Summary
Vi præsenterer en procedure til at dyrke flere stammer af Magnetospirillum i to forskellige typer af væksten medier. Magnetospirillum gryphiswaldense stamme MSR-1 er vokset i både flydende og O2 koncentration gradient halvfaste media mens M. magneticum stamme AMB-1 og M. magnetotacticum stamme MS-1 er vokset i flydende substrat.
Abstract
Magnetotactic bakterier er Gram-negative, motile, primært akvatiske prokaryoter, der er allestedsnærværende i ferskvand og marine habitater. De er kendetegnet ved deres evne til at biomineralize magnetosomes, der er magnetisk nanometer-størrelse krystaller af magnetit (Fe3O4) eller greigite (Fe3S4) omgivet af et lipid tolagede membran, inden for deres cytoplasma. For de fleste kendte magnetotactic bakterier, er magnetosomes samlet i kæder i cytoplasmaet, hvilket giver en permanent magnetiske dipolmoment til cellerne og får dem til at justere passivt med eksterne magnetiske felter. På grund af disse specifikke funktioner har magnetotactic bakterier et stort potentiale for kommercielle og medicinske applikationer. Men de fleste arter er microaerophilic og har særlige O2 koncentration krav, hvilket gør dem sværere at vokse rutinemæssigt end mange andre bakterier som Escherichia coli. Her præsenterer vi detaljerede protokoller til dyrkning af tre af de mest studerede stammer af magnetotactic bakterier, alle tilhører slægten Magnetospirillum. Disse metoder giver mulighed for præcis styring af O2 koncentrationen stilles til rådighed for bakterier, for at sikre, at de vokse normalt og syntetisere magnetosomes. Voksende magnetotactic bakterier for yderligere undersøgelser ved hjælp af disse procedurer kræver ikke experimentalist at være ekspert i mikrobiologi. De generelle metoder præsenteres i denne artikel kan også bruges til at isolere og kultur andre magnetotactic bakterier, selv om det er sandsynligt at vækst medier kemiske sammensætning skal ændres.
Introduction
Magnetotactic bakterier (MTB) repræsenterer en bred vifte af Gram-negative prokaryoter allestedsnærværende i ferskvand og marine akvatiske naturtyper1. Disse bakterier del evnen til at producere magnetiske krystaller af enten magnetit (Fe3O4) eller greigite (Fe3S4), som der de fleste tilfælde er samlet i kæder inde i cellerne. Denne særlige strukturelle motiv er på grund af tilstedeværelsen af flere specifikke proteiner handler både i cytoplasma af bakterier og lipid membranen, der omgiver hver krystal2. Hver enkelte krystal og dens omgivende membran vesikel kaldes en magnetosome og er spænder i størrelse fra omkring 30 til 50 nm i Magnetospirillum arter3. På grund af den kæde arrangement af magnetosomes besidder disse bakterier en permanent magnetiske dipolmoment, der gør dem Juster passivt med eksternt anvendt magnetfelter. Derfor, disse bakterier aktivt svømme langs magnetiske feltlinier, optræder som selvkørende mikro-kompasser formentlig til mere effektivt finde de mest gunstige forhold (fx., O2 koncentration) for vækst.
En interessant ejendom af MTB er deres evne til at regulere både kemi og krystallografi af deres magnetosome krystaller. De fleste stammer producerer relativt høj renhed krystaller af enten magnetit eller greigite, selv om nogle biomineralize begge mineraler4. I alle tilfælde er at bakterier i stand til netop styre størrelsen og formen af deres enkelt magnetisk domæne krystaller. Dette forklarer, hvorfor en stor del af forskningen er forpligtet sig til at udvikle en bedre forståelse af hvordan MTB udføre denne biomineralization proces. Forstå denne proces kan give forskere at skræddersy magnetiske nanokrystaller for mange kommercielle og medicinske applikationer.
En væsentlig hindring for omfattende forskning på MTB har været vanskeligheden ved at dyrke dem i laboratoriet. De fleste arter, herunder de stammer, der er brugt i dette arbejde, er obligately microaerophilic når vokset med O2 som en terminal elektron acceptor. Dette forklarer, hvorfor disse bakterier findes oftest på overgangszone mellem oxic og iltfattige forhold (oxic-anoxiske interface, OAI). Dette viser klart, at MTB har præcise O2 koncentration krav, der naturligvis skal tages i betragtning, når udtænke vækst medier for disse organismer. Den store eksisterende mangfoldighed af MTB indebærer desuden, at forskellige stammer vil har brug for forskellige typer af kemiske gradienter og næringsstoffer for at opnå optimal vækst.
