Summary
Apresentamos um procedimento para o cultivo de várias estirpes de Magnetospirillum magnetotacticum em dois tipos diferentes de meios de crescimento. Magnetospirillum magnetotacticum gryphiswaldense estirpe MSR-1 é cultivado em líquido e O gradiente de concentração de2 meios semi-sólidos enquanto cepa de M. magneticum AMB-1 e M. magnetotacticum cepa MS-1 são cultivadas em meio líquido.
Abstract
Bactérias de magnetotactic são Gram-negativas, motile, principalmente aquáticos procariontes onipresentes em habitats de água doce e marinhos. Eles são caracterizados pela sua capacidade de biomineralizar magnetossomas, que são magnéticos nanômetros de tamanho cristais de magnetita (Fe3O4) ou greigite (Fe3S4) rodeados por uma membrana de bicamada lipídica, dentro deles citoplasma. Para a maioria das bactérias de magnetotactic conhecido, magnetossomas são montadas em correntes dentro do citoplasma, desse modo, conferindo um momento de dipolo magnético permanente para as células e levando-os a alinhar passivamente com campos magnéticos externos. Devido a estas características específicas, bactérias de magnetotactic tem um grande potencial para aplicações comerciais e médicos. No entanto, a maioria das espécies são microaerófila e ter O2 concentração requisitos específicos, tornando-os mais difíceis de crescer, rotineiramente, do que muitas outras bactérias tais como Escherichia coli. Aqui nós apresentamos protocolos detalhados para o cultivo de três das estirpes de bactérias de magnetotactic, todas pertencentes ao gênero Magnetospirillum magnetotacticummais amplamente estudadas. Estes métodos permitem o controle preciso da concentração2 O disponibilizado para as bactérias, a fim de assegurar que eles crescem normalmente e sintetizam magnetossomas. Crescimento de bactérias de magnetotactic para estudos adicionais usando estes procedimentos não exige o experimentalista deve ser um especialista em microbiologia. Os métodos gerais apresentados neste artigo também podem ser usados para isolar e cultura a outras bactérias de magnetotactic, embora seja provável que a composição química de mídia de crescimento precisará ser modificado.
Introduction
Bactérias de magnetotactic (MTB) representam uma ampla gama de bactérias Gram-negativas procariontes onipresentes em habitats aquáticos de água doce e Marinha1. Estas bactérias compartilham a capacidade de produzir cristais magnéticos feitos de magnetita (Fe3O4) ou greigite (Fe3S4), que são na maioria dos casos, montados em cadeias dentro das células. Este motivo estrutural particular é devido à presença de várias proteínas específicas, atuando tanto no citoplasma das bactérias e na membrana lipídica que envolve cada cristal2. Cada cristal individual e suas vesículas de membrana circundante é chamado um magnetosome e está variando em tamanho de cerca de 30 a 50 nm no Magnetospirillum magnetotacticum espécie3. Por causa do arranjo de cadeia de magnetossomas, estas bactérias possuem um momento de dipolo magnético permanente que lhes faz alinhar passivamente aplicados externamente campos magnéticos. Portanto, estas bactérias nadam ativamente ao longo das linhas de campo magnético, atuando como microbússolas automotoras presumivelmente a mais efetivamente localizar as condições mais favoráveis (EG., concentração de O2 ) para o crescimento.
Uma propriedade interessante de MTB é sua capacidade de regular tanto a química e a cristalografia de seus cristais de magnetosome. Maioria das cepas produzem cristais relativamente alta pureza de magnetita ou greigite, embora alguns biomineralizar ambos minerais4. Em todos os casos, as bactérias são capazes de controlar com precisão o tamanho e a forma de seus cristais de único domínio magnético. Isto explica por que uma grande quantidade de pesquisa é realizada para desenvolver um melhor entendimento de como MTB executar esse processo de biomineralização. Compreender esse processo pode permitir que os pesquisadores costurar-fazer nanocristais magnéticos para muitas aplicações comerciais e médicas.
Um obstáculo substancial à extensa pesquisa sobre MTB tem sido a dificuldade de fazê-los crescer em laboratório. A maioria das espécies, incluindo as estirpes utilizadas neste trabalho, são anaeróbias microaerofílicas quando crescido com O2 como um aceitador terminal de electrões. Isto explica por que essas bactérias são mais frequentemente encontradas na zona de transição entre as condições oxic e anóxica (a interface oxic-anóxica, OAI). Isto mostra claramente que MTB têm requisitos de concentração precisos de2 de O que obviamente precisa ser levado em conta quando planear meios de crescimento para esses organismos. Além disso, a grande diversidade existente de MTB implica que vão precisar de diferentes estirpes diferentes tipos de gradientes químicos e nutrientes para alcançar o crescimento ideal.
