Summary
Vi presenterar ett förfarande för att odla flera stammar av Magnetospirillum i två olika typer av tillväxtmassmedia. Magnetospirillum gryphiswaldense stam MSR-1 odlas i både flytande och O2 koncentrationsgradient halvfasta media medan M. magneticum stam AMB-1 och M. magnetotacticum stam MS-1 odlas i flytande medium.
Abstract
Magnetotactic bakterier är gramnegativa, rörliga, främst vattenlevande prokaryoter som är allestädes närvarande i sötvatten och marina livsmiljöer. De kännetecknas av sin förmåga att biomineralize magnetosomes, som är magnetiska nanometer stora kristaller av magnetit (Fe3O4) eller greigite (Fe3S4) omgiven av en lipid lipidens membran, inom deras cytoplasman. För de flesta kända magnetotactic bakterier monteras magnetosomes i kedjor inuti cytoplasman, därmed ger en permanent magnetiskt dipolmoment till cellerna och orsakar dem att anpassa passivt med externa magnetfält. På grund av dessa särdrag har magnetotactic bakterier en stor potential för kommersiella och medicinska tillämpningar. Men de flesta arter är microaerofil och har specifika O2 koncentration krav, vilket gör dem svårare att växa rutinmässigt än många andra bakterier som Escherichia coli. Här presenterar vi detaljerade protokoll för växande tre av de mest studerade stammarna av magnetotactic bakterier, alla som tillhör släktet Magnetospirillum. Dessa metoder möjliggör exakt kontroll av O2 koncentrationen görs tillgängliga för bakterier, för att säkerställa att de växa normalt och syntetisera magnetosomes. Växande magnetotactic bakterier för ytterligare studier med hjälp av dessa förfaranden kräver inte experimentalist vara expert i mikrobiologi. De allmänna metoder som presenteras i den här artikeln kan också användas för att isolera och kultur andra magnetotactic bakterier, även om det är sannolikt att tillväxt medier kemiska sammansättning kommer att behöva ändras.
Introduction
Magnetotactic bakterier (MTB) representerar ett brett utbud av gramnegativ prokaryoter allestädes närvarande i sötvatten och Marina akvatiska livsmiljöer1. Dessa bakterier dela förmågan att producera magnetiska kristaller av antingen magnetit (Fe3O4) eller greigite (Fe3S4), som har de flesta fall monteras till kedjor inuti cellerna. Detta särskilda strukturella motiv beror på närvaron av flera specifika proteiner som agerar både i cytoplasman av bakterier och på lipid membranet som omger varje kristall2. Varje enskild kristall och dess omgivande membran vesikler kallas en magnetosome och är varierar i storlek från ca 30 till 50 nm i Magnetospirillum Art3. På grund av kedjan ordningen av magnetosomes besitter dessa bakterier en permanent magnetiskt dipolmoment som gör dem justera passivt med anbringas utanpå magnetfält. Därför, dessa bakterier aktivt simma längs magnetiska fältlinjer, agerar som självgående mikro-kompasser förmodligen till mer effektivt lokalisera de mest gynnsamma villkor (t.ex., O2 koncentration) för tillväxt.
En intressant egenskap av MTB är deras förmåga att reglera både kemi och kristallografi av deras magnetosome kristaller. De flesta stammar producerar relativt hög renhet kristaller av antingen magnetit eller greigite, även om vissa biomineralize båda mineraler4. Bakterierna är i alla fall kunna kontrollera exakt storleken och formen på deras enda magnetiska domän kristaller. Detta förklarar varför en stor mängd forskning är åtagit sig att utveckla en bättre förståelse av hur MTB utföra proceduren biomineralization. Förstå denna process kan ge forskarna att skräddarsy magnetiska nanokristaller för många kommersiella och medicinska tillämpningar.
Ett betydande hinder för omfattande forskning på MTB har varit svårigheten att odla dem i laboratoriet. De flesta arter, inklusive de stammar som används i detta arbete är frövivlar namnet när vuxit med O2 som en terminal Elektronacceptor. Detta förklarar varför dessa bakterier finns oftast vid övergångszonen mellan genotoxisk och anoxiska förhållanden (oxic-anoxiska gränssnittet, OAI). Detta visar tydligt att MTB har exakt O2 koncentration krav som uppenbarligen behöver beaktas när utforma Odlingsmedier för dessa organismer. Dessutom innebär MTB befintliga mångfald att olika stammar kommer att behöva olika typer av kemiska gradienter och näringsämnen för att uppnå optimal tillväxt.
