Summary
Wir präsentieren ein Verfahren für den Anbau von mehrere Stämme von Magnetospirillum in zwei verschiedene Arten von Wachstumsmedium. Magnetospirillum Gryphiswaldense Stamm MSR-1 ist in Flüssigkeit und O2 Konzentrationsgefälle halbfeste Medien gewachsen, während M. Magneticum Belastung AMB-1 und M. Magnetotacticum Belastung MS-1 im flüssigen Medium gewachsen sind.
Abstract
Magnetotaktische Bakterien sind Gramnegative, bewegliche, vor allem aquatische Prokaryoten allgegenwärtig in Süßwasser und marinen Habitaten. Sie zeichnen sich durch ihre Fähigkeit, Biomineralize magnetosomen, die magnetische nanometergroßen Kristalle von Magnetit (Fe3O4) oder Greigite (Fe3S4) umgeben von einer Lipidmembran Bilayer innerhalb ihrer Zytoplasma. Für die meisten bekannten Magnetotaktische Bakterien sind magnetosomen in Ketten in das Zytoplasma, dadurch konferieren eine dauerhafte magnetische Dipolmoment zu den Zellen und wodurch sie passiv mit externen Magnetfeldern ausrichten zusammengestellt. Aufgrund dieser Besonderheiten haben Magnetotaktische Bakterien ein großes Potenzial für gewerbliche und medizinische Anwendungen. Aber die meisten Arten sind mikroaerophil und Anforderungen sind in O2 Konzentration, erschweren sie routinemäßig als viele andere Bakterien wie Escherichia coliwachsen. Hier präsentieren wir ausführliche Protokolle für den Anbau von drei der am häufigsten untersuchten Stämme der Magnetotaktische Bakterien, alle gehören zu der Gattung Magnetospirillum. Diese Methoden ermöglichen präzise Steuerung der O2 Konzentration der Bakterien, um sicherzustellen, dass sie normal wachsen und magnetosomen synthetisieren zur Verfügung gestellt. Wachsende Magnetotaktische Bakterien für weitere Studien mithilfe dieser Verfahren erfordert keine der Experimentator, ein Experte in der Mikrobiologie. Die allgemeinen Methoden in diesem Artikel vorgestellten können auch verwendet werden, zu isolieren und Kultur anderen Magnetotaktische Bakterien, obwohl es wahrscheinlich ist, dass Wachstum Medien chemische Zusammensetzung geändert werden muss.
Introduction
Magnetotaktische Bakterien (MTB) repräsentieren ein breites Spektrum von Gram-negativen Prokaryoten in süß- und aquatischen Lebensräumen1allgegenwärtig. Diese Bakterien haben die Fähigkeit, magnetische Kristalle entweder Magnetit (Fe3O4) oder Greigite (Fe3S4), zu produzieren, die in den meisten Fällen zu Ketten im Inneren der Zellen zusammengesetzt sind. Diese besondere strukturmotiv ist aufgrund des Vorhandenseins mehrerer spezifischer Proteine Handeln sowohl im Zytoplasma der Bakterien und auf der Lipidmembran, die jeder Kristall2umgibt. Jeder einzelne Kristall und seine umgebenden Membran Vesikel nennt man eine magnetosomenkristalle und reicht in der Größe von etwa 30 bis 50 nm Magnetospirillum Arten3. Aufgrund der Kette Anordnung der magnetosomen besitzen diese Bakterien eine dauerhafte magnetische Dipolmoment, das macht sie passiv mit externen Magnetfeldern ausrichten. Daher, diese Bakterien aktiv schwimmen entlang der magnetischen Feldlinien, die als selbstfahrende Mikro-Kompasse vermutlich zu mehr effektiv die günstigsten Bedingungen suchen (zB., O2 -Konzentration) für Wachstum.
Eine interessante Eigenschaft von MTB ist ihre Fähigkeit zur Regulierung der Chemie und der Kristallographie magnetosomenkristalle Kristalle. Die meisten Stämme produzieren relativ hochreine Kristalle von Magnetit oder Greigite, obwohl einige Biomineralize beide Mineralien-4. In allen Fällen sind die Bakterien in der Lage, die Größe und die Form der magnetischen Einzeldomäne Kristalle genau zu kontrollieren. Dies erklärt, warum eine große Menge an Forschung unternommen wird, entwickeln ein besseres Verständnis der wie MTB dabei Biomineralisation durchführen. Verständnis dieses Prozesses können die Forscher zu Schneider-magnetischen Nanokristallen für viele gewerbliche und medizinische Anwendungen.
Eine wesentliche Behinderung umfangreiche Forschung auf dem MTB ist die Schwierigkeit, sie im Labor wachsen gewesen. Die meisten Arten, darunter die Stämme, die in dieser Arbeit verwendeten sind obligately mikroaerophil wenn mit O2 als ein terminal Elektron Akzeptor gewachsen. Dies erklärt, warum diese Bakterien in der Übergangszone zwischen oxischen und anoxischen Bedingungen (oxischen anoxischen Interface, OAI) am häufigsten anzutreffen sind. Dies zeigt deutlich, dass MTB haben präzise O2 Konzentration Anforderungen, die offensichtlich bei der Entwicklung von Wachstumsmedium für diese Organismen berücksichtigt werden muss. Darüber hinaus bedeutet die vorhandene Vielfalt der MTB, dass verschiedene Stämme, verschiedene Arten von chemischen Gradienten und Nährstoffe benötigen, um ein optimales Wachstum zu erreichen.