I dette arbejde, vi beskriver metoder til dyrkning af tre af de mest studerede MTB: Magnetospirillum magneticum (stamme AMB-1), M. magnetotacticum (MS-1) og M. gryphiswaldense (MSR-1). Disse arter Fylogenetisk tilhører klassen Alphaproteobacteria i proteobakterier phylum, er spiralformet i morfologi og besidder en polar fimrehår i hver ende af cellen. Vi leverer protokollerne for voksende stamme MSR-1 i både flydende og O2 koncentration gradient halvfaste medier, baseret på tidligere udgivne medium opskrifter5,6. Vi præsenterer også en detaljeret protokol for voksende stammer AMB-1 og MS-1 i modificeret magnetiske Spirillum vækst Medium (MGSM)7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. installation af N2 Station
Bemærk: Vælge den indvendige diameter af slangen, så den kan tilsluttes til gastank med minimal lækage, og cylinder med en 1 mL plastik sprøjte stramt passer i denne slange. En illustration af den komplette N2 gasning station er fastsat i figur 1.
- Sikkert installere en N2 gastank tæt på en bænk, hvor der er plads nok til at oprette N2 station (en længde på ca 50 cm).
- Oprette forbindelse til tanken et stykke slange længe nok til at nå det område, hvor stationen vil blive bygget. Hvis det er nødvendigt, Anvend Teflon tape på outputtet af beholderen til at undgå enhver lækage.
- For at bygge en station i stand til at boblende fem flasker af medium samtidig, skåret fire stykker af slangen i ca. 5 cm i længden.
- Samle stykker af slangen i en linje med tre tre-vejs T-formet plast beslag. Tilslut den ene ende af denne linje til stykket af slangen på outputtet af N2 tank gennem en ekstra T-formede montering. Tilføje en 90° albue montering i anden enden.
- Brug tape til at vedhæfte struktur til en vandret metalstang placeret ca 30 cm over bænken.
- Tilslut fem stykker af slanger (ca 20 cm i længden) til gratis output af udstyr installeret i trin 1.4.
- Fjern stemplerne fra fem 1,0 mL plastik sprøjter og skære den større ende af disse sprøjter (dvs., den modsatte side til nålen), holder kun den graduerede del. Fylde disse sprøjter med bomuld, ikke for stramt.
- Indsæt sprøjter i 20 cm lange lodrette stykker af slangen og bruge sæbevand til at sikre, at der ikke forekommer udsivning når N2 flyder.
- Fjerne caps af fem 25 G nåle (0,5 mm x 25 mm) og indsætte disse nåle i 10 cm stykker af tynde slanger. Sikre, at nålene stramt passer ind i slangen.
Forsigtig: Der er en risiko for knivstikkeri under dette trin. Gøre det langsomt og forsigtigt. - Vedhæfte nålene forberedt i trin 1,9 til sprøjter N2 Station. Sikre, at N2 strømmer gennem alle fem linjer og holde station på stand-by.
2. vækst Medium forberedelse
Bemærk: Det er muligt at justere mængden af medium forberedt, som forklaret i trin 2.1.2 og 2.2.2 2.3.8. Mængden af vand og kemikalier bruges bare behov justeres proportionalt. Rollen af alle mellemstore komponenter er beskrevet i supplerende tabel 1.
- Forberedelse af flydende vækstmedium for MSR-1
- Forberede en 10 mM jern citratopløsning ved at tilføje 0.245 g af jern citrat 100 mL deioniseret vand. Varme og rør til at opløse, indtil en gul til orange klar løsning opnås. Autoklave løsning ved hjælp af en standard cyklus (mindst 15 min eksponering ved 121 ° C) og derefter gemme denne stamopløsning ved stuetemperatur i mørke.
Bemærk: Smid jern citratopløsning når en bundfaldet bliver indlysende. - I et bægerglas indeholdende 1 L destilleret ionbyttet vand, tilføje følgende i rækkefølge under omrøring: 1,0 mL af spormineral supplere løsning, 0,1 g KH2PO4, 0,15 g af MgSO4.7 H2O, 2,38 g af HEPES, 0,34 g af NaNO3 , 0,1 g gær extract, 3,0 g af soja bønne pepton, 4.35 mL af kalium laktat (60% w/w løsning) og 5 mL af 10 mM PP. citrat stamopløsning.
Bemærk: Justere mængderne proportionalt hvis en mindre mængde af vækstmediet er nødvendig. En N2 station i stand til at boblende fem flasker på samme tid, som det bygget i trin 1 i denne protokol, forberede 300 mL af medium.
Forsigtig: Spore mineral og PP. citrat lager løsninger skal holdes sterilt. For at undgå kontaminering, brug standard steril teknik, når du bruger dem (flamme åbne toppe af flasker ved hjælp af en bunsenbrænder) og brug steril pipette tips for udlevering. Gemme den mineral løsning i køleskab ved 4 ° C. - Efter tilsætning af alle kemikalier, justere pH 7.0 med 1 M NaOH-opløsning. Frisklavet substratet i 125 mL serum flasker. Hæld 60 mL medium i hver flaske.
- Boble N2 i medium for 30 min til at fjerne den opløste O2, ved hjælp af den lille slange tilsluttet N2 station beskrevet i trin 1. Placere en butyl-gummi prop på toppen af hver flaske, efterlader en lille åbning for at tillade den overskydende gas at forlade flasken.