I detta arbete, beskriver vi metoderna för odling av tre av de mest studerade MTB: Magnetospirillum magneticum (stam AMB-1), M. magnetotacticum (MS-1) och M. gryphiswaldense (MSR-1). Dessa arter fylogenetiskt tillhör klassen Alphaproteobacteria i den Proteobacteria stammen, är spiralformade i morfologi och besitter en polar flagellen i varje ände av cellen. Vi tillhandahåller protokollen för växande stam MSR-1 i både flytande och O2 koncentrationsgradient halvfasta media, baserat på tidigare publicerade medelstora recept5,6. Vi presenterar också ett detaljerat protokoll för växande stammar AMB-1 och MS-1 i modifierade magnetiska Spirillum tillväxt Medium (MGSM)7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. installation av N2 stationen
Obs: Välj den inre diametern på slangen så att den kan anslutas till bensintanken med minsta läckage och så att cylindern på en 1 mL spruta av plast passar tätt i denna slang. En illustration av komplett N2 gasning station ges i figur 1.
- Säkert installera en N2 gastank nära en bänk där det finns tillräckligt utrymme för att ställa in N2 stationen (en längd av ca 50 cm).
- Anslut till tank en bit slang tillräckligt länge för att nå området där stationen kommer att byggas. Om det behövs, applicera teflontejp på produktionen av tanken för att undvika läckage.
- För att bygga en station som är kapabel av bubblande fem flaskor av medium på samma gång, skär fyra bitar av slangar av ca 5 cm i längd.
- Montera bitar av slangen i en linje med tre trevägs T-formad plast beslag. Anslut ena änden av denna linje till bit av slangen vid utgången av N2 tanken genom en extra T-formade montering. Lägga till en Vinkelkoppling 90°, i andra änden.
- Använd tejp för att bifoga strukturen till en horisontell metallstav placeras ca 30 cm ovanför bänken.
- Anslut fem bitar av slangar (ca 20 cm i längd) gratis utgångarna för rördelar installerade i steg 1.4.
- Bort kolvarna från fem plast 1,0 mL-sprutorna och skär större slutet av dessa sprutor (dvs., den motsatta sidan på nålen), att hålla endast den graderade delen. Fyll dessa sprutor med bomull, inte för hårt.
- Infoga sprutorna i 20 cm långa vertikala bitar av slangar och Använd såpvatten för att säkerställa att det finns inget läckage när N2 flödar.
- Locken av fem 25 G injektionsnålar (0,5 x 25 mm) och infoga dessa nålar i 10 cm bitar av tunn slang. Säkerställa att nålar tätt passar i slangen.
Varning: Det finns en risk för stickande under detta steg. Gör det långsamt och försiktigt. - Fästa nålarna beredd steg 1,9 sprutorna N2 Station. Säkerställa att N2 flödar genom alla fem linjer och hålla stationen på stand-by.
2. tillväxt Medium förberedelse
Obs: Det är möjligt att justera mängden medium beredd, som förklaras i steg 2.1.2, 2.2.2 och 2.3.8. Mängden vatten och kemikalier används bara behov justeras proportionellt. Rollen som alla medelstora komponenter beskrivs i kompletterande Tabell1.
- Beredning av flytande odlingsmedium för MSR-1
- Bered en 10 mM ferric citrat genom att lägga till 0.245 g av järnklorid citrate 100 mL destillerat avjoniserat vatten. Värm och rör för att upplösa, tills en gul till orange klar lösning erhålls. Autoklav om lösningen med en standard cykel (minst 15 min exponering vid 121 ° C) och sedan lagra denna stamlösning i rumstemperatur i mörkret.
Obs: Kasta ferric citratlösningen när en fällning blir uppenbara. - I en bägare som innehåller 1 L destillerat avjoniserat vatten, Lägg till följande i ordning under omrörning: 1,0 mL av spårmineral komplettera lösning, 0,1 g KH2PO4, 0,15 g MgSO4.7 H2O, 2,38 g HEPES, 0,34 g NaNO3 , 0,1 g jäst extrakt, 3,0 g soja bönor pepton, 4,35 mL kalium laktat (60% w/w lösning) och 5 mL 10 mM Fe(III) citrat stamlösning.
Obs: Justera kvantiteterna proportionellt om behövs en mindre mängd av odlingsmedium. För en N2 station kan bubblande fem flaskor samtidigt, såsom det som byggdes i steg 1 i detta protokoll, förbereda 300 mL medium.
FÖRSIKTIGHET: Spåra mineral och Fe(III) citrat lager lösningar måste hållas steril. För att undvika kontaminering, Använd standard steril teknik när man använder dem (flame öppen toppar av flaskor med hjälp av en Bunsenbrännare) och sterila pipettspetsar för dispensering. Den mineraliska förvaras i kylskåp vid 4 ° C. - Efter tillägg av alla kemikalier, justera pH till 7,0 med 1 M NaOH-lösning. Fördela det nylagade mediet i 125 mL serum flaskor. Häll 60 mL medium i varje flaska.
- Bubbla N2 till medium för 30 min att ta bort den upplösta O2, med små slangen ansluten till N2 stationen beskrivs i steg 1. Placera en propp av butylgummi ovanpå varje flaska, lämnar en liten öppning för att tillåta den överflödig gas att avsluta flaskan.