In dieser Arbeit beschreiben wir die Methoden für den Anbau von drei der am häufigsten untersuchten MTB: Magnetospirillum Magneticum (Stamm AMB-1), M. Magnetotacticum (MS-1) und M. Gryphiswaldense (MSR-1). Diese Arten phylogenetisch an der Alphaproteobakterien Klasse der Proteobakterien Stamm gehören, sind spiralförmige Morphologie und besitzen einen polaren Geissel an beiden Enden der Zelle. Wir bieten die Protokolle für den Anbau von MSR-1 Stamm in Flüssigkeit und O2 Konzentrationsgefälle halbfeste Medien, basierend auf bereits veröffentlichte mittlere Rezepte5,6. Außerdem präsentieren wir ein detailliertes Protokoll für den Anbau von Sorten AMB-1 und MS-1 in veränderten magnetischen Spirillumm Wachstum Medium (MGSM)7.
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Protocol
1. Installation der N-2 -Station
Hinweis: Wählen Sie den Innendurchmesser des Rohres, so dass es an der Gas-Tank mit minimaler Leckage angeschlossen werden kann und damit die Zylinder eine 1 mL kunststoffspritze fest in dieser Schlauch passt. Eine Abbildung des kompletten N2 Begasung Bahnhof ist in Abbildung 1zur Verfügung gestellt.
- Installieren Sie sicher einen N-2 -Gas-Tank in der Nähe einer Bank auf der gibt es genügend Raum zum Einrichten der N-2 -Station (eine Länge von ca. 50 cm).
- Verbinden Sie mit dem Tank ein Stück Schlauch lang genug um das Gebiet zu erreichen, wo der Bahnhof gebaut wird. Wenn nötig, auftragen Sie Teflonband am Ausgang des Tanks, um Undichtigkeiten zu vermeiden.
- Um eine Station in der Lage, sprudelnden fünf Flaschen des Mediums zur gleichen Zeit zu bauen, schneiden Sie vier Stück Schlauch von ca. 5 cm Länge.
- Montieren Sie die Stücke von Schläuchen in einer Linie mit drei Dreiwege t-förmigen Kunststoff-Fittings. Schließen Sie ein Ende der Linie an den Schlauch am Ausgang des N2 Tanks durch eine zusätzliche t-förmigen Einbau. Hinzufügen eines 90° Bogens passend am anderen Ende.
- Verwendung Band fügen Sie die Struktur auf eine horizontale Metallstab platziert ca. 30 cm über der Bank.
- Schließen Sie fünf Stücke von Rohr (ca. 20 cm lang) auf die freie Ausgänge der Armaturen im Schritt 1.4 installiert.
- Entfernen Sie die Kolben aus fünf 1,0 mL Kunststoffspritzen und schneiden das größere Ende des diese Spritzen (i.e., die gegenüberliegende Seite zur Nadel), halten nur die abgestuften Teil. Diese Spritzen nicht zu fest mit Watte, füllen.
- Legen Sie die Spritzen in den 20 cm langen vertikalen Stücken von Schläuchen und verwenden Sie Seifenwasser, um sicherzustellen, dass es keine Leckage beim N2 fließt.
- Entfernen Sie die Kappen der fünf 25 G Nadeln (0,5 x 25 mm) und legen Sie diese Nadeln in 10 cm Stücke von dünnen Schlauch. Sicherstellen Sie, dass die Nadeln fest in das Rohr passen.
Achtung: Besteht eine Messerstecherei während dieses Schritts. Tun Sie es langsam und vorsichtig. - Befestigen Sie die Nadeln in Schritt 1,9, die Spritzen der N-2 -Station vorbereitet. Sicherzustellen Sie, dass N2 durch alle fünf Linien fließt und halten Sie die Station auf Stand-by.
2. Wachstum mittelfristig Vorbereitung
Hinweis: Es ist möglich, die Menge des Mediums vorbereitet, einzustellen, wie in den Schritten 2.1.2, 2.2.2 und 2.3.8 erläutert. Die Menge an Wasser und Chemikalien verwendet muss nur proportional angepasst werden. Die Rolle der alle mittelkomponenten ist in ergänzenden Tabelle1beschrieben.
- Vorbereitung der flüssigen Wachstumsmedium für MSR-1
- Bereiten Sie eine 10 mM Eisen Citrat-Lösung durch Zugabe von 0,245 g ferric Citrate in 100 mL destilliertem, entionisiertem Wasser. Erhitzen Sie und unter Rühren Sie auflösen bis eine gelbe bis Orange klar, dass die Lösung erreicht ist. Autoklaven die Lösung mit einem Standard-Zyklus (mindestens 15 min Exposition bei 121 ° C) und speichern dann diese Stammlösung bei Raumtemperatur im Dunkeln.
Hinweis: Verwerfen Sie die ferric Citrat-Lösung, wenn ein Niederschlag offensichtlich wird. - In einem Becherglas mit 1 L destilliertem, entionisiertem Wasser, fügen Sie die folgenden in der Reihenfolge unter Rühren: 1,0 mL das Spurenelement ergänzen Lösung, 0,1 g KH2PO4, 0,15 g MgSO4.7 H2O, 2,38 g HEPES, 0,34 g NaNO3 , 0,1 g Hefe-Extrakt, 3,0 g Soja Bohnen Pepton, 4,35 mL Kalium Lactat (60 % w/w Lösung) und 5 mL 10 mM FE Citrat-Stammlösung.