Forsigtig: Skum kan danne mens bobler med N2. Justere luftstrømmen i overensstemmelse hermed for at undgå fremstilling af skum. - Crimp forsegle hver flaske med den tilberedt prop og en aluminium segl. Aluminium seglet sikrer, at flasken forbliver forseglet under resten af protokollen.
- Afbryde nåle og tynd slange fra N2 station og erstatte dem med rene nåle (1 tomme, ≤ 23 G). Justere ventiler af N2 tank, så en blid kontinuerlig strøm af gas afslutter tank (ca. 50 mL/min).
Bemærk: Nåle større end 23G kan forlade permanent unsealable huller i proppen. - Indsæt en af nålene tilsluttet N2 tank i en flaske af medium, gennem gummiprop. Straks indsætte en anden ren nålen i den samme flaske. Gentag dette trin for de andre flasker og lad N2 flow for ca 30 min til at erstatte luft i flaskerne af N2.
- Afbryde en flaske fra N2 station ved at fjerne den tilsvarende nål. Vent et par sekunder indtil trykket i medium flaske falder til atmosfæretryk og fjerne den anden nål. Gentag dette trin for alle resterende flasker.
Forsigtig: For at forhindre O2 genindføres flasker af vækstmediet efter trin 2.1.4, Udfør trin 2.1.4 - 2.1.8 i hurtig rækkefølge. Hvis alle flasker ikke kan tilsluttes N2 station på samme tid, gå videre med trin 2.1.4-2.1.8 for det første sæt af flasker og Gentag derefter disse trin for de resterende flasker. - Autoklave flasker. Lad dem køle ned til stuetemperatur natten over og gemme dem ved stuetemperatur bagefter.
- Forberede en 10 mM jern citratopløsning ved at tilføje 0.245 g af jern citrat 100 mL deioniseret vand. Varme og rør til at opløse, indtil en gul til orange klar løsning opnås. Autoklave løsning ved hjælp af en standard cyklus (mindst 15 min eksponering ved 121 ° C) og derefter gemme denne stamopløsning ved stuetemperatur i mørke.
- Forberedelse af flydende vækstmedium for AMB-1 og MS-1
- Forberede en 10 mM jern quinate løsning. Først 0,19 g quinic syre i 100 mL destilleret deioniseret vand opløses og derefter tilføje 0,27 g FeCl3.6H2O. rør til at opløse, indtil en mørk rød, klar løsning opnås. Autoklave løsningen et normalprogram (mindst 15 min eksponering ved 121 ° C).
Bemærk: Gemme jern quinate løsningen ved stuetemperatur i mørke som en steril stamopløsning. Kassér løsningen, når en bundfaldet bliver indlysende. - I et bægerglas indeholdende 1 L destilleret ionbyttet vand, tilføje følgende i rækkefølge under omrøring: 10,0 mL af vitamin supplement, 5,0 mL af trace mineraltilskud løsning, 0,68 g KH2PO4, 0.848 g af natrium succinat dibasiske hexahydrat, 0.575 g af di-natrium tartrat dihydrat, 0.083g natrium acetat trihydrat, 0,45 mL af 0,1% vandig Resazurin, 0,17 g af NaNO3, 0,04 g ascorbinsyre og 3,0 mL af en 10 mM PP. quinate stamopløsning.
Bemærk: Justere mængderne proportionalt hvis en mindre mængde af vækstmediet er nødvendig. En N2 station i stand til at boblende fem flasker på samme tid, som det bygget i trin 1 i denne protokol, forberede 300 mL af medium.
Forsigtig: Vitamin, spormineral og PP. quinate Stamopløsninger bør holdes sterilt. For at undgå kontaminering, brug standard steril teknik og steril pipette tips, når udlevering. Gemme mineral og vitamin løsningerne i køleskab ved 4 ° C. - Efter tilsætning af alle kemikalier, ph indstilles til 6,75 ved hjælp af 1 M NaOH-opløsning.
- Henvise til trin 2.1.3-2.1.9 for resten af protokollen.
- Forberede en 10 mM jern quinate løsning. Først 0,19 g quinic syre i 100 mL destilleret deioniseret vand opløses og derefter tilføje 0,27 g FeCl3.6H2O. rør til at opløse, indtil en mørk rød, klar løsning opnås. Autoklave løsningen et normalprogram (mindst 15 min eksponering ved 121 ° C).
- Forberedelse af halvfaste vækstmedium for MSR-1
- Forberede en 0,5 M fosfat buffer løsning pH 7,0 ved at opløse 3.362 g K2HPO4 og 4.178 g af KH2PO4 i 100 mL destilleret deioniseret vand. Check hvis pH 7,0 og justere pH lidt med KH2PO4 eller NaOH hvis nødvendigt. Gemme løsningen i et forseglet glasflaske (at foretrække frem for plastik for at undgå ilt exchange).