Neste trabalho, descrevemos os métodos para o cultivo de três o mais extensamente estudada MTB: magneticum Magnetospirillum magnetotacticum (estirpe AMB-1), M. magnetotacticum (MS-1) e M. gryphiswaldense (MSR-1). Estas espécies filogeneticamente pertencem à classe do filo Proteobacteria Alphaproteobacteria , são helicoidais em morfologia e possuem um flagelo polar em cada extremidade da célula. Nós fornecemos os protocolos para o cultivo de estirpe MSR-1 em líquido e O gradiente de concentração semi-sólido mídia2 , com base em receitas médias publicados anteriormente5,6. Também apresentamos um protocolo detalhado para o cultivo de cepas AMB-1 e MS-1 em modificados magnético Spirillum crescimento médio (MGSM)7.
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Protocol
1. instalação da estação2 N
Nota: Escolha o diâmetro interno do tubo de modo que ele pode ser conectado ao tanque com vazamento mínimo e para que o cilindro de uma seringa de plástico de 1 mL se encaixa firmemente esta tubulação. Uma ilustração da completa N2 gaseamento estação é fornecida na Figura 1.
- Com segurança, instale um tanque de gasolina de2 N perto de um banco em que não há espaço suficiente para configurar a estação de2 N (um comprimento de aproximadamente 50 cm).
- Ligue para o tanque de um pedaço de tubo de tempo suficiente para chegar à área onde será construída a estação. Se for necessário, aplique fita Teflon na saída do tanque para evitar qualquer vazamento.
- Para construir uma estação capaz de subida cinco garrafas de meio ao mesmo tempo, corte quatro pedaços de tubos de aproximadamente 5 cm de comprimento.
- Monte os pedaços de tubos em linha com três três vias em forma de T encaixes plásticos. Conecte uma extremidade desta linha para o pedaço de tubo na saída do tanque através de um encaixe extra em forma de T2 N. Adicione um cotovelo de 90° encaixe na outra extremidade.
- Uso de fita para anexar a estrutura de uma haste de metal horizontal colocados cerca de 30 cm acima do banco.
- Conectar-se cinco peças de tubo (aproximadamente 20 cm de comprimento) para as saídas livre dos acessórios instalados na etapa 1.4.
- Remover os pistões de cinco seringas de plástico de 1,0 mL e corte a extremidade maior dessas seringas (i. e., o outro lado para a agulha), mantendo apenas a parte graduada. Preencha essas seringas com algodão, não demasiado firmemente.
- Inserir as seringas nas peças 20cm longo vertical da tubulação e use água e sabão para garantir que não há nenhum escapamento quando N2 está fluindo.
- Remova as tampas de cinco agulhas 25g (0,5 x 25 mm) e introduza os pedaços de 10 cm de tubo fino essas agulhas. Certifique-se de que as agulhas se encaixar firmemente o tubo.
Cuidado: Há um risco de esfaqueamento durante esta etapa. Fazê-lo devagar e com cuidado. - Anexe as agulhas preparadas no passo 1.9 para as seringas da estação2 N. Certifique-se de que N2 está a fluir através de todas as cinco linhas e manter a estação em stand-by.
2. crescimento médio preparação
Nota: É possível regular a quantidade de meio preparado, conforme explicado nos passos 2.1.2 e 2.2.2 2.3.8. A quantidade de água e produtos químicos usados apenas necessidades para ser ajustado proporcionalmente. O papel de todos os componentes de médio é descrito na tabela complementar 1.
- Preparação de meio de cultura líquido para MSR-1
- Prepare uma solução de citrato férrico de 10mm, acrescentando 0,245 g de citrato férrico para 100 mL de água destilada deionizada. Aqueça e mexa até para dissolver, até um amarelo ao laranja claro a solução é obtida. Autoclave a solução utilizando um padrão de ciclo (pelo menos 15 min de exposição a 121 ° C) e em seguida armazenar desta solução à temperatura ambiente no escuro.
Nota: Descarte a solução de citrato férrico quando um precipitado torna-se óbvio. - Em um béquer contendo 1 L de água destilada deionizada, adicionar o seguinte em ordem, agitando: 1,0 mL do mineral rastreamento suplemento solução, 0,1 g de KH2PO4, 0,15 g de MgSO4.7 H2O, 2,38 g de HEPES, 0,34 g de NaNO3 , extrato de 0,1 g de levedura, 3,0 g de peptona de feijão de soja, 4,35 mL de lactato de potássio (solução de 60% w/w) e 5 mL de 10 milímetros III solução de citrato.