Hinweis: Passen Sie die Mengen proportional ggf. eine kleinere Menge an Wachstumsmedium. Bereiten Sie eine N-2 -Station in der Lage, sprudelnden fünf Flaschen zur gleichen Zeit wie die in Schritt 1 dieses Protokolls 300 mL Medium.
Achtung: Trace Mineral und FE-Citrat-Lager, die Lösungen müssen steril gehalten werden. Um Kontaminationen zu vermeiden, verwenden Sie standard sterilen Technik beim Gebrauch (Flamme offenen Spitzen der Flaschen mit dem Bunsenbrenner) und sterilen Pipettenspitzen zur Abgabe. Lagern Sie Mineral-Lösung im Kühlschrank bei 4 ° c - Stellen Sie nach der Zugabe von Chemikalien den pH-Wert auf 7,0 mit 1 M NaOH Lösung. Das frisch zubereitete Medium in 125 mL Serum-Flaschen zu verzichten. Gießen Sie 60 mL Medium in jeder Flasche.
- Blase N2 in das Medium für 30 min die gelösten O2entfernen, verbunden mit den kleinen Schlauch an die N-2 -Station in Schritt 1 beschrieben. Legen Sie Butyl-Gummistopfen auf jeder Flasche, lassen eine kleine Öffnung, damit das überschüssige Gas um die Flasche zu beenden zu können.
Achtung: Schaum könnte während der sprudelnden mit N2. Passen Sie den Gasstrom zur Vermeidung von Schaumproduktion entsprechend an. - Crimp versiegeln jede Flasche mit den vorbereiteten stopfen und ein Aluminium-Siegel. Die Aluminium-Dichtung sorgt dafür, dass die Flasche während des Restes des Protokolls versiegelt bleibt.
- Trennen Sie die Nadeln und den dünnen Schlauch von der N-2 -Station und ersetzen Sie sie durch saubere Nadeln (1 Zoll, ≤ 23 G). Einstellen Sie die Ventile der N2 Tank so, dass sanfte kontinuierliche Gas den Tank (ca. 50 mL/min verlässt).
Hinweis: Nadeln größer als 23G können permanente unsealable Löcher in den stopfen lassen. - Legen Sie eine der Nadeln in eine Flasche des Mediums durch den Gummistopfen an der N2 Tank angeschlossen. Sofort setzen Sie eine andere saubere Nadel in der gleichen Flasche. Wiederholen Sie diesen Schritt für die anderen Flaschen und lassen Sie N2 fließen für ca. 30 min die Luft in den Flaschen von N2ersetzen zu.
- Trennen Sie eine Flasche von der N-2 -Station durch Entfernen der entsprechenden Nadel. Warten Sie einige Sekunden, bis der Druck in der Flasche des Mediums auf den atmosphärischen Druck verringert und entfernen Sie die zweite Nadel. Wiederholen Sie diesen Schritt für alle übrigen Flaschen.
Achtung: O2 Wiedereintritt in die Flaschen Wachstumsmedium nach Schritt 2.1.4 verhindern, führen Sie Schritte 2.1.4 - 2.1.8 kurz hintereinander. Wenn alle Flaschen auf der N2 Station gleichzeitig verbunden werden können, führen Sie Schritte 2.1.4-2.1.8 für den ersten Satz von Flaschen und dann wiederholen Sie diese Schritte für die restlichen Flaschen. - Autoklaven der Flaschen. Über Nacht auf Zimmertemperatur abkühlen lassen und anschließend bei Raumtemperatur lagern.
- Bereiten Sie eine 10 mM Eisen Citrat-Lösung durch Zugabe von 0,245 g ferric Citrate in 100 mL destilliertem, entionisiertem Wasser. Erhitzen Sie und unter Rühren Sie auflösen bis eine gelbe bis Orange klar, dass die Lösung erreicht ist. Autoklaven die Lösung mit einem Standard-Zyklus (mindestens 15 min Exposition bei 121 ° C) und speichern dann diese Stammlösung bei Raumtemperatur im Dunkeln.
- Vorbereitung der flüssigen Wachstumsmedium für AMB-1 und MS-1
- Bereiten Sie eine 10 mM Eisen quinate Lösung. Zuerst lösen Sie 0,19 g der quinic Säure in 100 mL destilliertem, entionisiertem Wasser, dann fügen Sie 0,27 g FeCl3.6H2O. unter Rühren auflösen, bis eine dunkle rote, klare Lösung entsteht. Autoklaven die Lösung unter Verwendung eines standard-Zyklus (mindestens 15 min Exposition bei 121 ° C).
Hinweis: Bewahren Sie die ferric quinate Lösung bei Raumtemperatur im Dunkeln als eine sterile Stammlösung. Entsorgen Sie die Lösung, wenn ein Niederschlag deutlich wird. - In einem Becherglas mit 1 L destilliertem, entionisiertem Wasser, fügen Sie die folgenden in der Reihenfolge unter Rühren: 10,0 mL Vitamin-Ergänzung-Lösung, 5,0 mL der Lösung Spur Mineralergänzung, 0,68 g KH2PO4, 0,848 g Natrium Succinat Diabas- Hexahydrat, 0,575 g di-Natrium-Tartrat-Dihydrat, 0,083 g Natrium Acetat Trihydrate, 0,45 mL 0,1 % wässrige Resazurin, 0,17 g NaNO3, 0,04 g Ascorbinsäure und 3,0 mL 10 mM FE quinate Stammlösung.
