Summary
אנו מציגים הליך לגידול זנים שונים של Magnetospirillum שני סוגים שונים של מדיה צמיחה. Magnetospirillum gryphiswaldense זן MSR-1 גדל נוזלי והן O2 ריכוז הדרגתי מדיה מוצק למחצה ואילו זן מ magneticum השגריר-1 וזן magnetotacticum מ MS-1 גדלים במדיום נוזלי.
Abstract
Magnetotactic חיידקים הם גראם שליליים, תאי, בעיקר הימית אאוקריוטים בכל מקום בבתי גידול מים מתוקים ומי ים. הם מאופיינים על ידי היכולת שלהם biomineralize magnetosomes, אשר מגנטי בגודל ננומטר גבישי מגנטיט (Fe3או4) או greigite (Fe3S4) מוקף קרום bilayer השומנים, בהישג שלהם הציטופלסמה. עבור רוב החיידקים magnetotactic הידוע, magnetosomes הם התאספו כבול בתוך הציטופלסמה, ובכך היוועצות עם מומנט דיפול מגנטי קבוע על התאים ולגרום להם ליישר פסיבי עם שדות מגנטיים חיצוניים. בגלל תכונות אלה ספציפיים, חיידקים magnetotactic יש פוטנציאל גדול עבור יישומים מסחריים וטיפול רפואי. עם זאת, רוב המינים הינם microaerophilic וכוללים O2 ריכוז דרישות ספציפיות, הפיכתם קשה יותר לגדול באופן שגרתי יותר חיידקים רבים אחרים כגון Escherichia coli. כאן אנו מציגים פרוטוקולים מפורט לגידול שלושה זני חיידקים magnetotactic, שייכות הסוג Magnetospirillumלמדה נרחב ביותר. שיטות אלה מאפשרות שליטה מדויקת של2 O הריכוז נעשה זמין של חיידקים, על מנת להבטיח כי הם גדלים בדרך כלל, לסנתז magnetosomes. גידול חיידקים magnetotactic ללימודי באמצעות הליכים אלה אינו מחייב את experimentalist להיות מומחה במיקרוביולוגיה. שיטות כלליות שהוצגו במאמר זה עשוי לשמש גם כדי לבודד את התרבות חיידקים magnetotactic אחרים, אם כי סביר להניח כי ההרכב הכימי של מדיה צמיחה תצטרך להיות שונה.
Introduction
Magnetotactic חיידקים (MTB) מייצגים מגוון רחב של אאוקריוטים גראם שליליים בכל מקום גידול ימיים מים מתוקים ומי ים1. חיידקים אלה חולקים את היכולת לייצר מגנטי קריסטלים העשויים מגנטיט (Fe3או4) או greigite (Fe3S4), אשר ברוב המקרים לצרפן שרשראות בתוך התאים. זה מוטיב מבנית מסוימת היא בשל נוכחותם של מספר חלבונים ספציפיים מתנהג כאחד בציטופלסמה של החיידקים ועל הרקמות שמקיפות השומנים כל קריסטל2. כל קריסטל בודדים, שלה שלפוחית ממברנה שמסביב נקרא magnetosome, הוא החל בגודל של 30 עד 50 ננומטר מינים Magnetospirillum 3. בשל הסידור שרשרת של magnetosomes, חיידקים אלו בעלי רגע דיפול מגנטי קבוע שגורם להם ליישר פסיבי עם שדה מגנטי חיצוני. לכן, חיידקים אלו באופן פעיל לשחות לאורך קווי שדה מגנטי, מתנהג כמו מיקרו-מצפנים מרסיסים ככל הנראה כדי יותר לאתר ביעילות את התנאים הכי נוחים (למשל., ריכוז2 O) לצמיחה.
תכונה מעניינת של MTB היא יכולתם לווסת את הכימיה והן את קריסטלוגרפיה של גבישים magnetosome שלהם. רוב זני לייצר גבישים טוהר גבוהה יחסית של מגנטיט או greigite, למרות כמה biomineralize שני מינרלים4. בכל המקרים, החיידקים מסוגלים לשלוט במדויק הגודל והצורה של גבישים מחשבים בודדת מגנטי שלהם. זה מסביר מדוע כמות גדולה של מחקר שנערך לפתח הבנה טובה יותר של כיצד MTB לבצע תהליך זה ביומינרליזציה. הבנת תהליך זה עלול לאפשר את החוקרים חייט-לעשות nanocrystals מגנטי עבור יישומים רבים מסחרי ורפואי.