FÖRSIKTIGHET: Skum kan bilda medan bubblande med N2. Justera gasflödet Undvik cellplast. - Crimp försegla varje flaska med förberedda proppen och en aluminium förslutning. Aluminium sigill säkerställer att flaskan är förseglad under resten av protokollet.
- Koppla bort nålarna och tunna slangen från N2 stationen och ersätta dem med rena nålar (1 tum, ≤ 23 G). Justera ventiler av N2 tanken så att en mild kontinuerligt flöde av gas matas ut tanken (ca 50 mL/min).
Notera: Nålar större än 23G kan lämna permanenta unsealable hål i proppen. - Infoga en av nålarna ansluten till N2 tank i en flaska av medium, genom gummiproppen. Sätt omedelbart en annan ren nål i samma flaska. Upprepa detta steg för andra flaskor och låt N2 flöde i ca 30 min att byta ut luften i flaskorna av N2.
- Koppla bort en flaska från N2 stationen genom att ta bort motsvarande nålen. Vänta några sekunder tills trycket i flaskan med medium minskar till atmosfärstryck och ta bort den andra nålen. Upprepa detta för alla kvarvarande flaskor.
FÖRSIKTIGHET: För att förhindra O2 återinträder flaskorna med odlingsmedium efter steg 2.1.4, utför steg 2.1.4 - 2.1.8 i snabb följd. Om alla flaskor inte kan anslutas till N2 station på samma gång, Fortsätt med steg 2.1.4-2.1.8 för den första uppsättningen av flaskor och sedan upprepa dessa steg för de återstående flaskorna. - Autoklav flaskorna. Låt dem coola ner till rumstemperatur över natten och förvara dem i rumstemperatur efteråt.
- Bered en 10 mM ferric citrat genom att lägga till 0.245 g av järnklorid citrate 100 mL destillerat avjoniserat vatten. Värm och rör för att upplösa, tills en gul till orange klar lösning erhålls. Autoklav om lösningen med en standard cykel (minst 15 min exponering vid 121 ° C) och sedan lagra denna stamlösning i rumstemperatur i mörkret.
- Beredning av flytande odlingsmedium för AMB-1 och MS-1
- Bered en 10 mM ferric quinate. Först Lös 0,19 g quinic syra i 100 mL destillerat avjoniserat vatten och sedan lägga till 0,27 g FeCl3.6H2O. uppståndelse att upplösa, tills en mörk röd, klar lösning erhålls. Autoklav om lösningen med en standard cykel (minst 15 min exponering vid 121 ° C).
Obs: Förvara den ferric quinate lösningen vid rumstemperatur i mörkret som en steril stamlösning. Kassera lösningen när en fällning blir uppenbara. - I en bägare som innehåller 1 L destillerat avjoniserat vatten, Lägg till följande i ordning under omrörning: 10,0 mL vitamin tillskott lösningen, 5,0 mL av trace mineraltillskott lösningen, 0,68 g KH2PO4, 0.848 g natrium succinat dibasiskt hexahydrat, 0.575 g di-natrium tartrat dihydrat, 0,083 g natriumacetattrihydrat, 0,45 mL av 0,1% aqueous Resazurin, 0,17 g NaNO3, 0,04 g askorbinsyra och 3,0 mL 10 mM Fe(III) quinate stamlösning.
Obs: Justera kvantiteterna proportionellt om behövs en mindre mängd av odlingsmedium. För en N2 station kan bubblande fem flaskor samtidigt, såsom det som byggdes i steg 1 i detta protokoll, förbereda 300 mL medium.
FÖRSIKTIGHET: Vitamin, spårmineral och Fe(III) quinate stamlösningar måste hållas steril. För att undvika kontaminering, Använd standard steril teknik och sterila pipettspetsar när dispensering. Förvaras de mineral och vitamin lösningarna i kylskåp vid 4 ° C. - Efter tillägg av alla kemikalier, justera pH till 6,75 med 1 M NaOH-lösning.
- Se steg 2.1.3-2.1.9 för resten av protokollet.
- Bered en 10 mM ferric quinate. Först Lös 0,19 g quinic syra i 100 mL destillerat avjoniserat vatten och sedan lägga till 0,27 g FeCl3.6H2O. uppståndelse att upplösa, tills en mörk röd, klar lösning erhålls. Autoklav om lösningen med en standard cykel (minst 15 min exponering vid 121 ° C).
- Beredning av halvfast odlingsmedium för MSR-1
- Förbereda en 0.5 M fosfatbuffert lösning, pH 7,0 genom upplösning 3.362 g K2HPO4 och 4,178 g KH2PO4 i 100 mL destillerat avjoniserat vatten. Kontrollera om pH är 7,0 och justera pH-värdet något med KH2PO4 eller NaOH om det behövs. Förvara lösningen i en tillsluten glasflaska (att föredra framför plast för att undvika syre utbyte).
