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Immunology and Infection

Quantificazione automatizzata basata su immagini di trappole extracellulari neutrophil utilizzando NETQUANT

doi: 10.3791/58528 Published: November 27, 2019

Summary

Qui, presentiamo un protocollo per la generazione di trappole extracellulari neutrode (NETT) e il funzionamento di NETQUANT, un'opzione software completamente automatica per la quantificazione dei NET nelle immagini di immunofluorescenza.

Abstract

Le trappole extracellulari Neutrophil (NET) sono strutture antimicrobiche simili a reti formiche di proteine antimicrobiche derivate dal DNA e dal granulo. La microscopia dell'immunofluorescenza e i metodi di quantificazione basati sull'immagine rimangono strumenti importanti per quantificare la formazione di trape extracellulari di neutrofili. Tuttavia, esistono limitazioni chiave ai metodi basati sull'immunofluorescenza che sono attualmente disponibili per quantificare i NET. I metodi manuali di quantificazione NET basata su immagini sono spesso soggettivi, soggetti a errori e noiosi per gli utenti, in particolare gli utenti non esperti. Inoltre, le opzioni software attualmente disponibili per la quantificazione sono semi-automatiche o richiedono una formazione prima del funzionamento. Qui, dimostriamo l'implementazione di un metodo automatizzato di quantificazione delle immagini basato sull'immunofluorescenza per valutare la formazione della rete chiamata NETQUANT. Il software è facile da usare e ha un'interfaccia utente grafica (GUI) intuitiva. Considera parametri biologicamente rilevanti come un aumento della superficie e il rapporto di proteina del marcatore DNA:NET e la deformazione nucleare per definire la formazione della rete. Inoltre, questo strumento è costruito come un'applicazione liberamente disponibile, e consente la quantificazione e l'analisi di risoluzione singola.

Introduction

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Neutrophils sono mediatori cruciali delle risposte innate alla difesa dell'ospite contro un'ampia varietà di patogeni microbici1. Essi eseguono le loro funzioni antimicrobiche rilasciando i loro granuli contenenti una vasta gamma di proteine antimicrobiche2, producendo specie reattive dell'ossigeno (ROS) e ipocloriterite1, e attraverso la fagocitosi3. Inoltre, Brinkmann et al. 4 ha descritto le trappole extracellulari dei neutrofili (NET) come un nuovo meccanismo con il quale i neutrofili intrappolano ed eliminano gli agenti patogeni invasori. Dalla loro scoperta poco più di un decennio fa4, NETs sono stati implicati in una vasta gamma di infettive5,6 e non-infettivo7 morbilità. La formazione della rete è un processo attivo e si traduce nell'estrusione del DNA della cromatina rivestito con proteine antimicrobiche derivate dai granuli8. Alcuni dei cambiamenti chiave nella morfologia cellulare e nucleare associata alla formazione di NET includono la perdita di morfologia nucleare, decondensazione della cromatina, mobilitazione delle proteine granule dal citoplasma al nucleo e un aumento del diametro nucleare e cellulare8,9.

I NET simili al web, che possono apparire come strutture diffuse leggermente più grandi della cellula o come strutture diverse volte più grandi di un singolo neutrofilo sono considerati indicatori di NETosis5,10. Utilizzando la microscopia a fluorescenza, i NET possono essere rilevati sondando il DNA con una sonda fluorescente come la fenomenazione 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) e la colorazione dell'immunofluorescenza contro le proteine del limite di rete come l'elastasi neutrofila. La quantificazione delle aree sovrapposte di colorazione per il DNA e le proteine del NET determina l'area totale sotto i NET nell'immagine11.

Sono disponibili diverse opzioni di analisi delle immagini per eseguire la quantificazione basata sull'immagine a fluorescenza dei NET11,12. Ma queste opzioni software presentano limitazioni nel non essere user-friendly e/ o completamente automatizzato. In questo articolo viene illustrato il funzionamento di NETQUANT13, un'app liberamente disponibile in grado di eseguire una microscopia a microscopia completamente automatizzata non imparziale. L'applicazione ha un'interfaccia grafica intuitiva (GUI) e può eseguire l'analisi a cella singola. Il software quantifica NETosis in un'immagine rilevando i cambiamenti morfologici nell'area del marcatore legato al DNA-NET, la decondensazione della cromatina associata alla deformazione del nucleo e l'aumento del rapporto proteico DNA:NET. Nel loro insieme, i criteri di definizione NET multipli consentono una rigorosa quantificazione NET in diversi set di dati in modo imparziale.