מכשול משמעותי מחקר מקיף על שחרור מהיר למוט אוכף כבר הקושי של גידול אותם במעבדה. רוב המינים, כולל הזנים להשתמש בעבודה זו, הן obligately microaerophilic כאשר גדל עם O2 כמו מקבל אלקטרון מסוף. זה מסביר מדוע חיידקים אלו מצויים לרוב באיזור המעבר בין תנאי oxic ואנאוקסיים (הממשק oxic-אנאוקסיים, OAI). זה מראה בבירור שיש MTB מדויק O2 ריכוז דרישות אשר מן הסתם צריך להילקח בחשבון כאשר להמציא צמיחה מדיה עבור אורגניזמים אלה. יתר על כן, קיים מגוון רחב של MTB מרמז כי זנים שונים צריך סוגים שונים של מעברי צבע כימיים וחומרים מזינים כדי להשיג גדילה אופטימלית.
בעבודה זו, אנו מתארים את שיטות הגוברת של MTB נרחב ביותר למד: Magnetospirillum magneticum (זן השגריר-1), מ magnetotacticum (MS-1) ו- gryphiswaldense מ' (MSR-1). המינים הללו phylogenetically שייך למחלקה Alphaproteobacteria ב שלקרוא פרוטאובקטריה , לוליינית ב מורפולוגיה הינם בעלי שוטון קוטבי בקצה אחד של התא. אנו מספקים את הפרוטוקולים לגידול זן MSR-1 נוזל והן O2 ריכוז הדרגתי מוצק למחצה מדיה, מבוסס על מתכונים שפורסמו בעבר בינוני5,6. אנו מציגים גם פרוטוקול מפורט לגידול זנים השגריר-1 ו- MS-1 במגנטי Spirillum צמיחה בינוני (MGSM) שונה7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. התקנה של התחנה2 N
הערה: לבחור הקוטר הפנימי של הצנרת כך הוא עשוי להיות מקושר למיכל הדלק בשכנוע המינימלי כך הצילינדר של מזרק פלסטיק 1 מ"ל בחוזקה מתאים לצנרת הזה. איור של N מלאה2 ההמתה תחנת מסופק באיור1.
- בבטחה להתקין מיכל גז N2 ליד ספסל שעליו יש מספיק מקום כדי להגדיר את התחנה2 N (באורך של 50 ס מ).
- להתחבר אל הטנק חתיכה של אבובים מספיק זמן כדי להגיע לאזור בה יבנו את התחנה. במידת הצורך, החל קלטות טפלון על הפלט של הטנק כדי למנוע דליפה כלשהי.
- כדי לבנות תחנת מסוגל מבעבע חמישה בקבוקים של מדיום בו זמנית, לחתוך ארבע חתיכות של צינורות של 5 ס מ אורך.
- להרכיב את החלקים של אבובים בקו עם 3 חלקים שלושה בצורת T אביזרי פלסטיק. חבר קצה אחד של קו זה היצירה של אבובים על הפלט של הטנקים2 N דרך הולם במיוחד בצורת T. להוסיף על המרפק 90° הולם בקצה השני.
- שימוש בקלטת כדי לצרף את המבנה מוט מתכת אופקי להציב כ 30 ס מ מעל הספסל.
- לחבר חמש חתיכות של אבובים (כ 20 ס מ אורך) כדי התוצרים חינם של ואביזרים המותקן 1.4 שלב.
- להסיר את בוכנות חמש מזרקים מפלסטיק 1.0 מ"ל. ולחתוך בסוף אלה מזרקים גדולים יותר (כלומר., אל מול צד המחט), לשמור רק את החלק בוגר. למלא מזרקים אלה עם כותנה, לא חזק מדי.
- הכנס המזרקים את החלקים האנכיים הארוכים 20 ס מ של אבובים ולהשתמש סבון ומים כדי להבטיח שיש זליגת כאשר N2 זורם.