Hinweis: Passen Sie die Mengen proportional ggf. eine kleinere Menge an Wachstumsmedium. Bereiten Sie eine N-2 -Station in der Lage, sprudelnden fünf Flaschen zur gleichen Zeit wie die in Schritt 1 dieses Protokolls 300 mL Medium.
Achtung: Vitamin, Spurenelement und FE quinate Stammlösungen steril gehalten werden müssen. Um Kontaminationen zu vermeiden, verwenden Sie sterile Standardtechnik und sterilen Pipettenspitzen beim Dosieren. Speichern Sie die Mineral und Vitamin-Lösungen im Kühlschrank bei 4 ° C. - Stellen Sie nach der Zugabe von Chemikalien den pH-Wert auf 6,75 mit 1 M NaOH-Lösung.
- Beziehen sich auf Schritte 2.1.3-2.1.9 für den Rest des Protokolls.
- Bereiten Sie eine 10 mM Eisen quinate Lösung. Zuerst lösen Sie 0,19 g der quinic Säure in 100 mL destilliertem, entionisiertem Wasser, dann fügen Sie 0,27 g FeCl3.6H2O. unter Rühren auflösen, bis eine dunkle rote, klare Lösung entsteht. Autoklaven die Lösung unter Verwendung eines standard-Zyklus (mindestens 15 min Exposition bei 121 ° C).
- Vorbereitung der halbfeste Wachstumsmedium für MSR-1
- Bereiten Sie einen 0,5 M Phosphat-Puffer-Lösung pH 7,0 durch 3,362 g K2HPO4 und 4,178 g KH2PO4 in 100 mL destilliertem, entionisiertem Wasser auflösen. Überprüfen Sie, ob der pH-Wert 7,0 und passen Sie den pH-Wert leicht mit KH2PO4 oder NaOH bei Bedarf an. Speichern Sie die Lösung in einer verschlossenen Glasflasche (vorzugsweise aus Kunststoff zur Vermeidung von sauerstoffaustausch).
- 100 mL einer 0,02 M Salzsäure Lösung vorzubereiten. Fügen Sie 0,2 g FeCl2.4H2O diese Projektmappe hinzu und unter Rühren Sie auflösen um ein 10 mM Eisen-chlorid-Lösung zu erhalten. Speichern Sie die Lösung in der Dunkelheit in einer verschlossenen Glasflasche.
- Bereiten Sie eine 0,8 M Natriumbikarbonat Lösung durch 6,72 g Nahco33 in 100 mL destilliertem, entionisiertem Wasser auflösen. Speichern Sie die Lösung in einer verschlossenen Glasflasche.
- Autoklaven vorbereitet die Lösungen in Schritten 2.2.1 - 2.2.3 mit einem standard-Zyklus (mindestens 15 min Exposition bei 121 ° C). Speichern Sie sie als sterile Stammlösungen im Dunkeln.
- In einem Becherglas mit 1 L destilliertem, entionisiertem Wasser, fügen Sie die folgenden in der Reihenfolge unter Rühren: 5 mL der Lösung Spur Mineralergänzung, 0,2 mL 1 % ige wässrige Resazurin Lösung, 0,4 g NaCl, 0,3 g NH4Cl, 0,1 g MgSO4.7H2 O, 0,05 g CaCl2.2H2O, 1 g Natrium Succinat, 0,5 g Natriumacetat, 0,2 g Hefe zu extrahieren und 1,6 g Agar.
- Decken Sie den Becher mit Aluminiumfolie und Autoklaven die Lösung im Schritt 2.3.5 vorbereitet.
- Kurz vor dem Ende des Kreislaufs Autoklaven, bereiten Sie eine frische 4 % L-Cysteine· HCl· H2O Lösung durch Auflösen von 0,8 g L-cysteine· HCl· H2O in 20 mL destilliertem, entionisiertem Wasser. Neutralisieren Sie die Lösung mit pH 7.0 mit 5 M NaOH Lösung.
Achtung: Es ist wichtig, dass die Cystein-Lösung frisch zubereitet ist, um Oxidation der Cystein zu vermeiden. Lagern Sie Mineral-Lösung im Kühlschrank bei 4 ° c - Nach dem Autoklavieren der mittlere auf 50 – 60 ° C abkühlen lassen und den Becher unter die Flamme einen Bunsenbrenner zu bringen. Die Alufolie entfernen und schnell fügen Sie die folgenden in der Reihenfolge unter Rühren sanft: 0,5 mL der Lösung Vitamin, 2,8 mL sterile Phosphat Puffer Vorratslösung, 3 mL sterile Eisen chlorid Vorratslösung, 1,8 mL sterile Natrium Bicarbonat-Lager Lösung und 10 mL Filter sterilisiert Cystein-Lösung.
Hinweis: Passen Sie die Mengen proportional ggf. eine kleinere Menge an Wachstumsmedium. Es ist in der Regel zweckmäßig, einen Stapel von 120 mL Medium vorzubereiten.