- Forberede 100 mL 0,02 M saltsyre løsning. Tilsættes 0,2 g FeCl2.4h2O til denne løsning og rør til at opløse for at opnå en 10 mM jern chloridopløsning. Gemme løsningen i mørke i et forseglet glasflaske.
- Forberede en 0,8 M natriumbikarbonat løsning ved at opløse 6.72 g NaHCO3 i 100 mL destilleret deioniseret vand. Gemme løsningen i et forseglet glasflaske.
- Autoklave løsninger udarbejdet i trin 2.2.1 - 2.2.3 et normalprogram (mindst 15 min eksponering ved 121 ° C). Gemme dem som steril stamopløsninger i mørke.
- I et bægerglas indeholdende 1 L destilleret ionbyttet vand, tilføje følgende i rækkefølge under omrøring: 5 mL af trace mineraltilskud løsning, 0,2 mL af 1% vandig resazurin opløsning, 0,4 g NaCl, 0,3 g NH4Cl, 0,1 g MgSO4.7H2 O, 0,05 g af CaCl2.2H2O, 1 g af natrium succinat, 0,5 g natriumacetat, 0,2 g gær extract og 1,6 g agar.
- Bægerglasset dækkes med alufolie og autoklave løsning parat i trin 2.3.5.
- Lige før slutningen af autoklave cyklus, forberede en frisk 4% L-cysteine· HCl· H2O løsning ved at opløse 0,8 g af L-cysteine· HCl· H2O i 20 mL deioniseret vand. Neutralisere løsning til pH 7,0 med 5 M NaOH-opløsning.
OBS: det er vigtigt, at opløsningen cystein er forberedt friske at undgå oxidation af cystein. Gemme den mineral løsning i køleskab ved 4 ° C. - Efter autoklavering, lad det medium køle ned til 50-60 ° C og bringe bægerglasset under flammen på en bunsenbrænder. Fjerne aluminiumsfolie og hurtigt tilføje følgende i rækkefølge, mens du forsigtigt omrøring: 0,5 mL af vitamin, 2,8 mL sterilt fosfat buffer stamopløsning, 3 mL sterilt jern chlorid stamopløsning, 1,8 mL sterilt natriumbikarbonat lager løsning og 10 mL af filter-steriliseret cystein løsning.
Bemærk: Justere mængderne proportionalt hvis en mindre mængde af vækstmediet er nødvendig. Det er normalt bekvemt at forberede en parti af 120 mL af medium.
Advarsel: Alle løsninger skal forblive sterilt til fremtidig brug. Udføre trin 2.3.8 ved hjælp af standard steril teknik og steril pipette tips når udlevering. - Efter tilsætning af alle kemikalier, overføre varme medium til 16 mL sterilt skruelåg Hungate rør. Overføres 12 mL af medium til hver tube og forsegle rør.
Forsigtig: For at undgå kontaminering, udføre trin 2.3.9 under flammen på en bunsenbrænder. Udføre det før agaren størkner, mens mediet er ved 40 ° C eller derover. - Forlade rør uforstyrret i flere timer indtil agaren størkner og OAI bliver synlige, materialisere som en lyserød til farveløs interface, ca 1-3 cm under overfladen af mediet.
Bemærk: Medium skal langsomt vende farveløs i røret. Mængden af tid for denne overgang er variabel og afhænger af mængden af O2 i første omgang opløst i mediet.
3. podning af MTB
Bemærk: Kulturer af stammer AMB-1, MS-1 og MSR-1 kan opnås kommercielt (Tabel af materialer).
Forsigtig: Udføre alle de følgende trin i sterile betingelser, i flammen på en bunsenbrænder.
- Podning af stammer MSR-1, AMB-1 og MS-1 i flydende substrat
- Forsegle en tom 125 mL serum flaske med butyl gummiprop og en aluminium crimp segl. Indsæt to nåle i flasken gennem proppen, og Tilslut en sprøjte parat som trin 1.7 til en af dem. Slut sprøjten til en cylinder af O2 gennem den samme type af slangen som den, der anvendes for N2 station.
- Lad O2 flow gennem flasken for ca 30 min, for at sikre, at alle luften i flasken er erstattet af O2. Fjerne begge nåle, giver mulighed for et lille overtryk i flasken og derefter autoklave. Give flaske til at køle ned til stuetemperatur før anvendelse.
Bemærk: For at spare tid, skal du udføre trin 3.1.1 og 3.1.2 i løbet af medium forberedelse og autoklave flaske sammen med medium eller bestanden løsninger. - Sterilisere toppe af propper af både frisk medium flasken og O2 flaske ved at anvende et par dråber af 70% ethanol opløsning oven på dem og passerer dem gennem flammen på en bunsenbrænder.
- Ved hjælp af en steril sprøjte og en nål, ekstrakt 1 mL O2 fra O2 flaske og overføre det til den friske mellemstore flaske. Sørg for, at nålen stramt passer på sprøjten under dette trin, at undgå enhver luft i sprøjten.