Nota: Ajuste as quantidades proporcionalmente... se for necessária uma menor quantidade de meio de crescimento. Para uma estação de2 N capaz de subida cinco garrafas ao mesmo tempo, como aquele construído na etapa 1 do presente protocolo, prepare 300 mL de meio.
Cuidado: Rastrear mineral e estoque de citrato III soluções precisam ser mantidos estéril. Para evitar contaminação, usar técnica estéril padrão quando usá-los (flama aberta topos de garrafas usando um bico de Bunsen) e utilizar pontas de pipetas estéreis para distribuição. Armazenar a solução mineral no frigorífico a 4 ° C. - Após a adição de todos os produtos químicos, ajuste o pH a 7,0 com solução de NaOH 1 M. Dispense o meio preparado em frascos de soro de 125 mL. Despeje 60 mL do meio em cada garrafa.
- Bolha N2 entram no meio, por 30 min remover o dissolvido O2, usar o pequeno tubo ligado à estação de2 N, descrita na etapa 1. Coloque uma rolha de borracha butílica em cima de cada garrafa, deixando uma pequena abertura para permitir que o excesso de gás sair da garrafa.
Cuidado: Espuma pode formar enquanto borbulhando com N2. Ajuste o fluxo de gás de acordo para evitar a produção de espuma. - Friso selar cada garrafa com a rolha preparada e um selo de alumínio. O selo de alumínio garante que a garrafa permanecerá fechada durante o resto do protocolo.
- Desconectar as agulhas e o tubo fino da estação2 N e substituí-los por agulhas limpas (1 polegada, ≤ 23 G). Ajuste as válvulas do tanque2 N para que um fluxo suave e contínuo de gás sai do tanque (aproximadamente 50 mL/min).
Nota: Agulhas maiores que 23G podem deixar buracos unsealable permanentes no batoque. - Inserir uma das agulhas conectadas ao tanque N2 dentro de uma garrafa de médio porte, a rolha de borracha. Imediatamente, insira outra agulha limpa da mesma garrafa. Repita este passo para as outras garrafas e deixar fluir de2 N por cerca de 30 min substituir o ar nas garrafas por N2.
- Desconecte uma garrafa da estação2 N de retirar a agulha correspondente. Aguarde alguns segundos até que a pressão na garrafa do meio diminui a pressão atmosférica e remover a segunda agulha. Repita este passo para todos os frascos restantes.
Cuidado: Para evitar O2 digitando novamente as garrafas do meio de crescimento após a etapa 2.1.4, execute etapas 2.1.4 - 2.1.8 em rápida sucessão. Se todas as garrafas não podem ser conectadas à estação N2 ao mesmo tempo, prosseguir com passos 2.1.4-2.1.8 para o primeiro conjunto de garrafas e em seguida, repita essas etapas para as garrafas restantes. - Autoclave as garrafas. Deixe esfriar até a temperatura de quarto durante a noite e armazená-los em temperatura ambiente depois.
- Prepare uma solução de citrato férrico de 10mm, acrescentando 0,245 g de citrato férrico para 100 mL de água destilada deionizada. Aqueça e mexa até para dissolver, até um amarelo ao laranja claro a solução é obtida. Autoclave a solução utilizando um padrão de ciclo (pelo menos 15 min de exposição a 121 ° C) e em seguida armazenar desta solução à temperatura ambiente no escuro.
- Preparação de meio de cultura líquido para AMB-1 e MS-1
- Prepare uma solução quinate férrico de 10 mM. Primeiro dissolver 0,19 g de ácido quinic em 100 mL de água destilada deionizada e, em seguida, adicione a 0,27 g de FeCl3.6h2O. mexa para dissolver, até à obtenção de uma solução clara, vermelha escura. Autoclave a solução usando um ciclo padrão (pelo menos 15 min de exposição a 121 ° C).
Nota: Guarde a solução quinate férrico à temperatura ambiente no escuro como uma solução estéril. Descarte a solução quando um precipitado torna-se óbvio. - Em um béquer contendo 1 L de água destilada deionizada, adicionar o seguinte em ordem, agitando: 10,0 mL da solução de suplemento de vitamina, 5,0 mL da solução de rastreamento de suplemento mineral, 0,68 g de KH2PO4, 0,848 g de succinato de sódio dibásico hexa-hidratado, 0,575 g de tartarato dissódico di-hidratado, 0,083 g de trihidrato de acetato de sódio, 0,45 mL de 0.1% aquosa resazurina, 0,17 g de NaNO3, 0,04 g de ácido ascórbico e 3,0 mL de 10 milímetros quinate solução III.