Achtung: Alle Lösungen müssen für die zukünftige Verwendung steril bleiben. Führen Sie Schritt 2.3.8 mit sterilen Standardtechnik und sterilen Pipette Tipps beim Dosieren. - Nachdem die Zugabe von Chemikalien, übertragen die warmen Medium in 16 mL steriles Röhrchen mit Schraubverschluss Hungate. Überführen Sie 12 mL des Mediums in jedem Röhrchen und verschließen Sie die Rohre.
Achtung: Um Kontaminationen zu vermeiden, führen Sie Schritt 2.3.9 unter die Flamme von einem Bunsenbrenner. Führen Sie es, bevor die Agar erstarrt, während das Medium bei 40 ° C oder höher ist. - Lassen Sie die Rohre ungestört für mehrere Stunden, bis die Agar erstarrt und die OAI deutlich wird, wie eine rosa bis farblos Schnittstelle, etwa 1 bis 3 cm unter der Oberfläche des Mediums zu materialisieren.
Hinweis: Das Medium sollte langsam in das Rohr farblos drehen. Der Zeitaufwand für diesen Übergang ist variabel und hängt vom Umfang der O2 zunächst in das Medium gelöst.
3. Inokulation von MTB
Hinweis: Die Kulturen der Stämme AMB-1 MS-1 und MSR-1 erhalten Sie im Handel (Table of Materials).
Vorsicht: Führen Sie die folgenden Schritte unter sterilen Bedingungen unter die Flamme von einem Bunsenbrenner.
- Inokulation von Stämmen MSR-1, AMB-1 und MS-1 in flüssigem medium
- Eine leere 125 mL Serum Flasche mit Butyl-Gummistopfen und einer Aluminium-Crimp-Dichtung zu versiegeln. Legen Sie zwei Nadeln in der Flasche durch den Stopper, und schließen Sie eine Spritze vorbereitet wie in Schritt 1,7 bis einer von ihnen. Schließen Sie die Spritze in einen Zylinder von O2 durch den gleichen Typ von Schläuchen für die N-2 -Station verwendet.
- Lassen Sie O2 fließen durch die Flasche für ca. 30 min, um sicherzustellen, dass alle Luft in der Flasche durch O2ersetzt wird. Entfernen Sie beide Nadeln, zulassend einen leichten Überdruck in der Flasche und dann Autoklaven. Lassen Sie die Flasche vor Gebrauch auf Raumtemperatur abkühlen lassen.
Hinweis: Um Zeit zu sparen, führen Sie Schritte 3.1.1 und 3.1.2 während der mittleren Vorbereitung und Autoklaven die Flasche zusammen mit dem Medium oder der Stammlösungen. - Sterilisieren Sie die Spitzen der Stopper mittlere Wasserflasche und die O-2 -Flasche durch die Anwendung ein paar Tröpfchen von 70 % Ethanol Lösung auf ihnen und Weitergabe durch die Flamme dem Bunsenbrenner.
- Mit eine sterile Spritze und Nadel, O2 Flasche 1 mL O2 entziehen und in die mittlere Wasserflasche zu übertragen. Stellen Sie sicher, dass die Nadel fest auf die Spritze während dieses Schrittes passt, keine Luft in der Spritze zu vermeiden.
- Wenn das Inokulum aus einer anderen Kultur in einer Glasflasche angebaut, Sterilisieren Sie die Stopper der mittleren Wasserflasche und die älteren kulturflasche durch die Anwendung ein paar Tröpfchen von 70 % Ethanol Lösung auf ihnen und Weitergabe durch die Flamme dem Bunsenbrenner. Wenn das Inokulum aus einem Rohr von gefrorenen Kultur verwenden, lassen Sie es auf Zimmertemperatur Aufwärmen mit dem Rohr unter die Flamme von einem Bunsenbrenner versiegelt.
- Wenn das Inokulum aus einer anderen Kultur in einer Glasflasche gewachsen, inokulieren Sie 1 mL der älteren Kultur in das neue Medium. Wenn die Impfung aus einem gefrorenen bestand, impfen Sie nur 0,1 mL um die Glycerin oder Dimethyl Sulfoxid (DMSO) verwendet in den Gefrierprozess zu verdünnen. Verwenden Sie in beiden Fällen eine sterile Nadel und eine sterile Spritze.
- Die Kultur bei 32 ° C inkubieren und nach 4 bis 7 Tagen in frischem Medium zu impfen.
- Inokulation von MSR-1 O2 gradient halbfesten Medium
- Stellen Sie sicher, dass das Rohr des frisches Medium eine wohldefinierte OAI, materialisiert durch eine rosa bis farblos Schnittstelle angezeigt wird.
- Wenn das Inokulum aus einer anderen O2 Konzentrationsgefälle halbfeste Kultur kommt, Ernten Sie die Bakterien durch pipettieren 50 µL der Kultur mit einer sterilen Pipettenspitze auf die Band, die von den Bakterien gelegt. Impfen Sie langsam diese Bakterien an die OAI in frisches Medium (Rosa/farblos-Schnittstelle), die Schnittstelle zu stören zu vermeiden. Wenn das Inokulum aus einer gefrorenen Kultur kommt, gehen Sie stattdessen auf die gleiche Weise mit 100 µL des Inokulums.
- Verschließen der Tube und lassen Sie die Bakterien, zwischen 25 ° C und 30 ° C wachsen. Übertragung in frischem Medium mit dem gleichen Verfahren vor dem Band der Bakterien erreicht die Oberfläche des Mediums.