- Bereda 100 mL 0,02 M saltsyra lösning. Tillsätt 0,2 g FeCl2.4h2O till denna lösning och rör för att upplösa för att få en 10 mM järn natriumkloridlösning. Förvara lösningen i mörker i en tillsluten glasflaska.
- Bered en 0,8 M natriumbikarbonat genom upplösning 6,72 g NaHCO3 i 100 mL destillerat avjoniserat vatten. Förvara lösningen i en tillsluten glasflaska.
- Autoklav lösningar beredda i steg 2.2.1 - 2.2.3 använda en standard cykel (minst 15 min exponering vid 121 ° C). Lagra dem så sterila stamlösningar i mörkret.
- I en bägare som innehåller 1 L destillerat avjoniserat vatten, Lägg till följande i ordning under omrörning: 5 mL av trace mineraltillskott lösningen, 0,2 mL 1% vattenlösning resazurin lösning, 0,4 g NaCl, 0,3 g NH4Cl, 0,1 g MgSO4.7H2 O, 0,05 g CaCl2.2H2O, 1 g av natrium succinat, 0,5 g natriumacetat, 0,2 g jäst extrakt och 1,6 g agar.
- Täck bägaren med aluminiumfolie och autoklavera en lösning beredd enligt steg 2.3.5.
- Strax före slutet av autoklaveringscykeln, förbereda en färsk 4% L-cysteine· HCl· H2O lösning genom att lösa upp 0,8 gram L-cysteine· HCl· H2O i 20 mL destillerat avjoniserat vatten. Neutralisera pH 7,0 lösningen med 5 M NaOH-lösning.
Varning: det är viktigt att cystein lösningen bereds färska att undvika oxidation av cystein. Den mineraliska förvaras i kylskåp vid 4 ° C. - Efter autoklavering, låt medelstora svalna ner till 50 – 60 ° C och få bägaren under lågan av en Bunsen-brännare. Ta bort aluminiumfolie och snabbt lägga till följande i ordning medan försiktigt under omrörning: 0,5 mL vitamin lösning, 2,8 mL sterilt lager fosfatbuffertlösning, 3 mL steril järn klorid stamlösning, 1,8 mL steril natriumbikarbonat beståndet lösning och 10 mL filter-steriliseras cystein lösning.
Obs: Justera kvantiteterna proportionellt om behövs en mindre mängd av odlingsmedium. Det är oftast praktiskt att förbereda ett parti av 120 mL medium.
Varning: Alla lösningar måste förbli steril för framtida bruk. Utför steg 2.3.8 använder standard steril teknik och steril pipett tips när dispensering. - Efter tillägg av alla kemikalier, överföra det varma mediet in 16 mL steril skruvkork Hungate rören. Över 12 mL medium till varje rör och försegla rören.
FÖRSIKTIGHET: För att undvika kontaminering, utför steg 2.3.9 under lågan av en Bunsen-brännare. Utföra det innan agar stelnar, medan mediet är vid 40 ° C eller högre. - Låt rören ostört i flera timmar tills agar stelnar och OAI blir uppenbart, materialisera som en rosa till färglös gränssnitt, cirka 1 till 3 cm under ytan av medium.
Obs: Medium bör Vrid långsamt färglös i röret. Mängden tid som behövs för denna övergång är variabel och beror på mängden O2 initialt upplöst i mediet.
3. inympning av MTB
Obs: Kulturerna av stammar AMB-1, MS-1 och MSR-1 kan erhållas kommersiellt (Tabell för material).
FÖRSIKTIGHET: Utför alla följande steg i sterila förhållanden, under lågan av en Bunsen-brännare.
- Inokulering av stammar MSR-1, AMB-1 och MS-1 i flytande medium
- Täta en tom 125 mL serum flaska med en butylgummipropp och en aluminium crimp sigill. Infoga två nålar i flaskan genom proppen och Anslut en spruta tillagad som steg 1,7 till en av dem. Anslut sprutan till en cylinder O2 genom samma typ av slang som används för N2 station.
- Låt O2 flöda igenom flaskan i ca 30 min, för att säkerställa att all luft i flaskan ersättas med O2. Ta bort båda nålar, möjliggör ett lätt övertryck i flaskan och sedan autoklav. Låt flaskan svalna till rumstemperatur före användning.
Obs: För att spara tid, utför steg 3.1.1 och 3.1.2 under medellång förberedelse och autoklav flaskan tillsammans med medium eller lager lösningarna. - Sterilisera toppar av proppar av både färska medium flaskan och flaskan O2 genom att tillämpa några droppar av 70% etanol lösning ovanpå dem och passerar dem genom lågan av en Bunsen-brännare.
- Med en steril spruta och nål, extrahera 1 O2 mL från flaskan O2 och överför det till färska medium flaskan. Kontrollera att nålen tätt passar på sprutan under detta steg att undvika någon luft i sprutan.