Nota: Ajuste as quantidades proporcionalmente... se for necessária uma menor quantidade de meio de crescimento. Para uma estação de2 N capaz de subida cinco garrafas ao mesmo tempo, como aquele construído na etapa 1 do presente protocolo, prepare 300 mL de meio.
Cuidado: Vitamina, mineral de rastreamento e III quinate soluções estoque precisam ser mantidos estéril. Para evitar contaminação, use padrão técnica estéril e pontas de pipetas estéreis quando dispensar. Armazenar as soluções de vitamina e minerais em uma geladeira a 4 ° C. - Após a adição de todos os produtos químicos, ajuste o pH a 6,75 usando solução de NaOH 1 M.
- Consulte a 2.1.3-2.1.9 passos para o resto do protocolo.
- Prepare uma solução quinate férrico de 10 mM. Primeiro dissolver 0,19 g de ácido quinic em 100 mL de água destilada deionizada e, em seguida, adicione a 0,27 g de FeCl3.6h2O. mexa para dissolver, até à obtenção de uma solução clara, vermelha escura. Autoclave a solução usando um ciclo padrão (pelo menos 15 min de exposição a 121 ° C).
- Preparação de meio de cultura semi-sólido para MSR-1
- Prepare um 0,5 M tampão fosfato solução pH 7.0 dissolvendo 3,362 g de K2HPO4 e 4,178 g de KH2PO4 em 100 mL de água destilada deionizada. Verificar se o pH é de 7.0 e ajustar o pH ligeiramente com KH2PO4 ou NaOH se necessário. Armazene a solução num frasco de vidro selado (preferível plástico para evitar a troca de oxigênio).
- Prepare 100 mL de uma solução de clorídrico 0,02 M. Adicionar 0,2 g de FeCl2.4h2O a esta solução e agitar para dissolver a fim de obter uma solução de cloreto de ferro 10 mM. Armazene a solução no escuro em um frasco de vidro fechado.
- Prepare uma solução de bicarbonato de sódio de 0,8 M, dissolvendo 6,72 g de NaHCO3 em 100 mL de água destilada deionizada. Armazene a solução num frasco de vidro selado.
- Autoclave as soluções preparadas em passos 2.2.1 - 2.2.3 usando um ciclo padrão (pelo menos 15 min de exposição a 121 ° C). Armazená-los como estéril soluções estoque no escuro.
- Em um béquer contendo 1 L de água destilada deionizada, adicionar o seguinte em ordem, agitando: 5 mL da solução de rastreamento de suplemento mineral, 0,2 mL de solução aquosa resazurina de 1%, 0,4 g de NaCl, 0,3 g de NH4Cl, 0,1 g de MgSO4.7h2 O, 0,05 g de CaCl2.2h2O, 1G de succinato de sódio, 0,5 g de acetato de sódio, 0,2 g de levedura extrato e 1,6 g de ágar-ágar.
- Cubra o copo com folha de alumínio e autoclave a solução preparada no passo 2.3.5.
- Pouco antes do fim do ciclo da autoclave, preparar um fresco 4% L-cysteine· HCl· Solução de H2O dissolvendo-se 0,8 g de L-cysteine· HCl· H2O em 20 mL de água destilada deionizada. Neutralize a solução com pH 7,0 com solução de NaOH 5m.
Atenção: é importante que a solução de cisteína é preparada fresco para evitar a oxidação da cisteína. Armazenar a solução mineral no frigorífico a 4 ° C. - Após a autoclavagem, deixe arrefecer até 50-60 ° C, o médio e trazer o copo sob a chama de um bico de Bunsen. Retire o papel alumínio e adicionar rapidamente a seguir em ordem agitando suavemente: 0,5 mL da solução de vitamina, 2,8 mL da solução 3 mL da solução 1,8 mL da unidade populacional de estéril de bicarbonato de sódio, ferro estéril cloreto, fosfato estéril reserva solução e 10 mL de solução de cisteína filtro esterilizado.
Nota: Ajuste as quantidades proporcionalmente... se for necessária uma menor quantidade de meio de crescimento. É geralmente conveniente preparar um lote de 120 mL de meio.