- הסר את הפקקים של 25 גרם 5 מחטים (0.5 מ"מ x 25 מ"מ), להכניס מחטים אלה החלקים 10 ס"מ צינור דק. ודא כי המחטים בחוזקה להשתלב הצנרת.
זהירות: יש סיכון של דקירה במהלך שלב זה. לעשות את זה לאט ובזהירות. - לצרף את המחטים מוכנים ב 1.9 שלב? המזרקים של התחנה2 N. להבטיח כי N2 הוא זורם דרך כל חמש שורות ולשמור את התחנה על המתנה.
2. צמיחה הכנה בינונית
הערה: זה אפשרי להתאים את כמות בינונית מוכן, כמוסבר בשלבים 2.1.2, 2.2.2 ו 2.3.8. כמות מים וכימיקלים משמש רק צריך להיות מותאם באופן פרופורציונלי. התפקיד של כל הרכיבים בינונית המתואר משלים טבלה 1.
- הכנה של מדיום הגידול נוזלי MSR-1
- להכין פתרון ציטראט ferric 10 מ מ על-ידי הוספת 0.245 גר' ציטראט ferric 100 מ של מים מזוקקים יונים. מחממים ומערבבים עד התמוססות, עד צהוב לכתום בהיר מתקבל פתרון. אוטוקלב הפתרון באמצעות תקן מחזור (לפחות 15 דקות חשיפה ב 121 מעלות צלזיוס), ולאחר מכן אחסן פתרון מניות זה בטמפרטורת החדר בחושך.
הערה: לבטל את הפתרון ציטראט ferric כאשר התמיסה הופך להיות ברור. - ב גביע המכיל 1 ליטר של מים מזוקקים יונים, להוסיף את הפעולות הבאות לפי הסדר תוך כדי ערבוב: 1.0 מ"ל של המינרל מעקב תוספת פתרון, 0.1 גר'2פו ח'4, 0.15 גרם MgSO4.7 H2O 2.38 גר' HEPES, g 0.34 של ננו3 , 0.1 גר' שמרים לחלץ, 3.0 גרם סויה שעועית peptone, mL 4.35 של אשלגן לקטאט (60% w/w פתרון), 5 מ ל 10 מ מ Fe(III) ציטראט פתרון מניות.
הערה: להתאים את הכמויות באופן פרופורציונלי אם כמות קטנה יותר של מדיום הגידול יש צורך. עבור תחנה2 N מסוגל מבעבע חמישה בקבוקים באותו זמן, כמו האחד נבנה בשלב 1 של פרוטוקול זה, להכין 300 מ"ל של מדיום.
התראה: לעקוב אחר מינרל, מניות ציטראט Fe(III) הפתרונות צריכים להישמר סטרילי. כדי למנוע זיהום, להשתמש סטרילי טכניקה סטנדרטית כאשר משתמשים בהם (להבה, פתוח צמרות של בקבוקי באמצעות מבער בונזן) ומשתמשים פיפטה סטרילי טיפים dispensing. חנות הפתרון מינרלים במקרר-4 מעלות צלזיוס. - לאחר התוספת של כל הכימיקלים, להתאים את רמת ה-pH אל 7.0 עם פתרון NaOH 1 מ'. לוותר על המדיום המוכנים באופן טרי לתוך בקבוקים סרום 125 מ. יוצקים 60 מיליליטר במדיום כל בקבוק.
- הבועה N2 לתוך האמצעי למשך 30 דקות להסיר את O מומס2, באמצעות לאורך צינור קטן מחובר לתחנת2 N המתוארת בשלב 1. המקום פקק גומי בוטיל על כל בקבוק, משאיר פתח קטן כדי לאפשר את הגז עודף לצאת את הבקבוק.
התראה: קצף שעלולים להיווצר תוך בעבוע עם N2. להתאים את זרימת הגז בהתאם כדי למנוע ייצור קצף. - Crimp חותם כל בקבוק הודות את פקק מוכן של אלומיניום. החותם אלומיניום מבטיחה כי הבקבוק נשאר אטום בשאר בפרוטוקול.
- נתק את המחטים לאורך צינור דק מתחנת2 N ולהחליף אותם עם מחטים נקיות (1 אינטש, ≤ 23 גרם). להתאים את השסתומים של הטנקים2 N כך עדין זרימה רצופה של גז היציאות למיכל (כ- 50 מ לדקה).