- Om du använder inokulatet från en annan kultur som odlas i en glasflaska, sterilisera proppar av både färska medium flaskan och flaskan med äldre kultur genom att tillämpa några droppar av 70% etanol lösning ovanpå dem och passerar dem genom lågan av en Bunsen-brännare. Om du använder inokulatet från ett provrör med frysta kultur, bara låta det varma upp till rumstemperatur med röret förseglas under lågan av en Bunsen-brännare.
- Om du använder inokulatet från en annan kultur som odlas i en glasflaska, Inokulera 1 mL av den äldsta kulturen i det färska mediet. Om du använder inoculate från en fryst lager, Inokulera bara 0,1 mL för att späda ut den glycerol eller dimetyl sulfoxid (DMSO) används i frysprocessen. I båda fallen Använd en steril nål och en steril spruta.
- Inkubera kulturen på 32 ° C och Inokulera det till färska medium efter 4 till 7 dagar.
- Inokulering av MSR-1 O2 gradient halvfasta medellång
- Kontrollera att röret av färskt medium visar en väl definierade OAI, förverkligades genom en rosa till färglösa gränssnitt.
- Om inokulatet kommer från en annan O2 koncentrationsgradient halvfasta kultur, skörda bakterierna genom pipettering 50 µL av kulturen med en steril pipettspetsen placeras på bandet bildas av bakterier. Långsamt Inokulera dessa bakterier på den OAI färskt medium (rosa/färglös interface), att inte störa gränssnittet. Om inokulatet kommer från en fryst kultur, fortsätt på samma sätt med 100 µL av inokulatet istället.
- Förslut röret och låt bakterierna växa mellan 25 ° C och 30 ° C. Överföring till färska medium med samma procedur innan bandet av bakterier når ytan av mediet.
4. observation av bakterier
- Sterilisera proppen på flaskan med kultur genom att tillämpa 70% etanol lösning ovanpå det och passerar det genom lågan av en Bunsen-brännare. För halvfasta mediet, öppna röret under lågan av en Bunsen-brännare. Använd en steril nål och en steril spruta för att extrahera bakterierna.
- Använd hängande droppe metod8 för att bakterierna ska både magnetiska och rörliga.
Obs: Fas kontrast mikroskopi ger fantastiska resultat men är inte obligatoriskt. Förstoringar alltifrån 10 X till 60 X är lämpliga. - Använd transmissionselektronmikroskopi (TEM) för att iaktta cellstruktur och magnetosomes i detalj8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Framgångsrik beredning av tillväxt medier kan bedömas enligt följande. I slutet av processen, klara lösningar (dvs. fri eventuell fällning) bör erhållas (Detta gäller för både flytande media och O2 gradient halvfasta mediet). En bild som visar den beräknade aspekten av MSR-1 flytande medium innan inympningen kan ses i figur 2a. En lyckad O2 koncentrationsgradient halvfasta mediet signaleras av bildandet av en OAI efter några timmar, indikeras av förekomst av 1 – 3 cm rosa medium på toppen av röret (figur 3, tube A). Resten av mediet bör vara färglös. Ett all-rosa medium innan inympning är ett tecken på fullständig oxidation av resazurin och därför av ett misslyckat beredande av O2 koncentrationsgradient.
Framgångsrik tillväxt i flytande medium kan kontrolleras ca 48 h efter inympningen (eller efter några dagar om inokulatet kommer från en fryst kultur) helt enkelt genom att undersöka kulturerna för grumlighet med hjälp av en ljuskälla eller en spektrofotometer. Framgångsrik tillväxt bekräftas av grumlighet bevisar att bakterier faktiskt växte (figur 2b). Om mediet är klart efter 48 h, har bakterierna inte vuxit. För ett flytande medium kultur växer normalt, kan närvaron av bakterier syntetisera magnetosomes kontrolleras efter 48 h genom att placera flaskan med medium på en magnetisk uppståndelse tallrik och genom lyser den med en ficklampa. På en låg omrörning hastighet, bör medium ”flash”, tittar omväxlande mörkare och ljusare beroende på orienteringen av omrörning magneten med avseende på positionen för experimentalist. För ett icke-magnetiskt kultur förblir intensiteten hos ljuset som sprids av cellerna mot experimentalist konstant.
Framgångsrik tillväxt i halvfasta mediet indikeras av bildandet av ett microaerofil band av bakterier på gränssnittet rosa/färglös. På grund av konsumtion av O2 av bakterierna och förändringar i O2 övertoningen, kommer bandet långsamt migrera för att följa OAI (figur 3, tube B).
Hängande droppe metod möjliggör observatören att kontrollera att bakterierna är både magnetiska och rörliga. Efter några minuter, MTB bör koncentrera sig på kanten av den hängande droppe, bevisar att de aktivt simma längs de magnetiska fältlinjerna (figur 4a). För att säkerställa att cellerna är magnetiska, vända orienteringen för magneten sitter bredvid rullgardinsmenyn. Bakterier bör börja simma mot den motsatta kanten (figur 4b). Slutligen kan formen på magnetosomes kontrolleras med TEM. Cuboctahedral kristaller av omkring 30 – 45 nm i diameter bör observeras9. Dessa kristaller är normalt ordnade i en lång kedja eller flera kortare kedjor i arter utstuderat här (figur 5).