Atenção: Todas as soluções devem permanecer estéril para uso futuro. Executar etapa 2.3.8 usando uma técnica asséptica padrão e pipeta estéril dicas quando dispensar. - Após a adição de todos os produtos químicos, transferi o meio quente para 16 mL tampa de rosca estéril Hungate tubos. Transferir 12 mL do meio em cada tubo e selar os tubos.
Cuidado: Para evitar contaminação, realize etapa 2.3.9 sob a chama de um bico de Bunsen. Realizá-lo antes que o ágar solidifies, enquanto o meio é a 40 ° C ou acima. - Deixe os tubos intacta por várias horas até que o ágar solidifies e o OAI torna-se aparente, materializando-se como uma rosa para incolor interface, aproximadamente de 1 a 3 cm abaixo da superfície do meio.
Nota: O médio deve girar lentamente incolor no tubo. A quantidade de tempo necessário para esta transição é variável e depende da quantidade de O2 inicialmente dissolvido no meio.
3. inoculação de MTB
Nota: As culturas de cepas AMB-1, MS-1 e MSR-1 podem ser obtidas comercialmente (Tabela de materiais).
Atenção: Execute todas as etapas a seguir em condições estéreis, sob a chama de um bico de Bunsen.
- Inoculação de estirpes MSR-1, AMB-1 e MS-1 em meio líquido
- Sele um frasco de soro vazio 125ml com uma rolha de borracha butílica e um selo de friso de alumínio. Insira duas agulhas na garrafa com a rolha e conecte uma seringa preparada como passo 1.7 para um deles. Conecte a seringa de um cilindro de O2 através do mesmo tipo de tubulação usada para a estação de2 N.
- Deixe fluir de2 O através da garrafa por cerca de 30 min, para garantir que todo o ar na garrafa é substituído pelo2. Retire as duas agulhas, permitindo uma ligeira sobrepressão na garrafa e em seguida autoclave. Permitir que a garrafa arrefecer à temperatura ambiente antes do uso.
Nota: Para poupar tempo, execute etapas 3.1.1 e 3.1.2 durante a preparação média e autoclave a garrafa junto com o meio ou as soluções estoque. - Esterilize os topos das rolhas de frasco médio fresco e a garrafa de2 O aplicando algumas gotas de solução de etanol 70% em cima deles e eles passando a chama de um bico de Bunsen.
- Usando uma seringa estéril e uma agulha, extrair a 1 mL de O2 da garrafa2 O e transferi-lo para o frasco médio fresco. Certifique-se que a agulha firmemente se encaixa na seringa durante esta etapa para evitar qualquer ar na seringa.
- Se usando o inóculo de outra cultura cultivada em um frasco de vidro, esterilize as tampas do frasco médio fresco e o frasco de cultura mais antigo, aplicando algumas gotas de solução de etanol 70% em cima deles e eles passando a chama de um bico de Bunsen. Se usando o inóculo de um tubo de cultura congelada, deixe aquecer a temperatura com o tubo selado sob a chama de um bico de Bunsen.
- Se usando o inóculo de outra cultura cultivada em um frasco de vidro, inocule 1 mL da cultura mais velha no meio de fresco. Se usando o inóculo de um estoque congelado, inocule apenas 0,1 mL para diluir o glicerol ou dimetil sulfóxido (DMSO) utilizado no processo de congelamento. Em ambos os casos, use uma agulha estéril e uma seringa estéril.
- Incubar a cultura a 32 ° C e -inocular em meio fresco depois de 4 a 7 dias.
- Inoculação do MSR-1 em meio semi-sólido gradiente de O2
- Verifique se o tubo de meio fresco exibe um OAI bem-definidos, materializado por uma rosa para incolor interface.
- Se o inóculo é proveniente de outra cultura semi-sólido2 O de gradiente de concentração, recolher as bactérias por pipetagem 50 μL da cultura com uma ponta de pipeta estéril colocada sobre a banda foi formada pelas bactérias. Inocule lentamente estas bactérias no OAI a fresco médio (interface rosa/incolor), evitando perturbar a interface. Se o inóculo é proveniente de uma cultura congelada, proceda da mesma forma com 100 µ l de inóculo em vez disso.
- Fechar o tubo e deixar que as bactérias crescem entre 25 ° C e 30 ° C. Transferência em meio fresco, usando o mesmo procedimento antes da banda de bactérias atinge a superfície do meio.
4. observação das bactérias
- Esterilize a rolha da garrafa cultura aplicando solução de etanol 70% em cima dela e passá-la através da chama de um bico de Bunsen. Para o meio semi-sólido, abra o tubo sob a chama de um bico de Bunsen. Use uma seringa estéril e uma agulha para extrair as bactérias.