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Protocol

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Il comitato etico dell'Università di Lund ha approvato la raccolta di sangue venoso da volontari sani in conformità con la Dichiarazione di Helsinki (2013/728). Tutti i volontari hanno fornito il loro consenso informato scritto.

1. Isolamento dei neutrofili del sangue periferico usando la centrifugazione densità-gradiente

  1. Raccogliere il sangue venoso umano in tubi contenenti eparina e consentire ai tubi di raggiungere la temperatura ambiente.
    Nota: È necessario un minimo di 16 mL di sangue da un donatore sano per produrre un pellet cellulare sufficientemente grande.
  2. Mescolare il sangue con un volume del 2% dextran in salina (0,9% NaCl) e lasciare sedimentare a temperatura ambiente per 30 min in un sterile tubo di centrifuga conical 50 mL.
  3. Aspirare il supernatante in uno sterile tubo di centrifuga zione conica da 50 mL e centrifugare a 200 x g per 10 min a 4 gradi centigradi.
  4. Da questo passo in poi continuare l'isolamento a 4 gradi centigradi o sul ghiaccio.
  5. Risospendere il pellet in 5 mL di ghiaccio freddo salina e strato superiore a 5 mL di gradiente di isolamento leucocito (9,1% diatrizoate di sodio con 5,7% dextran, w/v) in un tubo conico centrifuga sterile da 15 ml.
  6. Centrifuga per 30 min a 400 x g a 4 gradi centigradi.
  7. Aspirare il supernatante e scartarlo.
  8. Liscile globuli rossi risuspendendo il pellet in 3 mL di acqua ghiacciata per 30 s. Aggiungere immediatamente 1 mL di 3,6% NaCl e poi riempire con 10 mL di ghiaccio salina fredda.
  9. Centrifugare la sospensione cellulare per 10 min a 350 x g.
  10. Rimuovere il supernatante, raccogliere il pellet cellulare e respenderlo in 1 mL di salina. Mettere da parte 10 L in un tubo di microcentrifuga per la valutazione del numero di cellule e la vitalità utilizzando il blu trypan in una camera di Bérker.
  11. Aggiungere 10 litri di sospensione cellulare a 90 ,l dello 0,4% di soluzione blu trypan. Prendere 10 l della sospensione cellulare in una camera di B-rker. Contare le celle nei 4 quadrati delimitati da 3 linee in ogni angolo della camera. Le celle che appaiono blu scuro all'assorbimento del coloranti non sono vitali, escludile dal numero totale di celle.
  12. Esprimi il numero di cella come celle /mL come definito dall'equazione sottostante.
    Equation
    Nota: Qui il fattore camera era 10.000, il fattore di diluizione era 10 e il numero totale di quadrati era 4.
  13. Diluire la sospensione rimanente per le celle a 10 mL per una fase di lavaggio finale.
  14. Centrifuga per 5 min a 200 x g.
  15. Risospendere i neutrofili in RPMI-1640 con 2 mg/mL di albumina del siero umano inattivato dal calore (HSA) ad una concentrazione di 5 x 105 cellule/mL.

2. Preparazione di coverlips e stimolazione dei neutrofili

  1. Mettere un coperchio (10 mm, #1) in ogni pozzetto di una piastra da 12 pozzetti e ricoprire il coperchio aggiungendo 200 -L di 0,01% soluzione poli-lisina e lasciarlo a 37 gradi durante la notte.
  2. Lavare i coperchi con 300 tamponamenti (PBS) con 300 gradi (PBS) una volta e lasciare asciugare.
  3. Aggiungete 400 ll di 5 x 105 neutrofili/mL ad ogni pozzo e incubate a temperatura ambiente per 15 min.
  4. Spostare la piastra contenente neutrofili in un'incubatrice a 37 gradi centigradi con il 5% di CO2 per 15 min.
  5. Togliete il super-acletterante. Aggiungere 400 l di preriscaldato RPMI-1640 medio con 2 mg/mL HSA ai controlli. Aggiungere per la stimolazione 300 RPMI preriscaldati con 20 nM phorbol 12-myristate 13 acetati (PMA).
  6. Stimolare i neutrofili per 150 min a 37 gradi centigradi con 5% DI CO2.