Figur 1 : Illustration av N2 gasning station. (en) Schematisk bild. (b) bild av installationen. En framgångsrik station kommer att ha lämplig längd av stora och tunna slangar så att i slutet av den tunna slangar som beskrivs i steg 1,9 i protokollet förblir nedsänkt i mediet under gas bubblande steg. Flödet av gas bör också justerbar på alla tider, för att säkerställa att alla O2 tas bort och att mediet inte spiller. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Flaskor av flytande odlingsmedium före och efter inympningen. (en) tydlig MSR-1 medium innan inympning. (b), grumlig MSR-1 medium efter 3 dagar av framgångsrik tillväxt. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Rör av O2 lutning halvfasta mediet innan (röret A) och 10 dagar efter (tub B) inympning. Bandet av bakterier i röret B indikeras av en röd pil.
Figur 4 : Typiska resultat av en hängande droppe experimentera 20 X förstoring med hjälp av fas kontrast mikroskopi. (en) MTB simma mot den södra Polen av en magnet och ackumuleras på gränssnittet vätska/luft. (b) 1 min efter vändning magneten, de flesta celler har lämnat synfältet.
Figur 5 : TEM observation av en AMB-1 cell. Magnetosome kedjor anges med röda pilar. De två flageller indikeras av svarta pilar.
Kompletterande tabell 1. Vänligen klicka här för att hämta tabellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De särskilda O2 koncentration kraven i MTB gör dem icke-trivialt att växa i laboratoriet. Ett viktigt steg för protokollet för flytande medium är inledande avlägsnande av alla O2 från medlet för att styra slutliga koncentration genom att lägga till en bestämd volym av O2, strax före inympning. Det har visat att MSR-1 växer under nästan helt aeroba förhållanden, dock är magnetism av cellerna är drastiskt. Resultaten från samma studie visade att stammar AMB-1 och MS-1 inte växer under fullt aeroba förhållanden6. MSR-1 halvfasta kultur, alla O2 reduceras först med cystein lösningen och sedan O2 koncentrationsgradient visas, leder till bildandet av OAI. Om en kultur växer inte bra eller inte är magnetiska, bör O2 koncentrationen den första sak att kontrollera.
Halvfasta odlingsmedium är ett intressant val för isolera okänd MTB eller växer de arter som är mycket känsliga för båda O2 och redox övertoningar, eftersom det säkerställer förekomsten av stabila övertoningar och tillåter bakterierna att positionera sig på platsen erbjuder de bästa förutsättningarna för tillväxt. Flytande medium är mer praktiskt att arbeta med när högre volymer som behövs (t.ex., för DNA-extraktion), eller när ytterligare analys behöver utföras på cellerna (t.ex., magnetosome studier) eftersom det ger ett lättare separation av celler från odlingsmedium. Ägarn i halvfasta mediet kan faktiskt störa cellen skörd teknik.
I vissa kulturer bli cellerna ibland icke-motila, sannolikt på grund av spontana mutationer. Icke-motila celler överleva och växa i odlingsmedium eftersom de inte behöver simma för att hitta näringsämnen nödvändiga för deras överlevnad. Standard race-track metod10 kan sedan användas till återvinna en motila kultur eftersom endast motila celler kan simma ner race-spåret. Förlusten av den magnetiska fenotypen kan också ske i kultur även om O2 koncentrationen är optimal, igen på grund av spontana mutationer11. Den bästa lösningen är i det fallet att starta en ny kultur genom ympning fryst bestånd av vild typ bakterier i färsk medium. Banan tekniken kan alternativt också indrivning av en magnetisk kultur.
Det är viktigt att undvika kontaminering av kulturen av andra organismer och därför de flesta av protokollet skall utföras med steril teknik. Manipulera under lågan av en bunsenbrännare vanligtvis ger tillfredsställande resultat i att hålla aseptiska förhållanden. Dock om kulturen odlas i en förorening-benägen miljö, ytterligare försiktighetsåtgärder vidtas, som arbetar i en LAF när du förbereder medium och vaccinera bakterierna. Det bör noteras att risken för kontaminering är högre i halvfasta mediet som rören måste öppnas varje gång cellerna avlägsnas.
Dessa protokoll aktiverar tillväxten av tillräckligt bakterier att utföra många olika typer av experiment, såsom fysiska studier baserade på optisk mikroskopi12,13, elektronmikroskopi imaging14,15, Röntga spectromicroscopy analyser16, genomisk och protein studier17,18. Om det behövs kan högre koncentrationer av bakterier i suspension uppnås genom centrifugering. Dessutom kan magnetosomes extraheras och renas för ytterligare program från cell pellets eller tät cellsuspensioner erhålls genom centrifugering19.