- Uso o enforcamento drop método8 para garantir que as bactérias são magnéticos e motile.
Nota: Microscopia de contraste de fase dá grandes resultados, mas não é obrigatória. Ampliações que variam de 10 X a 60 X são adequadas. - Use a microscopia eletrônica de transmissão (TEM) para observar a estrutura celular e as magnetossomas no detalhe8.
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Representative Results
Preparação de sucesso da mídia crescimento pode ser avaliada como segue. No final do processo, desmarque soluções (i. e., livre de qualquer precipitado) deve ser obtida (isto é verdade para o meio líquido e o meio O2 gradiente semi-sólido). Uma foto mostrando o aspecto esperado de meio líquido MSR-1 antes de inoculação pode ser vista na Figura 2a. Sucesso O2 gradiente de concentração semi meio sólido é sinalizado pela formação de um OAI após algumas horas, indicada pela presença de 1 a 3 cm do meio-de-rosa na parte superior do tubo (Figura 3, tubo A). O resto do meio deve ser incolor. Um toda rosa médio antes de inoculação é um sinal de oxidação completa da resazurina e, portanto, de uma preparação malsucedida do O gradiente de concentração de2 .
Bem sucedido crescimento em meio líquido pode ser verificado cerca de 48 h após a inoculação (ou depois de alguns dias se o inóculo é proveniente de uma cultura congelada) simplesmente examinando as culturas para turbidez usando uma fonte de luz ou um espectrofotômetro. Crescimento bem sucedido é confirmado pela turbidez, provando que as bactérias realmente cresceram (Figura 2b). Se o meio permanece claro após 48 h, as bactérias não têm crescido. Para uma cultura média líquida crescer normalmente, a presença de bactérias, sintetizando magnetossomas pode ser verificada após 48 h, colocando o frasco de meio em uma placa de agitação magnética e iluminando-a com uma lanterna. A uma baixa velocidade de agita, o médio deve "brilhar", olhando alternadamente mais escuro e mais brilhante, dependendo da orientação do ímã de agitação em relação à posição do experimentalista. Para uma cultura de não-magnético, a intensidade de luz espalhado pelas células para o experimentalista permanecerá constante.
Crescimento bem sucedido em meio semi-sólido é indicado pela formação de uma banda microaerofílicas de bactérias na interface rosa/incolor. Devido ao consumo de O2 pelas bactérias e as alterações no gradiente O2 , a banda irá lentamente migrar para seguir o OAI (Figura 3, tubo B).
O enforcamento drop método permite que o observador para verificar que as bactérias são magnéticos e motile. Depois de alguns minutos, MTB deve concentrar-se na borda da gota enforcamento, provando que nadam ativamente ao longo das linhas de campo magnético (figura 4a). Para garantir que as células são magnéticas, inverter a orientação do íman sentado junto à gota. A bactéria deve começar a nadar em direção à borda oposta (figura 4b). Finalmente, a forma das magnetossomas pode ser verificada com o TEM. Cristais de Cuboctahedral de aproximadamente 30-45 nm de diâmetro deve ser observados9. Estes cristais normalmente são organizados em uma longa cadeia ou múltiplas cadeias mais curtas nas espécies aqui estudaram (Figura 5).
Figura 1 : Ilustração do N2 estação de gaseamento. (a) representação esquemática. (b) imagens da instalação do. Uma estação bem sucedida terá o comprimento necessário do tubo de grande e fino para que a extremidade do tubo fino descrito no passo 1.9 do protocolo permanece imersa no meio durante a etapa de propagação de gás. O fluxo de gás também deve ser ajustável em todos os momentos, para garantir a remoção de todo O2 e que o meio não derramar. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Frascos de meio líquido crescimento antes e após a inoculação. (a) clara MSR-1 médio antes da inoculação. (b) Turbid MSR-1 médio após 3 dias de crescimento bem sucedido. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Tubos do2 gradiente meio semi-sólido antes (tubo A) e 10 dias após a inoculação (tubo B). A banda de bactérias no tubo B é indicada por uma seta vermelha.
Figura 4 : Resultados típicos de uma gota de suspensão de experimentar a 20 X ampliação usando microscopia de contraste de fase. (um) MTB nadar em direção ao polo sul de um ímã e se acumulam na interface líquido/ar. (b) 1 min depois lançando o ímã, a maioria das células ter deixado o campo de visão.