4. Beobachtung der Bakterien
- Sterilisieren Sie die Stopper der kulturflasche 70 % Ethanol Lösung oben drauf und die Flamme von einem Bunsenbrenner durchlaufen. Für halbfeste Medium Öffnen der Tube unter die Flamme von einem Bunsenbrenner. Verwenden Sie eine sterile Nadel und eine sterile Spritze, um die Bakterien zu extrahieren.
- Verwendung der hängenden drop Methode8 um sicherzustellen, dass die Bakterien magnetisch und bewegliche sind.
Hinweis: Phasenkontrastmikroskopie gibt gute Ergebnisse aber nicht zwingend. Vergrößerungen von 10 X bis 60 X eignen. - Nutzen Sie Transmissions-Elektronenmikroskopie (TEM), um die Zellstruktur und die magnetosomen im Detail8beobachten.
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Representative Results
Erfolgreiche Vorbereitung der Wachstumsmedien kann wie folgt beurteilt werden. Am Ende des Prozesses, klare Lösungen (zB., frei von jedem Niederschlag) gesammelt werden (Dies gilt für flüssige Medien und O2 gradient halbfesten Medium). Ein Bild den erwarteten Aspekt des flüssigen Mediums MSR-1 anzeigen, bevor Inokulation in Abbildung 2agesehen werden kann. Eine erfolgreiche O2 Konzentrationsgefälle halbfesten Medium wird durch die Bildung einer OAI nach ein paar Stunden, gekennzeichnet durch das Vorhandensein von 1 – 3 cm rosa Medium an der Spitze des Rohres (Abbildung 3, Schlauch A) signalisiert. Der Rest des Mediums sollte farblos sein. Ein All-Rosa Medium vor Impfung ein Zeichen für die vollständige Oxidation von der Resazurin ist und daher einer erfolglosen Zubereitung das Konzentrationsgefälle O2 .
Erfolgreiches Wachstum in flüssigen Medium kann überprüft werden ca. 48 h nach der Inokulation (oder nach ein paar Tagen, wenn das Inokulum aus einer gefrorenen Kultur kommt) einfach durch die Untersuchung der Kulturen für Trübung mit einer Lichtquelle oder einem Spektrophotometer. Erfolgreiches Wachstum wird durch Trübung, die beweisen, dass die Bakterien tatsächlich (Abb. 2 b wuchs) bestätigt. Wenn das Medium nach 48 h klar bleibt, sind die Bakterien nicht gewachsen. Für eine mittlere Flüssigkultur normalerweise wächst kann das Vorhandensein von Bakterien synthetisiert magnetosomen nach 48 h durch die Flasche des Mediums auf einem magnetischen rühren Teller platzieren und mit einer Taschenlampe beleuchten überprüft werden. An einem langsamen rühren sollte das Medium "flash" suchen abwechselnd dunkler und heller, je nach Ausrichtung des mitreißenden Magneten in Bezug auf die Position der Experimentator. Für eine nicht-magnetische Kultur wird die Intensität der Zellen gegenüber dem Experimentator gestreute Licht konstant bleiben.
Erfolgreiches Wachstum in halbfesten Medium wird durch die Bildung einer mikroaerophil Bande von Bakterien an der Rosa/farblos Schnittstelle angezeigt. Durch den Verzehr von O2 durch die Bakterien und die Veränderungen in der O2 Farbverlauf migrieren die Band langsam um die OAI (Abbildung 3, Rohr B) folgen.
Das hà ¤ ngen drop Methode ermöglicht es den Betrachter zu prüfen, ob die Bakterien magnetisch und bewegliche sind. Nach ein paar Minuten sollte MTB konzentrieren sich am Rand des hängenden Tropfens, beweisen, dass sie aktiv entlang der magnetischen Feldlinien (Abbildung 4a Schwimmen). Um sicherzustellen, dass die Zellen magnetisch sind, drehen Sie die Ausrichtung des Magneten sitzt neben des Tropfens. Die Bakterien beginnen sollte Schwimmen in Richtung der gegenüberliegenden Kante (Abbildung 4 b). Schließlich kann die Form der magnetosomen mit TEM überprüft werden. Cuboctahedral Kristalle von ca. 30 – 45 nm im Durchmesser9hinzuweisen. Diese Kristalle sind normalerweise in einer langen Kette angeordnet oder mehrere kürzere Ketten in der Art studiert hier (Abbildung 5).
Abbildung 1 : Abbildung der N2 Bahnhof Begasung. (ein) schematische Darstellung. (b) Bild des Setups. Eine erfolgreiche Station wird die entsprechende Länge der große und dünne Schläuche haben, so dass das Ende des dünnen Schlauch im Schritt 1.9 des Protokolls beschrieben während der Gas sprudelnden Schritt in das Medium eingetaucht bleibt. Die Strömung des Gases sollte auch einstellbare jederzeit sicherstellen, dass alle O2 entfernt ist, und dass das Medium nicht verschüttet wird. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 : Flaschen flüssiges Nährmedium vor und nach der Inokulation. (ein) klare MSR-1 Medium vor der Impfung. (b) trübe MSR-1 Medium nach 3 Tagen des erfolgreichen Wachstums. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 : Rohre O2 Gradienten halbfesten Medium vor (Schlauch A) und 10 Tage nach der Inokulation (Rohr B). Die Band von Bakterien im Rohr B wird durch einen roten Pfeil angezeigt.