Tillväxt medier formuleringar baseras vanligtvis på samma styrande principer (se kompletterande Tabell1 för en sammanfattning av listan av varje komponent i tillväxt medier roll beskrivs här). En kolkälla måste vara tillgänglig för bakterier, via organiska syror (t.ex., succinat, acetat, tartrat, laktat) eller oorganiska föreningar såsom bikarbonat. Valet av en lämplig kolkälla beror på metabolismen av bakterier. Kväve förekommer i DNA och proteiner och fosfor (DNA, membran) krävs också och tillhandahålls av NaNO3, NH4Cl och KH2PO4 i de recept som beskrivs här. En buffert (HEPES, fosfatbuffert) är nödvändigt att motstå pH-förändringar. Trace mineraltillskott lösningen innehåller kofaktorer för enzymer och vitaminer kan användas av bakterier som koenzymer eller funktionella grupper för vissa enzymer. Jäst extrakt och soy bean pepton ge en källa till aminosyror och salter som används för produktion av proteiner. Eftersom MTB redox känslig, en eller flera reduktionsmedel ofta måste läggas till medium (t.ex., cystein, askorbinsyra, laktat). En stor källa av järn (t.ex., järnklorid citrat, ferric quinate, järn-klorid) som behövs i mediet för biomineralization. Slutligen krävs en liten mängd O2 för microaerofil bakterier som terminal Elektronacceptor. Obligate anaerob MTB användning andra föreningar såsom nitrat eller lustgas istället.
Den huvudsakliga begränsningen av dessa protokoll är att det finns ingen garanti att de kommer att arbeta för andra arter av MTB. Stammar AMB-1, MS-1 och MSR-1 är allt sötvatten MTB och därför de recept som beskrivs i denna artikel kan inte användas för att växa Marina magnetospirilla som Magnetospira thiophila stam MMS-1, Magnetospira stam QH-2 eller andra marin MTB, som kräver högre salt koncentrationer. Dock för att växa andra stammar av MTB och för isolering av nya stammar, kan de allmänna metoder som presenteras i denna artikel för både flytande och halvfasta media användas för att förbereda media med olika recept.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Richard B. Frankel för hans hjälp med MTB kulturer, Adam P. Hitchcock Xiaohui Zhu för deras stöd medan inställningen upp MTB kulturer vid McMaster University och Marcia Reid för utbildning och tillträde till anläggningen elektronmikroskopi (McMaster University, Hälsouniversitetet). Detta arbete stöds av de naturliga vetenskaperna och Engineering Research rådet av Kanada (NSERC) och oss National Science Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AMB-1 | American Type Culture Collection (ATCC) | ATCC 700264 | |
| MS-1 | ATCC | ATCC 31632 | |
| MSR-1 | Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) | DSM 6361 | |
| Ferric citrate | Sigma-Aldrich | F3388-250G | |
| Trace mineral supplement | ATCC | MD-TMS | |
| KH2PO4 | EMD | PX1565-1 | |
| MgSO4.7 H2O | EMD | MX0070-1 | |
| HEPES | BioShop Canada Inc | HEP001.250 | |
| NaNO3 | Sigma-Aldrich | S5506-250G | |
| Yeast extract | Fischer scientific | DF210929 | |
| Peptone | Fischer scientific | DF0436-17-5 | |
| Potassium L-lactate solution (60%) | Sigma-Aldrich | 60389-250ML-F | |
| D-(-)-Quinic acid | Sigma-Aldrich | 138622 | |
| FeCl3.6H2O | Fischer scientific | I88-100 | |
| Vitamin supplement | ATCC | MD-VS | |
| Sodium succinate hexahydrate | Fischer scientific | S413-500 | |
| Sodium L-tartrate dibasic dihydrate | Sigma-Aldrich | 228729-100G | |
| Sodium acetate trihydrate | EMD | SX0255-1 | |
| Resazurin | Difco | 0704-13 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544-25G | |
| K2HPO4 | Caledon | 6620-1-65 | |
| FeCl2 .4H2O | Sigma-Aldrich | 44939-250G | |
| Sodium bicarbonate | EMD | SX0320-1 | |
| NaCl | Caledon | 7560-1 | |
| NH4Cl | EMD | 1011450500 | |
| CaCl2.2 H2O | EMD | 1023820500 | |
| Agar A | Bio Basic Canada Inc | FB0010 | |
| L-cysteine.HCl.H2O | Sigma-Aldrich | C7880-100G | |
| 1.0 mL syringes | Fischer scientific | B309659 | |
| 25G x 1 needles | BD | 305125 | |
| 125 mL serum bottles | Wheaton | 223748 | |
| 20 mm aluminum seals | Wheaton | 224223-01 | |
| 20mm E-Z Crimper | Wheaton | W225303 | |
| Butyl-rubber stoppers | Bellco Glass, Inc. | 2048-11800 | |
| Hungate tubes | Chemglass (VWR) | CLS-4208-01 | |
| Septum stopper, 13mm, Hungate | Bellco Glass, Inc. | 2047-11600 | |
| Glass culture Tubes | Corning (VWR) | 9826-16X | |
| Hydrochloric acid 36.5-38%, BioReagent | Sigma-Aldrich | H1758-100ML | 11.6 - 12 N |
References
- Blakemore, R. P. Magnetotactic bacteria. Annual Reviews in Microbiology. 36 (1), 217-238 (1982).