Figura 5 : Observação TEM de uma célula de AMB-1. Magnetosome correntes são indicadas por setas vermelhas. Os dois flagelos são indicados por setas pretas.
Suplementares tabela 1. Clique aqui para baixar esta tabela.
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Discussion
Os requisitos específicos O2 concentração de MTB torná-los não-trivial para crescer no laboratório. Uma etapa chave do protocolo para o meio líquido é a remoção inicial de todos O2 do meio a fim de controlar a concentração final, adicionando um volume determinado de O2, só antes da inoculação. Tem sido demonstrado que MSR-1 cresce sob condições aeróbias quase totalmente, no entanto, o magnetismo das células é drasticamente reduzido. Os resultados do mesmo estudo mostraram que as estirpes AMB-1 e MS-1 não crescem sob condições totalmente aeróbias6. Para a cultura semi-sólido do MSR-1, todos O2 primeiro é reduzido a solução de cisteína e então aparece o O gradiente de concentração de2 , levando à formação da OAI. Se uma cultura não cresce bem ou não é magnética, a concentração de2 O deve ser a primeira coisa a verificar.
Meio de cultura semi-sólido é uma escolha interessante para isolar MTB desconhecido ou crescendo as espécies que são altamente sensíveis a ambos os gradientes de O2 e redox, que garante a existência de gradientes estáveis e permite que as bactérias para se posicionarem no o local oferece as melhores condições de crescimento. Meio líquido é mais conveniente trabalhar com quando volumes mais elevados são necessários (ex., para extração de DNA), ou quando uma análise mais profunda precisa ser realizada sobre as células (ex., magnetosome estudos) pois permite uma separação mais fácil das células da o meio de crescimento. O ágar-ágar em meio semi-sólido de fato pode interferir com a célula técnica de colheita.
Em algumas culturas, as células tornam-se às vezes non-motile, provavelmente devido a mutações espontâneas. Pilhas non-motile sobrevivem e crescem no meio de crescimento, desde que eles não precisam nadar para encontrar os nutrientes necessários para sua sobrevivência. A pista de corrida padrão método10 então pode ser usado para recuperar uma cultura motile desde células apenas motile podem nadar na pista de corrida. A perda do fenótipo magnético também pode acontecer na cultura, mesmo se a concentração de O2 é o ideal, novamente devido a mutações espontâneas11. A melhor solução neste caso é começar uma nova cultura por inocular congelado estoques das bactérias tipo selvagem em meio fresco. Como alternativa, a técnica de pista de corrida também pode permitir que a recuperação de uma cultura magnética.
É essencial para evitar a contaminação da cultura por outros organismos e, portanto, a maioria do protocolo deve ser realizada usando técnicas estéreis. Manipulação sob a chama de um bico de Bunsen geralmente dá resultados satisfatórios em manter condições assépticas. No entanto, se a cultura é cultivada em um ambiente sujeito a contaminação, adicionais devem ser tomadas precauções, como trabalhar em uma capa de fluxo laminar, ao preparar o meio e inocular as bactérias. Deve notar-se que o risco de contaminação é maior em meio semi-sólido, como os tubos devem estar abertos a cada vez que as células são removidas.
Estes protocolos permitem o crescimento de suficientes bactérias para executar muitos tipos diferentes de experiências, tais como estudos de físicas baseados em microscopia óptica12,13, microscopia eletrônica de varredura de imagem14,15, Raio-x, spectromicroscopy análises16, genômica e proteína estudos17,18. Se necessário, altas concentrações de bactérias em suspensão podem ser alcançadas por centrifugação. Além disso, magnetossomas podem ser extraídas e purificadas para mais aplicativos de celular pelotas ou suspensões da pilha denso obtidas por centrifugação de19.
Formulações de meios de crescimento geralmente são baseadas nos mesmos princípios que regem (veja complementar a tabela 1 para obter um resumo da lista do papel de cada componente na mídia crescimento descrito aqui). Uma fonte de carbono deve estar disponível para as bactérias, através de ácidos orgânicos (ex., succinato, tartarato, acetato, lactato) ou compostos inorgânicos, tais como bicarbonato. A escolha de uma fonte de carbono apropriado depende do metabolismo das bactérias. Nitrogênio presente no DNA e proteínas e fósforo (DNA, membranas) também são necessário e fornecidos pelo NaNO3, NH4Cl e KH2PO4 nas receitas aqui descritas. Um buffer (HEPES, tampão fosfato) é necessário para resistir a mudanças de pH. A solução do suplemento mineral de rastreamento contém cofactores por enzimas, e as vitaminas que podem ser usadas pelas bactérias como coenzimas ou como grupos funcionais para certas enzimas. Peptona de feijão fermento extrato e soja fornecem uma fonte de aminoácidos e sais utilizados para a produção de proteína. Desde MTB são redox sensível, um ou vários agentes redutores frequentemente deve ser adicionados ao meio (EG., cisteína, ácido ascórbico, lactato). Das principais fontes de ferro (ex., citrato férrico, cloreto férrico de quinate, ferro de engomar) é necessária a médio para biomineralização. Finalmente, uma pequena quantidade de O2 é necessária para as bactérias microaerofílicas como aceitador terminal de electrões. Uso MTB anaeróbico obriga outros compostos como o nitrato ou óxido nitroso em vez disso.