3. Visualizzazione di NET

  1. Rimuovere il supernatante e lavare i campioni 2x con 200 gradi l di PBS.
  2. Fissare i campioni aggiungendo 200 - L del 4% di paraformaldeide (PFA) in PBS per 20 min a 37 gradi centigradi.
    Nota: l'PFA è tossico e deve essere maneggiato con cura.
  3. Lavare i campioni 3x con 200 luna di PBS.
  4. Permeabilizzare i campioni aggiungendo 50 -L di 0,5% Triton X-100 per 30 s.
  5. Lavare i campioni 3x con 200 L di PBS.
  6. Bloccare i campioni con il siero di capra del 5% in PBS per 1 h a 37 gradi centigradi.
  7. Aggiungere 300 l di coniglio primario anti-umano neutrofilo elastassi in soluzione di blocco ad una diluizione di 1:500 per 90 min a 37 .
  8. Lavare i campioni 3x con 300 - L di PBS.
  9. Aggiungere 300 l di anticorpo fluorescente di capra anti-coniglio secondario con una diluizione di 1:1000 per 90 min a 37 .
  10. Lavare i coperchi 3x con 300 gradi di PBS.
  11. Togliere i copricapi dai pozzi e montare il coperchio con un supporto di montaggio di 10 gradi contenente DAPI. Conservare per tutta la notte a temperatura ambiente al buio per asciugare i campioni.
    Nota: La colorazione del DNA con DAPI è certamente un passo critico nel metodo. Gli utenti possono anche risolvere i problemi con l'aggiunta di soluzione DAPI esogena ad un intervallo di concentrazione finale di 0,1 -u20120.5 g/mL per 2,u20123 min, seguito da 3 passaggi di lavaggio con 300 L PBS.
  12. Acquisire immagini con un microscopio a fluorescenza a campo largo utilizzando un obiettivo 20X.

4. Analisi e quantificazione dei NETT utilizzando NETQUANT

Nota: NETQUANT può essere scaricato facendo clic sul file di installazione presente nell'archivio Github o sul sito Web Nordenfelt Lab (https://nordlab.med.lu.se/?page_id=34).

