour étudier l'implication des NET dans un large éventail de domaines de recherche5,7,14,15. L'acquisition d'images à l'aide de la microscopie immunofluorescence et de la quantification à base d'images subséquente est une méthode largement utilisée pour quantifier les ENi. Cette approche a l'avantage d'être capable de détecter les cellules formant des EI à un niveau unicellulaire et peut donc mieux réduire le signal d'arrière-plan. Les méthodes manuelles de quantification peuvent être exhaustives, lentes et sujettes à des biais de l'utilisateur. Quelques options semi-automatiques existent qui ont fourni aux utilisateurs une analyse fiable11,12. Cependant, ils peuvent exiger des compétences techniques importantes pour le fonctionnement ou peuvent exiger plusieurs étapes manuelles pour la quantification. C'est un défi en particulier pour les utilisateurs auparavant non expérimentés. Dans une publication récente, une méthode de calcul entièrement automatique a été utilisée pour quantifier la formation de NET à l'aide de l'imagerie à base de cytométrie du flux ainsi que des sections de tissus minces. Cependant, il ne peut être appliqué qu'à des scénarios spécifiques et nécessite également une connaissance significative de la programmation pour l'opération16. Actuellement, un logiciel de quantification d'image entièrement automatisé dédié à la quantification générale de net qui est facile à utiliser et possède une capacité de résolution unicellulaire n'est pas disponible pour les chercheurs.

Nous présentons ici NETQUANT, un logiciel de quantification NET entièrement automatisé qui est disponible gratuitement. Ce logiciel a été développé spécifiquement pour quantifier la formation net avec une forte rigueur à l'aide d'images de microscopie immunofluorescence, et avec la capacité d'effectuer l'analyse et la quantification d'une seule cellule. En plus de tenir compte de l'augmentation de la zone de coloration sous les NET, NETQUANT prend également en compte la déformation nucléaire due à la décondensation de la chromatine et une augmentation de la co-localisation des protéines DE l'ADN/MARQUEUR NET pour définir la formation de NET dans un échantillon donné. Cela permet de distinguer les cellules qui n'ont subi que la décongestion nucléaire à partir de cellules qui ont subi une formation complète NET. Les critères de définition NET inclus dans l'algorithme NETQUANT permettent une plus grande rigueur dans la quantification par rapport à de nombreuses approches de quantification antérieures qui reposent uniquement sur une augmentation de la zone de coloration NET.

L'interface graphique est destinée à être conviviale et simple à utiliser. Chaque étape de l'analyse est numérotée pour s'assurer que les utilisateurs peuvent suivre le flux de travail. L'une des principales caractéristiques fournies dans le logiciel est l'outil de segmentation / tab qui permet à NETQUANT d'effectuer une analyse unicellulaire en images, qui est la sensibilité la plus élevée possible qui peut être atteint. Cela fait de NETQUANT l'une des rares options disponibles qui peuvent effectuer une quantification unicellulaire pour quantifier la formation NET. En outre, Mohanty et coll. ont démontré que le logiciel peut également s'adapter aux variations d'image et aux paramètres d'acquisition13. En raison de la flexibilité offerte dans les critères de segmentation et de définition net, les variations des donneurs et des plaques peuvent être prises en compte. NETQUANT peut gérer de grands ensembles de données de manière adéquate et peut être utilisé pour une analyse d'image fiable à haut débit13.