- Hvis du bruger inokulum fra en anden kultur dyrket i en glasflaske, sterilisere propper af både frisk medium flasken og ældre kultur flasken ved at anvende et par dråber af 70% ethanol opløsning oven på dem og passerer dem gennem flammen på en bunsenbrænder. Hvis du bruger inokulum fra et rør af frosne kultur, bare lad det varme op til stuetemperatur med røret forseglet under flammen på en bunsenbrænder.
- Hvis du bruger inokulum fra en anden kultur dyrket i en glasflaske, podes 1 mL af den ældre kultur i den friske medium. Hvis bruger inoculate fra en frossen bestand, podes kun 0,1 mL for at fortynde den glycerol eller dimethyl sulfoxid (DMSO) anvendes i forbindelse med nedfrysning. I begge tilfælde bruges en steril nål og en steril sprøjte.
- Inkuber kultur ved 32 ° C og podes det i frisk medium efter 4 til 7 dage.
- Podning af MSR-1 i O2 gradient halvfaste medium
- Kontroller, at røret af frisk medium viser en veldefineret OAI, materialiseret af en lyserød til farveløs grænseflade.
- Hvis inokulat kommer fra en anden O2 koncentration gradient halvfaste kultur, høste bakterier af pipettering 50 µL af kultur med en steril pipette tip placeret på bandet dannet af bakterier. Langsomt podes disse bakterier på OAI i den friske medium (pink/farveløs interface), at undgå at forstyrre grænsefladen. Hvis inokulat kommer fra en frossen kultur, fortsætte på samme måde med 100 µL af inokulum i stedet.
- Forsegle rør og lad bakterierne vokse mellem 25 ° C og 30 ° C. Overførsel til frisk medium ved hjælp af den samme procedure før bandet af bakterier når overfladen af mediet.
4. observation af bakterier
- Sterilisere prop af kultur flaske ved at anvende 70% ethanol opløsning på toppen af det og passerer flammen på en bunsenbrænder. For halvfaste medium, åbne rør under flammen på en bunsenbrænder. Brug en steril nål og en steril sprøjte til at udtrække bakterierne.
- Brug hængende drop metode8 til at sikre, at bakterier er både magnetiske og motile.
Bemærk: Fase kontrast mikroskopi giver gode resultater, men er ikke obligatorisk. Forstørrelser spænder fra 10 X 60 X er egnet. - Bruge transmissions elektronmikroskopi (TEM) til at observere den cellestruktur og magnetosomes i detaljer8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vellykket forberedelse af vækst-medier kan vurderes som følger. I slutningen af processen, klart løsninger (dvs., fri for enhver bundfaldet) skal opnås (dette er sandt for både den flydende medier og O2 gradient halvfaste medium). Et billede viser den forventede aspekt af MSR-1 flydende medium før podning kan ses i figur 2a. En vellykket O2 koncentration gradient halvfaste medium signaleres ved stiftelse af et OAI efter et par timer, angivet ved tilstedeværelsen af 1-3 cm pink medium øverst i røret (figur 3, tube A). Resten af substratet skal være farveløs. En all-pink medium før podning er et tegn på fuldstændig oxidation af resazurin og derfor af en mislykket forberedelse af O2 koncentration gradient.
Vellykket vækst i flydende substrat kan kontrolleres omkring 48 timer efter podning (eller efter et par dage hvis inokulat kommer fra en frossen kultur) blot ved at undersøge kulturerne for turbiditet ved hjælp af en lyskilde eller et spektrofotometer. Vellykket vækst er bekræftet af turbiditet at bevise, at bakterierne faktisk voksede (figur 2b). Hvis mediet forbliver klar efter 48 h, bakterier ikke er vokset. For en flydende medium kultur vokser normalt, kan tilstedeværelsen af bakterier syntese magnetosomes kontrolleres efter 48 h, ved at placere flasken med medium på en magnetisk røre pladen og lysende det med en lommelygte. På en lav omrøring hastighed, bør medium "flash", ser skiftevis mørkere og lysere afhængigt af retningen af den omrøring magnet med hensyn til placeringen af experimentalist. For en ikke-magnetisk forbliver intensiteten af det lys spredt af celler mod experimentalist konstant.
Vellykket vækst i halvfaste medium er indiceret ved dannelsen af et microaerophilic band af bakterier på grænsefladen pink/farveløs. På grund af forbruget af O2 af bakterier og ændringer i O2 gradient, vil bandet langsomt migrere til at følge OAI (figur 3, tube B).
Hængende drop metode muliggør observatør at kontrollere, at bakterier er både magnetiske og motile. Efter et par minutter, MTB bør koncentrere sig på kanten af den hængende drop, at bevise, at de aktivt svømme langs de magnetiske feltlinier (figur 4a). For at sikre at cellerne er magnetisk, vende retningen af magneten sidder ved siden af rullemenuen. Bakterierne bør begynde at svømme mod den modsatte kant (figur 4b). Endelig kan form af magnetosomes kontrolleres med TEM. Cuboctahedral krystaller af omkring 30-45 nm i diameter bør observeres9. Disse krystaller er normalt arrangeret i en lang kæde eller flere kortere kæder i arterne studerede her (figur 5).