Abbildung 4 : Typische Ergebnisse eines hängenden Tropfens experimentieren mit 20 X Vergrößerung mit Phasenkontrastmikroskopie. (ein) MTB Schwimmen in Richtung Südpol eines Magneten und reichern sich an der Schnittstelle der Flüssigkeit/Luft ab. (b) 1 min nach Umklappen des Magnets, verlassen die meisten Zellen haben das Sichtfeld.
Abbildung 5 : TEM Beobachtung einer Zelle AMB-1. Magnetosomenkristalle Ketten sind durch rote Pfeile gekennzeichnet. Die zwei Flagellen sind durch Schwarze Pfeile angedeutet.
Ergänzende Tabelle1. Klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
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Discussion
Die O2 Konzentration Anforderungen der MTB machen sie nicht-triviale im Labor wachsen. Ein wichtiger Schritt des Protokolls für flüssige Medium ist die anfängliche Entfernung aller O2 vom Medium um die Endkonzentration zu kontrollieren, indem man einem bestimmten Volumen von O2, kurz vor der Impfung. Es hat sich gezeigt, dass MSR-1 wächst fast vollständig aeroben Bedingungen, jedoch der Magnetismus der Zellen wird drastisch reduziert. Die Ergebnisse aus der gleichen Studie zeigte, dass Stämme AMB-1 und MS-1 nicht in vollem Umfang aeroben Bedingungen6wachsen. Für die halbfeste Kultur von MSR-1 alle O2 wird zunächst durch die Cystein-Lösung reduziert und dann das Konzentrationsgefälle O2 erscheint, führt zur Bildung von der OAI. Wenn eine Kultur nicht gut wächst oder nicht magnetisch ist, sollte die O2 -Konzentration die erste Sache zu prüfen.
Halbfeste Wachstumsmedium ist eine interessante Wahl für unbekannte MTB zu isolieren oder wachsenden Arten, die sehr empfindlich auf beide O-2 und Redox-Gradienten sind wie es die Existenz von stabilen Verläufen sichert und ermöglicht es die Bakterien, sich zu positionieren die Lage bietet die besten Wachstumsbedingungen. Flüssiges Medium ist bequemer arbeiten mit wenn höhere Volumina benötigt werden (zB., für DNA-Extraktion), oder wenn weitere Analyse auf die Zellen durchgeführt werden muss (zB., magnetosomenkristalle Studien) denn es ermöglicht ein einfacher Trennung der Zellen aus Das Wachstumsmedium. Der Agar in halbfesten Medium könnte in der Tat mit der Zelle Erntetechnik stören.
In manchen Kulturen werden die Zellen manchmal nicht-bewegliche, wahrscheinlich durch spontane Mutationen. Non-bewegliche Zellen überleben und wachsen in das Wachstumsmedium, da sie nicht brauchen, zu schwimmen, um Nährstoffe zu finden, die für ihr Überleben notwendig. Die standard Rennstrecke Methode10 lässt dann eine bewegliche Kultur erholen, da nur bewegliche Zellen auf der Rennstrecke schwimmen können. Der Verlust des magnetischen Phänotyps kann auch in der Kultur passieren, auch wenn die O2 -Konzentration durch spontane Mutationen11wieder optimal ist. Die beste Lösung ist in diesem Fall eine neue Kultur starten durch impfen Bestände der Wildtyp Bakterien in frischem Medium eingefroren. Alternativ können die Rennstrecke Technik auch die Wiederherstellung einer magnetischen Kultur.
Es ist wichtig zur Vermeidung von Kontaminationen der Kultur durch andere Organismen und daher müssen die meisten des Protokolls durchgeführt werden, sterile Techniken. In der Regel unter die Flamme von einem Bunsenbrenner Manipulation gibt zufriedenstellende Ergebnisse in aseptischen Bedingungen zu halten. Jedoch wenn die Kultur in einer Kontamination-gefährdeten Umgebung angebaut wird, sollten zusätzliche Vorkehrungen getroffen werden wie in einer Laminar-Flow-Haube arbeiten, bei der Vorbereitung des Mediums und die Bakterien zu impfen. Es sei darauf hingewiesen, dass das Risiko einer Kontamination ist höher in halbfesten Medium, da die Rohre müssen geöffnet werden, jedes Mal, wenn die Zellen entfernt werden.
Diese Protokolle ermöglichen genügend Bakterienwachstum, viele verschiedene Arten von Experimenten, wie physikalischen Untersuchungen basierend auf optischen Mikroskopie12,13, Elektronenmikroskopie bildgebenden14,15durchzuführen, X-ray Spectromicroscopy Analysen16, genomische und Protein Studien17,18. Falls erforderlich, können höhere Konzentrationen von Bakterien in der Schwebe durch Zentrifugieren erreicht werden. Darüber hinaus können magnetosomen extrahiert und gereinigt für weitere Anwendungen von Zelle Pellets oder dichten Zellsuspensionen durch Zentrifugation19gewonnen werden.