- Uebe, R., Schüler, D.
- Faivre, D., Schuler, D.
- Bazylinski, D. A., et al. Controlled biomineralization of magnetite (Fe3O4) and greigite (Fe3S4) in a magnetotactic bacterium. Applied and Environmental Microbiology. 61 (9), 3232-3239 (1995).
- Lefèvre, C. T., et al. Diversity of magneto-aerotactic behaviors and oxygen sensing mechanisms in cultured magnetotactic bacteria. Biophysical Journal. 107 (2), 527-538 (2014).
- Heyen, U., Schüler, D. Growth and magnetosome formation by microaerophilic Magnetospirillum strains in an oxygen-controlled fermentor. Applied Microbiology and Biotechnology. 61 (5-6), 536-544 (2003).
- Blakemore, R. P., Maratea, D., Wolfe, R. S. Isolation and pure culture of a freshwater magnetic spirillum in chemically defined medium. Journal of bacteriology. 140 (2), 720-729 (1979).
- Oestreicher, Z., Lower, S. K., Lin, W., Lower, B. H. Collection, isolation and enrichment of naturally occurring magnetotactic bacteria from the environment. Journal of Visualized Experiments. (69), (2012).
- Pósfai, M., Lefèvre, M., Trubitsyn, C., Bazylinski, D. A., Frankel, R. Phylogenetic significance of composition and crystal morphology of magnetosome minerals. Frontiers in Microbiology. 4, 344 (2013).
- Wolfe, R. S., Thauer, R. K., Pfennig, N. A 'capillary racetrack' method for isolation of magnetotactic bacteria. FEMS Microbiology Ecology. 3 (1), 31-35 (1987).
- Schübbe, S., et al. Characterization of a spontaneous nonmagnetic mutant of Magnetospirillum gryphiswaldense reveals a large deletion comprising a putative magnetosome island. Journal of Bacteriology. 185 (19), 5779-5790 (2003).
- Nadkarni, R., Barkley, S., Fradin, C. A comparison of methods to measure the magnetic moment of magnetotactic bacteria through analysis of their trajectories in external magnetic fields. PloS One. 8 (12), e82064 (2013).
- Waisbord, N., Lefèvre, C. T., Bocquet, L., Ybert, C., Cottin-Bizonne, C. Destabilization of a flow focused suspension of magnetotactic bacteria. Physical Review Fluids. 1 (5), 053203 (2016).
- Komeili, A., Vali, H., Beveridge, T. J., Newman, D. K. Magnetosome vesicles are present before magnetite formation, and MamA is required for their activation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (11), 3839-3844 (2004).
- Scheffel, A., et al. An acidic protein aligns magnetosomes along a filamentous structure in magnetotactic bacteria. Nature. 440 (7080), 110 (2006).
- Zhu, X., et al. Measuring spectroscopy and magnetism of extracted and intracellular magnetosomes using soft X-ray ptychography. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (51), E8219-E8227 (2016).
- Schüler, D. Molecular analysis of a subcellular compartment: the magnetosome membrane in Magnetospirillum gryphiswaldense. Archives of Microbiology. 181 (1), 1-7 (2004).
- Kolinko, I., et al. Biosynthesis of magnetic nanostructures in a foreign organism by transfer of bacterial magnetosome gene clusters. Nature Nanotechnology. 9 (3), 193 (2014).
- Hergt, R., et al. Magnetic properties of bacterial magnetosomes as potential diagnostic and therapeutic tools. Journal of Magnetism and Magnetic Materials. 293 (1), 80-86 (2005).
- Lefevre, C. T., et al. Novel magnetite-producing magnetotactic bacteria belonging to the Gammaproteobacteria. The ISME Journal. 6 (2), 440 (2012).
- Williams, T. J., Lefèvre, C. T., Zhao, W., Beveridge, T. J., Bazylinski, D. A. Magnetospira thiophila gen. nov., sp. nov., a marine magnetotactic bacterium that represents a novel lineage within the Rhodospirillaceae (Alphaproteobacteria). International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 62 (10), 2443-2450 (2012).
- Zhu, K., et al. Isolation and characterization of a marine magnetotactic spirillum axenic culture QH-2 from an intertidal zone of the China Sea. Research in Microbiology. 161 (4), 276-283 (2010).