Figur 1 : Illustration af N2 gasning station. (en) skematisk fremstilling. (b) billede af opsætningen. En vellykket station vil have i passende længde af store og tynde slanger, så slutningen af den tynde slanger beskrevet i trin 1.9 i protokollen forbliver nedsænket i mediet under trinnet gas boblende. Strømmen af gas bør også justeres på alle tidspunkter, for at sikre, at alle O2 er fjernet, og at mediet ikke løber. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Flasker af flydende vækstmediet før og efter podning. (en) klart MSR-1 medium før podning. (b) grumset MSR-1 medium efter 3 dage af succesfulde vækst. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Rør af O2 gradient halvfaste medium før (tube A) og 10 dage efter (tube B) podning. Bandet af bakterier i rør B er angivet med en rød pil.
Figur 4 : Typiske resultater af en hængende drop eksperimentere på 20 X forstørrelse ved hjælp af fase kontrast mikroskopi. (en) MTB svømme mod Sydpolen af en magnet og ophobes på grænsefladen væske/luft. (b) 1 min efter flipping magneten, de fleste celler har venstre synsfelt.
Figur 5 : TEM observation af en AMB-1 celle. Magnetosome kæder er markeret med røde pile. De to flageller er angivet med sorte pile.
Supplerende tabel 1. Venligst klik her for at downloade denne tabel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De særlige O2 koncentration krav i MTB gøre dem ikke-trivielt at vokse i laboratoriet. En afgørende trin i protokollen til flydende medium er den første fjernelse af alle O2 fra mediet for at kontrollere den endelige koncentration ved at tilføje en defineret rumfang af O2, lige før podning. Det har vist sig at MSR-1 vokser næsten fuldt aerobe betingelser, dog magnetisme celler reduceres drastisk. Resultaterne fra den samme undersøgelse viste, at stammer AMB-1 og MS-1 ikke vokse under fuldt aerobe forhold6. For halvfaste kultur af MSR-1, alle O2 er først nedsat med cystein løsning og derefter O2 koncentration gradient vises, fører til dannelsen af OAI. Hvis en kultur vokser ikke godt ikke eller er magnetisk, skal O2 koncentration være den første ting at tjekke.
Halvfaste vækstmediet er et interessant valg for isolere ukendte MTB eller voksende arter, som er meget følsomme over for begge O2 og redox forløb, da det sikrer eksistensen af stabilt forløb og giver mulighed for bakterier til at positionere sig på placering tilbyder de bedste vækstbetingelser. Flydende medium er mere praktisk at arbejde med hvor der er behov for større mængder (fx., til DNA-ekstraktion), eller når yderligere analyser skal udføres på celler (fx., magnetosome undersøgelser) da det giver mulighed for en lettere adskillelse af celler fra vækstmediet. Agar i halvfaste medium kan faktisk forstyrre cellen høst teknik.
I nogle kulturer blive cellerne undertiden ikke-motile, sandsynligvis på grund af spontane mutationer. Non-motile celler overleve og vokse i vækstmediet, da de ikke behøver at svømme for at finde næringsstoffer nødvendigt for deres overlevelse. Standard race-track metode10 kan derefter bruges til at genoprette en motile kultur, da kun motile celler kan svømme ned af banen. Tabet af den magnetiske fænotype kan også ske i kulturen, selvom O2 koncentration er optimal, igen på grund af spontane mutationer11. Den bedste løsning er i dette tilfælde at starte en ny kultur ved at vaccinere frosne bestande af vilde-type bakterier i frisk medium. Racerbane teknik kan alternativt også genopretning af en magnetisk kultur.
Det er vigtigt at undgå forurening af kulturen af andre organismer og de fleste af protokollen skal derfor udføres med steril teknik. Manipulere under flammen på en bunsenbrænder normalt giver tilfredsstillende resultater i at holde aseptiske forhold. Men, hvis kultur er vokset i en forurening-udsat miljø, ekstra forholdsregler bør tages, som arbejder i en laminar flow hætte når du forbereder medium og vaccinere bakterier. Det skal bemærkes, at risikoen for forurening er højere i halvfaste medium som rørene skal åbnes, hver gang cellerne er fjernet.
Disse protokoller aktiverer væksten af nok bakterier til at udføre mange forskellige typer af forsøg, som fysiske undersøgelser baseret på Optisk mikroskopi12,13, elektronmikroskopi imaging14,15, X-ray spectromicroscopy analyser16, genomisk og protein undersøgelser17,18. Hvis det er nødvendigt, kan højere koncentrationer af bakterier i suspension opnås ved centrifugering. Derudover kan magnetosomes udvindes og renset for yderligere programmer fra celle pellets eller tætte celle suspensioner fremstillet ved centrifugering19.