הערה: מחטים גדול יותר 23 גרם ניתן להשאיר חורים unsealable קבע הפקק. - הכנס לאחת המחטים מחובר למיכל2 N לתוך בקבוק בינוני, דרך פקק הגומי. מיד להוסיף עוד מחט נקי לתוך הבקבוק זהה. חזור על שלב זה עבור הבקבוקים אחרים ולתת זרימה2 N במשך כ 30 דקות להחליף את האוויר הבקבוקים על ידי N2.
- נתק בקבוק אחד מתחנת2 N על-ידי הסרת את המחט המתאימים. לחכות כמה שניות עד הלחץ בבקבוק של מדיום מקטין הלחץ האטמוספרי, הסר את המחט השניה. חזור על שלב זה עבור כל הבקבוקים הנותרים.
התראה: כדי למנוע להזין מחדש את הבקבוקים של מדיום הגידול לאחר שלב 2.1.4 O2 , בצע שלבים 2.1.4 - 2.1.8 תגובה על רצף מהיר. אם אין אפשרות לחבר כל הבקבוקים לתחנה2 N באותו זמן, להמשיך עם צעדים 2.1.4-2.1.8 על הסט הראשון של בקבוקים, לאחר מכן חזור על שלבים אלה עבור הבקבוקים הנותרים. - אוטוקלב הבקבוקים. . תן להם מגניב עד בטמפרטורת החדר למשך הלילה ולאחסן אותם בטמפרטורת החדר לאחר מכן.
- להכין פתרון ציטראט ferric 10 מ מ על-ידי הוספת 0.245 גר' ציטראט ferric 100 מ של מים מזוקקים יונים. מחממים ומערבבים עד התמוססות, עד צהוב לכתום בהיר מתקבל פתרון. אוטוקלב הפתרון באמצעות תקן מחזור (לפחות 15 דקות חשיפה ב 121 מעלות צלזיוס), ולאחר מכן אחסן פתרון מניות זה בטמפרטורת החדר בחושך.
- הכנה של מדיום הגידול נוזלי השגריר-1 ו- MS-1
- להכין פתרון quinate ferric 10 מ מ. תחילה להמיס g 0.19 חומצה הקואינית 100 מ של מים מזוקקים יונים ולאחר מכן להוסיף 0.27 g של FeCl3.6H2O. מערבבים כדי להמיס, עד מתקבל פתרון וברור, אדום כהה. אוטוקלב הפתרון באמצעות מחזור רגיל (לפחות 15 דקות חשיפה ב 121 מעלות צלזיוס).
הערה: אחסן את הפתרון quinate ferric בטמפרטורת החדר בחושך כפתרון מניות סטרילי. למחוק את הפתרון כאשר התמיסה הופך להיות ברור. - ב גביע המכיל 1 ליטר של מים מזוקקים יונים, להוסיף את הפעולות הבאות לפי הסדר תוך כדי ערבוב: מל 10.0 של הפתרון תוספת ויטמין, mL 5.0 של הפתרון תוספת מינרלים מעקב, 0.68 גר'2פו ח'4, 0.848 גר' נתרן succinate dibasic hexahydrate, 0.575 גר' נתרן di tartrate וגופרית והרכבו 0.083g של סודיום אצטט trihydrate, mL 0.45 של 0.1% Resazurin מימית, g 0.17 של ננו3, 0.04 גרם של חומצה אסקורבית ו- 3.0 מ ל 10 מ מ פתרון מניות quinate Fe(III).
הערה: להתאים את הכמויות באופן פרופורציונלי אם כמות קטנה יותר של מדיום הגידול יש צורך. עבור תחנה2 N מסוגל מבעבע חמישה בקבוקים באותו זמן, כמו האחד נבנה בשלב 1 של פרוטוקול זה, להכין 300 מ"ל של מדיום.
התראה: ויטמין, מינרל מעקב ופתרונות Fe(III) quinate מניות צריך להישמר סטרילי. כדי למנוע זיהום, השתמש סטנדרטי סטרילי טכניקה ועצות פיפטה סטרילי כאשר מחלק. לאחסן את הפתרונות מינרלים וויטמינים במקרר-4 מעלות צלזיוס. - לאחר התוספת של כל הכימיקלים, להתאים את רמת ה-pH ל 6.75 באמצעות פתרון NaOH 1 מ'.