  1. Importazione di set di dati per l'analisi, la denominazione dei canali e la conversione delle immagini
    1. Aprire la scheda Configurazione in NETQUANT.
    2. Scegliete la cartella di origine per l'analisi facendo clic sull'opzione Ottieni percorso nel menu di origine e selezionate la cartella contenente le sequenze di immagini da analizzare.
    3. Fare clic sull'opzione Ottieni percorso nel menu di destinazione e selezionare la cartella per il salvataggio dei dati dopo l'analisi dell'immagine.
    4. Assegnare un nome ai canali in modo che "Canale DNA" corrisponda alla colorazione del DNA(ad esempio,DNA o DAPI) e "NET-channel" ritragga la colorazione proteica associata alla rete(ad esempio,NET, elastasi neutrofili) nelle immagini. Per il funzionamento fluido del software, (consigliato) denominare la cartella contenente i file di immagine del controllo come "controllo".
      Nota: Il canale NET si riferisce solo alla colorazione del marcatore della proteina granulosa associata a NET.
    5. Inserire i metadati dell'immagine nel software facendo clic sul pulsante Carica informazioni immagine nel sottomenu Informazioni immagine.
    6. Selezionare l'ordine dei canali corretto contenuto nelle immagini nel sottomenu Ordine canali. Questa opzione è stata inclusa come fail-safe per evitare mancate corrispondenze accidentali.
    7. Acquisire le proprietà dell'immagine primaria dai dati non elaborati e convertire le immagini facendo clic sul pulsante Prepara dati. Le immagini convertite vengono visualizzate nel sottomenu Tipo di esempio. Fare clic sul menu Tipo di esempio per visualizzare e selezionare tutti i set di dati acquisiti per l'analisi.
    8. Selezionare un'immagine dal sottomenu Tipo di esempio e fare clic sul pulsante Visualizza dati immagine per visualizzare rispettivamente le immagini suddivise nel DNA e nel canale NET.
  2. Segmentazione delle cellule nel canale DNA e nel canale NET
    1. Selezionare il metodo di segmentazione facendo clic sul sottomenu Metodo sia nel canale DNA che nel canale NET.
      Nota: Il metodo di segmentazione di default è impostato adattivo ed è l'impostazione consigliata. Sono disponibili anche altre opzioni, tra cui globale, edge e Chan-Vese. Un'opzione spartiacque è inclusa anche per aiutare a distinguere tra celle strettamente posizionate o NET.
    2. Immettere la scheda Segmentazione per segmentare prima le celle di controllo in entrambi i canali facendo clic sull'opzione Campioni di controllo Segmento.
    3. Selezionare PMA dal sottomenu del tipo di esempio e fare clic sull'opzione Batch (scelta consigliata) per iniziare la segmentazione di tutte le immagini incluse nel set di dati. Selezionare le immagini nel menu del tipo di esempio e fare clic sul pulsante Visualizza dati immagine per visualizzare e convalidare le maschere di immagine binarie (maschera DNA e maschera NET) generate dopo la segmentazione.
  3. Analisi a cella singola delle proprietà identificabili
    1. Immettere la scheda di analisi e analizzare i campioni di controllo facendo clic sul pulsante Determina soglia.
    2. Modificare il tipo di campione in PMA e fare clic sul pulsante Ottieni proprietà cella per completare l'analisi dei campioni stimolati.
    3. Selezionare un'immagine dal sottomenu Tipo di esempio e fare clic sul pulsante Visualizza dati immagine per visualizzare la sovrapposizione e il numero di celle e LE celle di formazione NET nell'immagine.
  4. Confronto delle proprietà Cell per identificare le celle che formano NET
    1. Selezionare il campione dal sottomenu del tipo di esempio e fare clic sul pulsante Analizza NET per completare l'analisi. Le singole immagini possono essere selezionate dal sottomenu del tipo di esempio per l'analisi oppure l'intero batch di immagini può essere analizzato selezionando l'opzione batch (scelta consigliata).
    2. Modificare manualmente i criteri NET per ottenere risultati ottimali per un determinato campione. Confrontare i NET identificati con le immagini originali per valutare la qualità dell'identificazione.
      Nota: I criteri NET possono quindi essere utilizzati in tutte le immagini nel set di dati. Tutte le modifiche nei criteri NET vengono applicate contemporaneamente a tutti gli esempi di controllo. Ciò limita la possibilità di potenziali differenze che possono sorgere a causa di over-fitting dei parametri NET. Le impostazioni nei criteri NET possono essere regolate in base alle esigenze dell'utente. La relazione tra i tassi di individuazione falsi e NETQUANT è stata esplorata in precedenza13. Gli intervalli tipici per l'aumento dell'area sono 2-u20124, la circolarità è 0,7 -u20120.9 e il rapporto DNA/NET è 0,6–2,0.
    3. Esaminare il riepilogo dei dati nel sottomenu Dati cella in cui vengono visualizzati il numero di immagini, il numero di celle per immagine e la percentuale di NET per immagine.
      Nota: la percentuale totale di NET nell'intero set di dati viene visualizzata dal "NET-gauge". Il numero totale di immagini, il numero di celle, la percentuale di NET nel campione (NET) e NET% nell'esempio di controllo vengono visualizzati nella tabella delle statistiche di riepilogo sotto il NET-gauge. È consigliabile che i dati di controllo siano riportati insieme ai dati ottenuti da campioni stimolati.
  5. Uscite dei risultati
    1. Immettere la scheda Output per selezionare e visualizzare gli output dei risultati.
    2. Esplorare e confrontare i vari output di dati generati dall'analisi del controllo e PMA selezionando la forma dell'output e facendo clic sul pulsante Risultati output.
      Nota: tutti i dati generati dopo l'analisi per i controlli e le stimolazioni vengono salvati nella cartella di analisi scelta nel sottomenu di destinazione. I dati vengono salvati in formato .csv o .pdf.
    3. Avviare il file del metodo per ottenere la versione del software e i criteri NET utilizzati per l'analisi (da includere nella sezione dei metodi a scopo di pubblicazione).
    4. Fare clic sulla tabella dati Risultati per visualizzare i singoli punti dati in un determinato campione.
    5. Visualizzare la distribuzione dell'area NET e il rapporto DNA:NET nei campioni. La linea rossa indica il valore di soglia nei grafici.
    6. Determinare l'area NET rispetto alla forma del DNA facendo clic sul file di distribuzione Bivariate.
  6. Caricamento dell'analisi precedente e batch di tutti i passaggi
    1. Caricare le impostazioni di analisi riuscite in precedenza in NETQUANT utilizzando il pulsante Carica analisi precedente.
    2. Utilizzare il pulsante Batch di tutti i passaggi incluso nel menu di configurazione per eseguire i passaggi 5-u201212 (Figura 1, Figura 2, Figura 4, Figura 5) direttamente per ottenere l'output finale.