Vækst medier formuleringer er normalt baseret på de samme styrende principper (Se supplerende tabel 1 for en oversigt over listen af hver komponent i vækst medier rolle beskrevet her). En CO2-kilde skal være tilgængelige for bakterier, via organiske syrer (fx., succinat, acetat, tartrat, laktat) eller uorganiske forbindelser såsom bikarbonat. Valg af et egnet carbon kilde afhænger metabolismen af bakterierne. Nitrogen findes i DNA og proteiner og fosfor (DNA, membraner) er også påkrævet og leveret af NaNO3, NH4Cl og KH2PO4 i opskrifter beskrevet her. En buffer (HEPES, fosfat buffer) er nødvendige for at modstå pH-ændringer. Trace mineraltilskud løsning indeholder cofaktorer for enzymer og vitaminer kan bruges af bakterierne som coenzymer eller funktionelle grupper for visse enzymer. Gær ekstrakt og soja bønne pepton giver en kilde af aminosyrer og salte anvendes ved produktion af protein. Da MTB er redox følsomme, én eller flere reduktionsmiddel ofte skal føjes til mediet (fx., cystein, ascorbinsyre, laktat). En hovedkilde til jern (fx., jern citrat, jern quinate, jern chlorid) er nødvendig i medium for biomineralization. Endelig, en lille mængde af O2 er nødvendig for microaerophilic bakterier som terminal elektron acceptor. Forpligte anaerob MTB brug andre forbindelser såsom nitrat eller lattergas i stedet.
Den vigtigste begrænsning af disse protokoller er ingen garanti for, at de vil arbejde for andre arter af MTB. Stammer AMB-1, MS-1 og MSR-1 er alle ferskvand MTB og derfor de opskrifter, der er beskrevet i denne artikel kan ikke bruges til at dyrke marine magnetospirilla som Magnetospira thiophila stamme MMS-1, Magnetospira stamme QH-2 eller andre marine MTB, som kræver højere salt koncentration. For at dyrke andre stammer af MTB og til isolering af nye stammer, kan de generelle metoder præsenteres i denne artikel for både flydende og halvfaste medier bruges til at forberede medier med forskellige opskrifter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Vi takker Richard B. Frankel for hans hjælp med MTB kulturer, Adam P. Hitchcock og Xiaohui Zhu for deres støtte, mens oprettelse af MTB kulturer ved McMaster University og Marcia Reid til uddannelse og adgang til funktionen elektronmikroskopi (McMaster University, Det Sundhedsvidenskabelige Fakultet). Dette arbejde blev støttet af naturvidenskab og teknisk forskning Rådet i Canada (NSERC) og den os National Science Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AMB-1 | American Type Culture Collection (ATCC) | ATCC 700264 | |
| MS-1 | ATCC | ATCC 31632 | |
| MSR-1 | Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) | DSM 6361 | |
| Ferric citrate | Sigma-Aldrich | F3388-250G | |
| Trace mineral supplement | ATCC | MD-TMS | |
| KH2PO4 | EMD | PX1565-1 | |
| MgSO4.7 H2O | EMD | MX0070-1 | |
| HEPES | BioShop Canada Inc | HEP001.250 | |
| NaNO3 | Sigma-Aldrich | S5506-250G | |
| Yeast extract | Fischer scientific | DF210929 | |
| Peptone | Fischer scientific | DF0436-17-5 | |
| Potassium L-lactate solution (60%) | Sigma-Aldrich | 60389-250ML-F | |
| D-(-)-Quinic acid | Sigma-Aldrich | 138622 | |
| FeCl3.6H2O | Fischer scientific | I88-100 | |
| Vitamin supplement | ATCC | MD-VS | |
| Sodium succinate hexahydrate | Fischer scientific | S413-500 | |
| Sodium L-tartrate dibasic dihydrate | Sigma-Aldrich | 228729-100G | |
| Sodium acetate trihydrate | EMD | SX0255-1 | |
| Resazurin | Difco | 0704-13 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544-25G | |
| K2HPO4 | Caledon | 6620-1-65 | |
| FeCl2 .4H2O | Sigma-Aldrich | 44939-250G | |
| Sodium bicarbonate | EMD | SX0320-1 | |
| NaCl | Caledon | 7560-1 | |
| NH4Cl | EMD | 1011450500 | |
| CaCl2.2 H2O | EMD | 1023820500 | |
| Agar A | Bio Basic Canada Inc | FB0010 | |
| L-cysteine.HCl.H2O | Sigma-Aldrich | C7880-100G | |
| 1.0 mL syringes | Fischer scientific | B309659 | |
| 25G x 1 needles | BD | 305125 | |
| 125 mL serum bottles | Wheaton | 223748 | |
| 20 mm aluminum seals | Wheaton | 224223-01 | |
| 20mm E-Z Crimper | Wheaton | W225303 | |
| Butyl-rubber stoppers | Bellco Glass, Inc. | 2048-11800 | |
| Hungate tubes | Chemglass (VWR) | CLS-4208-01 | |
| Septum stopper, 13mm, Hungate | Bellco Glass, Inc. | 2047-11600 | |
| Glass culture Tubes | Corning (VWR) | 9826-16X | |
| Hydrochloric acid 36.5-38%, BioReagent | Sigma-Aldrich | H1758-100ML | 11.6 - 12 N |
References
- Blakemore, R. P. Magnetotactic bacteria. Annual Reviews in Microbiology. 36 (1), 217-238 (1982).