- עיין 2.1.3-2.1.9 צעדים למשך שארית בפרוטוקול.
- להכין פתרון quinate ferric 10 מ מ. תחילה להמיס g 0.19 חומצה הקואינית 100 מ של מים מזוקקים יונים ולאחר מכן להוסיף 0.27 g של FeCl3.6H2O. מערבבים כדי להמיס, עד מתקבל פתרון וברור, אדום כהה. אוטוקלב הפתרון באמצעות מחזור רגיל (לפחות 15 דקות חשיפה ב 121 מעלות צלזיוס).
- הכנה של מדיום הגידול מוצק למחצה MSR-1
- להכין pH פתרון 7.0 מאגר פוספט 0.5 M על ידי המסת g 3.362 של K-2-HPO-4 ו- g 4.178 של ח'2PO4 ב 100 מ של מים מזוקקים יונים. לבדוק אם ה-pH 7.0 ולהתאים את ה-pH מעט עם ח'2PO4 או NaOH במידת הצורך. אחסן את הפתרון בבקבוק זכוכית אטום (עדיף מפלסטיק כדי למנוע חילופי חמצן).
- הכן 100 מ של פתרון הידרוכלורית מ' 0.02 נקודות. הוספת 0.2 גר' FeCl2.4H2O הפתרון ומערבבים כדי להמיס על מנת לקבל פתרון כלוריד ברזל 10 מ מ. אחסן את הפתרון בחושך בבקבוק זכוכית אטום.
- להכין פתרון סודיום ביקרבונט 0.8 מ' על ידי המסת 6.72 גר' NaHCO3 ב- 100 מ של מים מזוקקים יונים. אחסן את הפתרון בבקבוק זכוכית אטום.
- אוטוקלב הפתרונות שהוכנו בשלבים 2.2.1 - 2.2.3 באמצעות מחזור רגיל (לפחות 15 דקות חשיפה ב 121 מעלות צלזיוס). לאחסן אותם פתרונות מניות סטרילי בחושך.
- ב גביע המכיל 1 ליטר של מים מזוקקים יונים, להוסיף את הפעולות הבאות לפי הסדר תוך כדי ערבוב: 5 מ של הפתרון תוספת מינרלים מעקב, 0.2 מ"ל של 1% פתרון resazurin מימית, 0.4 g של NaCl, 0.3 g של NH4קלרנית, 0.1 גר' MgSO4.7H2 O, 0.05 גרם CaCl2.2H2O, 1 g של נתרן succinate, 0.5 g של סודיום אצטט, 0.2 גר' שמרים לחלץ ו- 1.6 גר' אגר.
- מכסים את. הספל עם רדיד אלומיניום ו אוטוקלב הפתרון המוכן בשלב 2.3.5.
- לפני הסיום של מחזור החיטוי, להכין טרי a 4% L-cysteine· HCl· H2O הפתרון על ידי המסת 0.8 גר' L-cysteine· HCl· H2O ב- 20 מ ל מים מזוקקים יונים. לנטרל את פתרון ה-pH 7.0 עם פתרון NaOH 5 מ'.
שים לב: חשוב כי הפתרון ציסטאין מוכן טרי כדי למנוע חמצון של ציסטאין. חנות הפתרון מינרלים במקרר-4 מעלות צלזיוס. - לאחר autoclaving, ומצננים בינונית עד 50 – 60 מעלות צלזיוס, להביא את. הספל תחת להבת מבער בונזן. להסיר את רדיד האלומיניום, להוסיף במהירות את הפעולות הבאות לפי סדר תוך ערבוב בעדינות: 0.5 מ של הפתרון ויטמין, 2.8 מ"ל של פוספט סטרילי מאגר מניות הפתרון, 3 מ"ל של פתרון מניות סטרילי ברזל כלוריד, mL 1.8 של המניה סטרילי סודיום ביקרבונט פתרון ו- 10 מ"ל של ציסטאין מחוטא-מסנן פתרון.
הערה: להתאים את הכמויות באופן פרופורציונלי אם כמות קטנה יותר של מדיום הגידול יש צורך. זה בדרך כלל נוח להכין מנה של 120 מ של מדיום.