Wachstum Medien Formulierungen basieren in der Regel auf den gleichen leitenden Prinzipien (siehe ergänzende Tabelle1 eine Übersicht über die Liste der Rolle der einzelnen Komponenten in die Wachstumsmedien hier beschrieben). Eine Kohlenstoffquelle für die Bakterien über organische Säuren zugänglich sein (zB., Tartrat, Laktat, Succinat, Acetat) oder anorganischen Verbindungen wie Bikarbonat. Die Wahl der geeigneten Kohlenstoffquelle hängt von den Stoffwechsel der Bakterien. Stickstoff in DNA und Proteine und Phosphor (DNA, Membranen) sind ebenfalls erforderlich und von NaNO3, NH4Cl und KH2PO4 in der hier beschriebenen Rezepte zur Verfügung gestellt. Ein Puffer (HEPES, Phosphatpuffer) ist notwendig, pH-Veränderungen zu widerstehen. Die Ablaufverfolgung Mineralergänzung Lösung enthält Cofaktoren für Enzyme und Vitamine können verwendet werden von den Bakterien als Coenzyme oder als funktionelle Gruppen für bestimmte Enzyme. Hefe-Extrakt und Soja-Bohne-Pepton bieten eine Quelle von Aminosäuren und Salzen für Protein-Produktion verwendet. Da MTB sind Redox empfindlich, eine oder mehrere Reduktionsmittel muss oft auf das Medium hinzugefügt werden (zB., Cystein, Ascorbinsäure, Laktat). Eine wichtige Quelle für Eisen (zB., ferric Citrate, ferric quinate, Eisen-chlorid) in das Medium für Biomineralisation benötigt wird. Schließlich ist eine kleine Menge von O2 als terminal Elektron Akzeptor für mikroaerophil Bakterien erforderlich. Verpflichten Sie anaerobe MTB Einsatz stattdessen andere Verbindungen wie Nitrat oder Lachgas.
Der begrenzende Faktor dieser Protokolle ist, dass es keine Garantie, dass sie für andere Arten von MTB funktionieren werden. AMB-1-Stämme MS-1 und MSR-1 sind alle Süßwasser MTB und daher nicht die Rezepte, die in diesem Artikel beschriebenen marine Magnetospirilla wie Magnetospira Thiophila Stamm MMS-1, Magnetospira Dehnung QH-2 oder andere marine MTB wachsen verwendet werden die höheren Salzkonzentrationen erfordern. Jedoch um andere Stämme von MTB und für die Isolierung neuer Stämme wachsen, die allgemeinen Methoden in diesem Artikel für flüssige und halbfeste Medien vorgestellten lässt sich Medien mit verschiedenen Rezepten zubereiten.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Wir danken Richard B. Frankel für seine Hilfe bei MTB-Kulturen, Adam P. Hitchcock und Xiaohui Zhu für ihre Unterstützung beim Aufbau der MTB-Kulturen an der McMaster University und Marcia Reid für Ausbildung und Zugang zu der Elektronenmikroskopie-Anlage (McMaster University, Faculty of Health Sciences). Diese Arbeit wurde von den Naturwissenschaften und Engineering Research Council of Canada (NSERC) und der US National Science Foundation unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AMB-1 | American Type Culture Collection (ATCC) | ATCC 700264 | |
| MS-1 | ATCC | ATCC 31632 | |
| MSR-1 | Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) | DSM 6361 | |
| Ferric citrate | Sigma-Aldrich | F3388-250G | |
| Trace mineral supplement | ATCC | MD-TMS | |
| KH2PO4 | EMD | PX1565-1 | |
| MgSO4.7 H2O | EMD | MX0070-1 | |
| HEPES | BioShop Canada Inc | HEP001.250 | |
| NaNO3 | Sigma-Aldrich | S5506-250G | |
| Yeast extract | Fischer scientific | DF210929 | |
| Peptone | Fischer scientific | DF0436-17-5 | |
| Potassium L-lactate solution (60%) | Sigma-Aldrich | 60389-250ML-F | |
| D-(-)-Quinic acid | Sigma-Aldrich | 138622 | |
| FeCl3.6H2O | Fischer scientific | I88-100 | |
| Vitamin supplement | ATCC | MD-VS | |
| Sodium succinate hexahydrate | Fischer scientific | S413-500 | |
| Sodium L-tartrate dibasic dihydrate | Sigma-Aldrich | 228729-100G | |
| Sodium acetate trihydrate | EMD | SX0255-1 | |
| Resazurin | Difco | 0704-13 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544-25G | |
| K2HPO4 | Caledon | 6620-1-65 | |
| FeCl2 .4H2O | Sigma-Aldrich | 44939-250G | |
| Sodium bicarbonate | EMD | SX0320-1 | |
| NaCl | Caledon | 7560-1 | |
| NH4Cl | EMD | 1011450500 | |
| CaCl2.2 H2O | EMD | 1023820500 | |
| Agar A | Bio Basic Canada Inc | FB0010 | |
| L-cysteine.HCl.H2O | Sigma-Aldrich | C7880-100G | |
| 1.0 mL syringes | Fischer scientific | B309659 | |
| 25G x 1 needles | BD | 305125 | |
| 125 mL serum bottles | Wheaton | 223748 | |
| 20 mm aluminum seals | Wheaton | 224223-01 | |
| 20mm E-Z Crimper | Wheaton | W225303 | |
| Butyl-rubber stoppers | Bellco Glass, Inc. | 2048-11800 | |
| Hungate tubes | Chemglass (VWR) | CLS-4208-01 | |
| Septum stopper, 13mm, Hungate | Bellco Glass, Inc. | 2047-11600 | |
| Glass culture Tubes | Corning (VWR) | 9826-16X | |
| Hydrochloric acid 36.5-38%, BioReagent | Sigma-Aldrich | H1758-100ML | 11.6 - 12 N |
References
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