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Representative Results

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5 x 105 neutrofili/mL sono stati seminati su copricapi posizionati in una piastra di 12 pozze e stimolati con 20 nM di PMA o lasciati non stimolati per 150 min. I campioni sono stati poi macchiati utilizzando anticorpi contro il controcatena di controilofilo contro l'uomo del coniglio primario, anticorpi coniugati per i dettagli della tavola dei materiali anti-coniglio anti-coniglio e DAPI - un colorante fluorescente etichettato con DNA (vedi la tabella dei materiali per i dettagli). Un minimo di 5 immagini sono state poi acquisite utilizzando un microscopio a epifluorescenza e un obiettivo 20X (NA - 0,75). I dati di esempio utilizzati per l'analisi di test nel manoscritto possono essere scaricati seguendo il collegamento https://nordlab.med.lu.se/?page_id=34 e facendo clic sull'icona del set di dati di esempio.

In questo caso viene descritta la capacità del flusso di lavoro NETQUANT (Figura 1) di quantificare la formazione della rete in un determinato esempio. Lo strumento software può essere installato come app in MATLAB e può essere utilizzato senza alcuna conoscenza precedente di questa interfaccia. La GUI di NETQUANT è stata utilizzata per analizzare i set di dati come descritto in precedenza. Tutte le immagini utilizzate per l'analisi da NETQUANT vengono sempre lasciate invariate nella directory padre. La GUI è suddivisa in 4 schede: scheda impostazione, scheda segmentazione, scheda Analisi e scheda Output risultati. Gli esempi sono stati preparati per l'analisi nella scheda diimpostazione( Figura 2 ). I percorsi dei file (1), le convenzioni di denominazione (2), le informazioni sull'immagine (3) e gli ordini dei canali (4) sono definiti dall'utente. L'opzione prepara dati (5) garantisce che la conversione e l'organizzazione siano standardizzate durante l'esperimento. I parametri di segmentazione sono stati impostati nella scheda di segmentazione (Figura 3) per identificare le singole celle nei campioni (6). I campioni di controllo sono sempre segmentati per primi (7) prima della segmentazione dei campioni stimolati (8). Tutti i valori consigliati per la segmentazione sono indicati nella scheda del software. Le proprietà che definiscono le cellule di controllo non stimolate vengono prima acquisite (9) e quindi confrontate con le cellule stimolate da PMA (10) (Figura 4). I NET vengono quindi analizzati nei campioni in base ai criteri NET (11) e visualizzati con il numero totale di immagini, il numero di celle e i NET corrispondenti% nei campioni di controllo. Gli output dei dati finali dell'analisi sono stati selezionati e quindi visualizzati (Figura 5). Un'opzione per il caricamento e l'utilizzo di un'analisi riuscita in precedenza e un'opzione batch-all per elaborare i gruppi di passaggi 5-12 (Figura 1, Figura 2, Figura 3, Figura 5) sono stati inclusi nella scheda di installazione.