A principal limitação destes protocolos é que não há nenhuma garantia de que eles irão trabalhar para outras espécies de MTB. Cepas AMB-1, MS-1 e 1-MSR são MTB todos de água doce e, portanto, as receitas descritas neste artigo não podem ser usadas para crescer magnetospirilla marinho como estirpe Magnetospira thiophila MMS-1, Magnetospira tensão QH-2 ou outra Marinha MTB, que exigem altas concentrações de sal. No entanto, para o cultivo de outras estirpes de MTB e para o isolamento de novas cepas, os métodos gerais apresentados neste artigo para meios líquidos e semi-sólidos podem ser usados para preparar a mídia com receitas diferentes.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Agradecemos a ajuda com culturas MTB, Adam P. Hitchcock e Xiaohui Zhu pelo seu apoio ao estabelecimento das culturas MTB na McMaster University e Marcia Reid para formação e acesso ao centro de microscopia eletrônica (McMaster University, Richard B. Frankel Faculdade de Ciências da saúde). Este trabalho foi apoiado por ciências naturais e engenharia pesquisa Conselho de Canadá (NSERC) e nos National Science Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AMB-1 | American Type Culture Collection (ATCC) | ATCC 700264 | |
| MS-1 | ATCC | ATCC 31632 | |
| MSR-1 | Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) | DSM 6361 | |
| Ferric citrate | Sigma-Aldrich | F3388-250G | |
| Trace mineral supplement | ATCC | MD-TMS | |
| KH2PO4 | EMD | PX1565-1 | |
| MgSO4.7 H2O | EMD | MX0070-1 | |
| HEPES | BioShop Canada Inc | HEP001.250 | |
| NaNO3 | Sigma-Aldrich | S5506-250G | |
| Yeast extract | Fischer scientific | DF210929 | |
| Peptone | Fischer scientific | DF0436-17-5 | |
| Potassium L-lactate solution (60%) | Sigma-Aldrich | 60389-250ML-F | |
| D-(-)-Quinic acid | Sigma-Aldrich | 138622 | |
| FeCl3.6H2O | Fischer scientific | I88-100 | |
| Vitamin supplement | ATCC | MD-VS | |
| Sodium succinate hexahydrate | Fischer scientific | S413-500 | |
| Sodium L-tartrate dibasic dihydrate | Sigma-Aldrich | 228729-100G | |
| Sodium acetate trihydrate | EMD | SX0255-1 | |
| Resazurin | Difco | 0704-13 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544-25G | |
| K2HPO4 | Caledon | 6620-1-65 | |
| FeCl2 .4H2O | Sigma-Aldrich | 44939-250G | |
| Sodium bicarbonate | EMD | SX0320-1 | |
| NaCl | Caledon | 7560-1 | |
| NH4Cl | EMD | 1011450500 | |
| CaCl2.2 H2O | EMD | 1023820500 | |
| Agar A | Bio Basic Canada Inc | FB0010 | |
| L-cysteine.HCl.H2O | Sigma-Aldrich | C7880-100G | |
| 1.0 mL syringes | Fischer scientific | B309659 | |
| 25G x 1 needles | BD | 305125 | |
| 125 mL serum bottles | Wheaton | 223748 | |
| 20 mm aluminum seals | Wheaton | 224223-01 | |
| 20mm E-Z Crimper | Wheaton | W225303 | |
| Butyl-rubber stoppers | Bellco Glass, Inc. | 2048-11800 | |
| Hungate tubes | Chemglass (VWR) | CLS-4208-01 | |
| Septum stopper, 13mm, Hungate | Bellco Glass, Inc. | 2047-11600 | |
| Glass culture Tubes | Corning (VWR) | 9826-16X | |
| Hydrochloric acid 36.5-38%, BioReagent | Sigma-Aldrich | H1758-100ML | 11.6 - 12 N |
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