Bien que nous ayons trouvé que le flux de travail donne des résultats robustes de plusieurs donateurs, nous recommandons que l'utilisateur décide des valeurs appropriées en fonction des échantillons individuels. En théorie, les données générées après l'analyse pourraient également être influencées par une forte densité cellulaire. En outre, l'agrégation excessive des NET peut entraîner la réduction du nombre de NET détectés. C'est parce que l'algorithme de segmentation ne peut pas distinguer les NET s'emmêlent en événements distincts. Un problème similaire avec la segmentation peut également survenir lorsque des neutrophiles non stimulés sont piégés dans les NET. L'utilisation d'images acquises à 20X et 40X est actuellement recommandée car les performances de NETQUANT n'ont pas été testées à d'autres niveaux de grossissement. Néanmoins, tant que la taille du pixel est réglée correctement (manuellement ou à partir de métadonnées dans la section d'informations d'image de charge), le logiciel doit adapter les calculs de zone avec précision aux grossissements plus ou moins élevés. La coloration appropriée de l'ADN et du marqueur de granule est un facteur critique. Une mauvaise coloration ou une mauvaise qualité d'image dans l'un ou l'autre canal se traduira par des résultats sous-optimaux. Par conséquent, il est recommandé que l'utilisateur détermine un numéro de cellule approprié, la procédure de coloration et le retentidage d'anticorps pour donner des résultats optimaux.

NETQUANT n'a été testé que sur des NET dérivés de neutrophiles humains in vitro. Les NET d'autres espèces peuvent également quantifié esquissés avec des corrections appropriées dans les critères. La quantification NET peut être effectuée sur des échantillons fixes dans des toboggans de chambre ou des plaques de fond en verre multi-puits. Les images de haute qualité d'échantillons tachés pour l'ADN et les marqueurs protéiques granulés sont essentielles. NETQUANT peut également être adapté pour quantifier d'autres formes de pièges extracellulaires (ET)-osis, par exemple,comme l'ont montré les éosinophiles. La quantification des ET dans les non-granulocytes tels que les monocytes n'est actuellement pas possible car la zone de coloration des granules cytoplasmiques est nécessaire pour l'algorithme de segmentation.

En conclusion, NETQUANT est un outil simple, automatique et rapide pour identifier avec précision la formation NET qui permet l'analyse et la quantification d'une seule cellule. Nous croyons que ce logiciel peut abaisser la barrière pour effectuer la quantification automatique net et que la communauté de recherche bénéficiera de cette application librement disponible.

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Disclosures

TM et PN ont un brevet en instance lié aux algorithmes utilisés dans NETQUANT.

Acknowledgments

Les travaux ont été financés par la Fondation Crafoord (TM et PN), la subvention du gouvernement suédois pour la recherche (PN, TM), le Conseil suédois de la recherche (PN) et la Fondation Groschinsky (TM, PN).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BD Vacutainer Heparinised plastic tubes BD Biosciences 367885
Lymphoprep Axis-Shield 114547
RPMI-1640 with L-Glutamine Gibco 11835-030
50mL conical flasks Sarstedt 62.547.004
15mL conical flasks Sarstedt 62.554.002
12-well Tissue culture plates Falcon 10626491
#1 Coverslips 10mm Menzel Glaser CS10100
Glass slides Menzel Glaser 631-0098
Primary anti-human elastase DAKO DAKO rabbit 1373, contract immunization
Secondary fluorophore conjugated goat anti-rabbit Life technologies A-11072, A-11070
PROLONG-Gold Antifade reagent with DAPI Life technologies P36930 Mounting medium
Goat serum Sigma-Aldrich G9023
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) Sigma-Aldrich 79346
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787
Nikon Ti-E Epifluorescence microscope Nikon
CCD camera Andor Zyla
Plan Apochromat 20x, 40x objectives Nikon
Windows 10 Microsoft Operating system
macOS Sierra 10.12 Apple Operating system
MATLAB Mathworks

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References

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Quantification automatisée basée sur l'image des pièges extracellulaires neutrophiles à l'aide de NETQUANT
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Mohanty, T., Nordenfelt, P. Automated Image-Based Quantification of Neutrophil Extracellular Traps Using NETQUANT. J. Vis. Exp. (153), e58528, doi:10.3791/58528 (2019).More

Mohanty, T., Nordenfelt, P. Automated Image-Based Quantification of Neutrophil Extracellular Traps Using NETQUANT. J. Vis. Exp. (153), e58528, doi:10.3791/58528 (2019).

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