- Uebe, R., Schüler, D. Magnetosome biogenesis in magnetotactic bacteria. Nature Reviews Microbiology. 14 (10), 621 (2016).
- Faivre, D., Schuler, D. Magnetotactic bacteria and magnetosomes. Chemical Reviews. 108 (11), 4875-4898 (2008).
- Bazylinski, D. A., et al. Controlled biomineralization of magnetite (Fe3O4) and greigite (Fe3S4) in a magnetotactic bacterium. Applied and Environmental Microbiology. 61 (9), 3232-3239 (1995).
- Lefèvre, C. T., et al. Diversity of magneto-aerotactic behaviors and oxygen sensing mechanisms in cultured magnetotactic bacteria. Biophysical Journal. 107 (2), 527-538 (2014).
- Heyen, U., Schüler, D. Growth and magnetosome formation by microaerophilic Magnetospirillum strains in an oxygen-controlled fermentor. Applied Microbiology and Biotechnology. 61 (5-6), 536-544 (2003).
- Blakemore, R. P., Maratea, D., Wolfe, R. S. Isolation and pure culture of a freshwater magnetic spirillum in chemically defined medium. Journal of bacteriology. 140 (2), 720-729 (1979).
- Oestreicher, Z., Lower, S. K., Lin, W., Lower, B. H. Collection, isolation and enrichment of naturally occurring magnetotactic bacteria from the environment. Journal of Visualized Experiments. (69), (2012).
- Pósfai, M., Lefèvre, M., Trubitsyn, C., Bazylinski, D. A., Frankel, R. Phylogenetic significance of composition and crystal morphology of magnetosome minerals. Frontiers in Microbiology. 4, 344 (2013).
- Wolfe, R. S., Thauer, R. K., Pfennig, N. A 'capillary racetrack' method for isolation of magnetotactic bacteria. FEMS Microbiology Ecology. 3 (1), 31-35 (1987).
- Schübbe, S., et al. Characterization of a spontaneous nonmagnetic mutant of Magnetospirillum gryphiswaldense reveals a large deletion comprising a putative magnetosome island. Journal of Bacteriology. 185 (19), 5779-5790 (2003).
- Nadkarni, R., Barkley, S., Fradin, C. A comparison of methods to measure the magnetic moment of magnetotactic bacteria through analysis of their trajectories in external magnetic fields. PloS One. 8 (12), e82064 (2013).
- Waisbord, N., Lefèvre, C. T., Bocquet, L., Ybert, C., Cottin-Bizonne, C. Destabilization of a flow focused suspension of magnetotactic bacteria. Physical Review Fluids. 1 (5), 053203 (2016).
- Komeili, A., Vali, H., Beveridge, T. J., Newman, D. K. Magnetosome vesicles are present before magnetite formation, and MamA is required for their activation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (11), 3839-3844 (2004).
- Scheffel, A., et al. An acidic protein aligns magnetosomes along a filamentous structure in magnetotactic bacteria. Nature. 440 (7080), 110 (2006).
- Zhu, X., et al. Measuring spectroscopy and magnetism of extracted and intracellular magnetosomes using soft X-ray ptychography. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (51), E8219-E8227 (2016).
- Schüler, D. Molecular analysis of a subcellular compartment: the magnetosome membrane in Magnetospirillum gryphiswaldense. Archives of Microbiology. 181 (1), 1-7 (2004).
- Kolinko, I., et al. Biosynthesis of magnetic nanostructures in a foreign organism by transfer of bacterial magnetosome gene clusters. Nature Nanotechnology. 9 (3), 193 (2014).
- Hergt, R., et al. Magnetic properties of bacterial magnetosomes as potential diagnostic and therapeutic tools. Journal of Magnetism and Magnetic Materials. 293 (1), 80-86 (2005).
- Lefevre, C. T., et al. Novel magnetite-producing magnetotactic bacteria belonging to the Gammaproteobacteria. The ISME Journal. 6 (2), 440 (2012).
- Williams, T. J., Lefèvre, C. T., Zhao, W., Beveridge, T. J., Bazylinski, D. A. Magnetospira thiophila gen. nov., sp. nov., a marine magnetotactic bacterium that represents a novel lineage within the Rhodospirillaceae (Alphaproteobacteria). International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 62 (10), 2443-2450 (2012).
- Zhu, K., et al. Isolation and characterization of a marine magnetotactic spirillum axenic culture QH-2 from an intertidal zone of the China Sea. Research in Microbiology. 161 (4), 276-283 (2010).