Durante l'analisi, nell'esperimento sono state analizzate in totale 2619 cellule. I neutrofili stimolati da PMA sono stati in grado di generare 90,59% NET (NET) a differenza del 25,87 NET% nei campioni di controllo (Figura 6). L'analisi dell'immagine è stata completata entro 10 min dall'avvio del flusso di lavoro sul software. In sintesi, NETQUANT offre un'opzione rapida e conveniente per quantificare la formazione della rete in immagini acquisite utilizzando la microscopia immunofluorescenza.

Figure 1
Figura 1: Panoramica del flusso di lavoro NETQUANT. Le micrografie fluorescenti di neutrofili umani a doppia macchia con anti-elastasi e DAPI (DNA) vengono prima elaborate e convertite. Le immagini vengono quindi segmentate, seguite dall'analisi delle proprietà delle cellule, dal rilevamento di NET e dagli output dei risultati. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: opzioni della scheda Installazione in NETQUANT. Percorsi di file per i set di dati da analizzare e le cartelle di output dei dati vengono immesse prima nella scheda di impostazione (1). Le convenzioni di denominazione vengono quindi compilate per definire i nomi dei canali e il nome della cartella di controllo (2). Le informazioni sull'immagine vengono quindi acquisite (3) seguite dal nome dell'ordine di canale corretto (4). L'impostazione corretta di tutti i campi è consigliata prima dell'elaborazione dei set di dati (5) per la conversione standardizzata delle immagini. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Parametri della scheda Segmentazione in NETQUANT. I parametri utilizzati per la segmentazione sia del canale del DNA che del marcatore net-protein includono metodo, sensibilità, iterazioni, area minima e spartiacque (6). Si raccomanda l'uso di un metodo di segmentazione adattivo e di uno spartiacque. Inoltre, altre impostazioni fornite come preset nel software possono essere utilizzate senza modifiche per la maggior parte degli scopi. I campioni di controllo vengono prima segmentati (7) e quindi i campioni stimolati (8). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Rilevamento di NET nella scheda di analisi. Le proprietà delle celle che definiscono le cellule non stimolate vengono analizzate e acquisite da campioni di controllo (9). Segue l'analisi delle proprietà delle cellule nei campioni sperimentali (10). I criteri di definizione della rete (aumento di piegatura nell'area cellulare, deformazione nucleare (valori da 0 a 1) e area di colorazione del DNA/area di colorazione del marcatore NET) vengono applicati sia al controllo che ai campioni stimolati per definire la formazione della rete (11). La quantità di NET, il numero totale di celle e il numero di immagini in entrambi i campioni vengono visualizzati nella sezione delle statistiche di riepilogo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: visualizzazione dei file di output dei risultati in NETQUANT. I risultati ottenuti dopo l'analisi possono essere selezionati dal singolo utente. Gli output dei risultati che possono essere generati con NETQUANT include un file CSV contenente punti dati di singole celle. Inoltre, gli istogrammi che raffigurano la distribuzione delle cellule in fase di aumento dell'area NET (cellulare), la deformazione del nucleo a causa della decondensazione della cromatina e il rapporto DNA:NET-marker, e un grafico 3D dell'area NET rispetto alla deformazione nucleare sono generati anche nell'analisi. Tutti gli output vengono salvati automaticamente nella cartella di analisi scelta nella scheda di configurazione come file .csv, .pdf e .txt. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Figura 6: Analisi della formazione della rete. (A) Il NET%, il numero totale di cellule e il numero di immagini dal set di dati di prova, come osservato nelle statistiche di riepilogo per i controlli e neutrofili stimolati da PMA (20 nM). (B) Un confronto side-by-side di istogrammi che raffigurano aumento nell'area, deformazione nucleare (valori da 0 a 1) e rapporto DNA/NET nei campioni di controllo e di campioni stimolati da PMA. La linea rossa nei valori di soglia degli istogrammi per i criteri di definizione della rete. (C) Confronto tra grafico 3D dell'area NET rispetto alla deformazione nucleare generata dall'analisi NETQUANT del controllo e dei campioni stimolati da PMA. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

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La formazione della rete è un'aggiunta relativamente recente all'armamentario neutrofilo variegato4 e c'è stato un notevole aumento di interesse per studiare l'implicazione di NET in una vasta gamma di aree di ricerca5,7,14,15. L'acquisizione di immagini mediante la microscopia immunofluorescenza e la successiva quantificazione basata sulle immagini è un metodo ampiamente utilizzato per quantificare i NET. Questo approccio ha il vantaggio di essere in grado di rilevare le cellule che formano NET a livello di singola cellula e può quindi ridurre meglio il segnale di fondo. I metodi manuali di quantificazione possono essere esaustivi, lenti e soggetti a pregiudizi dell'utente. Esistono alcune opzioni semiautomatiche che hanno fornito agli utenti un'analisi affidabile11,12. Tuttavia, potrebbero richiedere una notevole abilità tecnica per il funzionamento o potrebbero richiedere diversi passaggi manuali per la quantificazione. Questo è impegnativo soprattutto per gli utenti precedentemente non esperti. In una recente pubblicazione, è stato utilizzato un metodo computazionale completamente automatico per quantificare la formazione di rete utilizzando l'imaging basato sulla citometria di flusso e sezioni di tessuto sottile. Tuttavia, può essere applicato solo a scenari specifici e richiede anche una conoscenza significativa della programmazione per l'operazione16. Attualmente, il software di quantificazione delle immagini completamente automatizzato dedicato alla quantificazione generale della rete, facile da usare e dotato di capacità di risoluzione di una singola cellula, non è disponibile per i ricercatori.

Qui presentiamo NETQUANT, un software di quantificazione NET completamente automatizzato che è liberamente disponibile. Questo software è stato sviluppato specificamente per quantificare la formazione di rete con alta cordenza utilizzando immagini di microscopia immunofluorescenza e con la capacità di eseguire analisi e quantificazioni a cella singola. Oltre a considerare l'aumento dell'area di colorazione sotto i NET, NETQUANT prende in considerazione anche la deformazione nucleare dovuta alla decondensazione della cromatina e un aumento della co-localizzazione della proteina DNA/NET-marker per definire la formazione della rete in un dato campione. Ciò consente di distinguere le cellule che hanno subito solo una decondensazione nucleare da cellule che hanno subito una formazione NET completa. I criteri di definizione NET inclusi nell'algoritmo NETQUANT consentono una maggiore severità nella quantificazione rispetto a molti approcci di quantificazione precedenti che si basano esclusivamente su un aumento dell'area di colorazione NET.

La GUI ha lo scopo di essere user-friendly e semplice da usare. Ogni passaggio dell'analisi è numerato per garantire che gli utenti possano seguire il flusso di lavoro. Una delle caratteristiche principali fornite nel software è lo strumento di segmentazione/scheda che consente a NETQUANT di eseguire l'analisi a cella singola nelle immagini, che è la più alta sensibilità possibile che si possa ottenere. Questo rende NETQUANT una delle poche opzioni disponibili che possono eseguire la quantificazione a cella singola per quantificare la formazione di rete. Inoltre, Mohanty e altri hanno dimostrato che il software può anche adattarsi alle variazioni di immagine e ai parametri di acquisizione13. Grazie alla flessibilità offerta nei criteri di segmentazione e definizione NET, è possibile soddisfare le variazioni dei donatori e delle lamiere. NETQUANT è in grado di gestire set di dati di grandi dimensioni in modo adeguato e può essere utilizzato per l'analisi affidabile delle immagini ad alta velocità effettiva13.

Anche se abbiamo trovato il flusso di lavoro per produrre risultati affidabili da più donatori, si consiglia all'utente di decidere i valori appropriati in base ai singoli campioni. In teoria, i dati generati dopo l'analisi potrebbero anche essere influenzati dall'alta densità cellulare. Inoltre, un'eccessiva aggregazione di NET può comportare la riduzione del numero di NET rilevati. Ciò è dovuto al fatto che l'algoritmo di segmentazione non è in grado di distinguere i NET impigliati in eventi separati. Un problema simile con la segmentazione può sorgere anche quando i neutrofili non stimolati sono intrappolati all'interno dei NET. L'uso di immagini acquisite a 20X e 40X è attualmente raccomandato in quanto le prestazioni di NETQUANT non sono state testate ad altri livelli di ingrandimento. Tuttavia, finché le dimensioni in pixel sono impostate correttamente (manualmente o dai metadati nella sezione delle informazioni sull'immagine di caricamento), il software deve adattare i calcoli dell'area in modo accurato a ingrandimenti superiori o inferiori. Una corretta colorazione del DNA e del marcatore del granulo è un fattore critico. Una scarsa colorazione o scarsa qualità dell'immagine in entrambi i canali risulterà risultati non ottimali. Pertanto, si raccomanda che l'utente dovrebbe determinare un numero di cellulare adatto, procedura di colorazione e titer anticorpo per produrre risultati ottimali.

NETQUANT è stato testato solo su NETT derivati da neutrofili umani in vitro. I NET di altre specie possono anche quantificati con adeguate correzioni nei criteri. La quantificazione NET può essere eseguita su campioni fissi in vetrini da camera o lastre di fondo in vetro multi-bene. Le immagini di alta qualità di campioni macchiati per marcatori di PROTEINE di DNA e granulo sono fondamentali. NETQUANT può anche essere adattato per quantificare altre forme di trappole extracellulari (ET)-osi, ad esempio, come esposto dagli eosinofili. La quantificazione degli ET in non-granulociti come i monociti non è attualmente possibile in quanto l'area di colorazione dei granuli citoplasmici è necessaria per l'algoritmo di segmentazione.

In conclusione, NETQUANT è uno strumento semplice, automatico e rapido per identificare con precisione la formazione della rete che consente l'analisi e la quantificazione a cella singola. Crediamo che questo software possa abbassare la barriera per l'esecuzione della quantificazione automatica della rete e che la comunità di ricerca beneficerà di questa applicazione liberamente disponibile.

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Disclosures

TM e PN hanno un brevetto in sospeso relativo agli algoritmi utilizzati in NETQUANT.

Acknowledgments

Il lavoro è stato finanziato dalla Crafoord Foundation (TM e PN), dalla borsa svedese per la ricerca del governo (PN, TM), dal consiglio svedese per la ricerca (PN) e dalla Fondazione Groschinsky (TM, PN).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BD Vacutainer Heparinised plastic tubes BD Biosciences 367885
Lymphoprep Axis-Shield 114547
RPMI-1640 with L-Glutamine Gibco 11835-030
50mL conical flasks Sarstedt 62.547.004
15mL conical flasks Sarstedt 62.554.002
12-well Tissue culture plates Falcon 10626491
#1 Coverslips 10mm Menzel Glaser CS10100
Glass slides Menzel Glaser 631-0098
Primary anti-human elastase DAKO DAKO rabbit 1373, contract immunization
Secondary fluorophore conjugated goat anti-rabbit Life technologies A-11072, A-11070
PROLONG-Gold Antifade reagent with DAPI Life technologies P36930 Mounting medium
Goat serum Sigma-Aldrich G9023
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) Sigma-Aldrich 79346
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787
Nikon Ti-E Epifluorescence microscope Nikon
CCD camera Andor Zyla
Plan Apochromat 20x, 40x objectives Nikon
Windows 10 Microsoft Operating system
macOS Sierra 10.12 Apple Operating system
MATLAB Mathworks

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References

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Quantificazione automatizzata basata su immagini di trappole extracellulari neutrophil utilizzando NETQUANT
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Mohanty, T., Nordenfelt, P. Automated Image-Based Quantification of Neutrophil Extracellular Traps Using NETQUANT. J. Vis. Exp. (153), e58528, doi:10.3791/58528 (2019).More

Mohanty, T., Nordenfelt, P. Automated Image-Based Quantification of Neutrophil Extracellular Traps Using NETQUANT. J. Vis. Exp. (153), e58528, doi:10.3791/58528 (2019).

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