שים לב: כל הפתרונות חייבת להישאר סטרילי לשימוש עתידי. בצע את שלב 2.3.8 סטרילי טכניקה סטנדרטית באמצעות פיפטה סטרילי טיפים כאשר מחלק. - לאחר התוספת של כל הכימיקלים, להעביר המדיום חמים לתוך 16 mL בורג סטרילי-קאפ הנגייט צינורות. להעביר 12 מ של המדיום לתוך כל שפופרת ויסגור את הצינורות.
התראה: כדי למנוע זיהום, בצע את שלב 2.3.9 תחת להבת מבער בונזן. לבצע אותו לפני אגר מתמצק, אמנם המדיום ב 40 מעלות צלזיוס ומעלה. - יוצאים הצינורות ללא הפרעה במשך כמה שעות עד אגר עפור והופך OAI לכאורה, להתממש כמו ורוד לממשק השקופה, כ 1 עד 3 ס מ מתחת לפני השטח של המדיום.
הערה: צריך המדיום לאט לפנות השקופה בצינור. כמות הזמן הנדרשת עבור המעבר הזה הוא משתנה ותלוי כמות O2 בתחילה מומס המדיום.
3. חיסון של MTB
הערה: התרבויות של זנים השגריר-1, MS-1 ו- MSR-1 ניתן להשיג מסחרית (טבלה של חומרים).
שים לב: בצע את כל השלבים הבאים בתנאים סטריליים, תחת להבת מבער בונזן.
- חיסון של זנים MSR-1, השגריר-1 ו- MS-1 בינוני נוזלי
- חותם בקבוק הסרום ריק 125 מ עם פקק גומי בוטיל וסיל crimp אלומיניום. להוסיף שתי מחטים דרך הפקק הבקבוק, וחבר מזרק מוכן כמו שלב 1.7 לאחד מהם. לחבר את המזרק גליל של O2 באמצעות אותו סוג של צינורות כמו זו ששימשה תחנת2 N.
- תנו O2 לזרום דרך הבקבוק למשך כ- 30 דקות, על מנת להבטיח כי כל האוויר בבקבוק מוחלף על ידי O2. הסר את שני מחטים, המאפשרות הלחץ קלה הבקבוק ולאחר מכן אוטוקלב. לאפשר את הבקבוק להתקרר לטמפרטורת החדר לפני השימוש.
הערה: כדי לחסוך זמן, יש לבצע שלבים 3.1.1 ו- 3.1.2 תוך כדי הכנה בינונית אוטוקלב הבקבוק יחד עם המדיום או הפתרונות מניות. - לעקר את החלק העליון של פקקים של הבקבוק בינוני טריים וגם את הבקבוק2 O על ידי החלת כמה טיפות של 70% אתנול פתרון מעליהם הכנסתם להבת מבער בונזן.
- באמצעות מחט סטרילית מחט, לחלץ 1 מ"ל של O2 מהבקבוק2 O ולהעביר אותו לתוך הבקבוק בינוני טריים. ודא כי המחט בחוזקה מתאים על המזרק במהלך שלב זה כדי למנוע אוויר במזרק.
- אם משתמש את inoculum מתרבות אחרת גדל בבקבוק זכוכית, לעקר את פקקים של הבקבוק בינוני טריים וגם את הבקבוק תרבות מבוגר על-ידי החלת כמה טיפות של 70% אתנול פתרון מעליהם הכנסתם להבת מבער בונזן. אם משתמש את inoculum של שפופרת של תרבות קפוא, עזוב את זה חם תלוי בטמפרטורת החדר עם הצינור אטום תחת להבת מבער בונזן.
- אם משתמש את inoculum מתרבות אחרת גדל בבקבוק זכוכית, לחסן 1 מ"ל של תרבות מבוגר אל המדיום טריים. אם משתמש את inoculate של מניה קפוא, לחסן רק 0.1 מ"ל כדי לדלל את גליצרול או דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד) המשמשים בתהליך ההקפאה. בשני המקרים, השתמש מחט סטרילית ומזרק סטרילי.
- דגירה התרבות ב 32 ° C, לחסן אותו לתוך בינוני טריים לאחר 4-7 ימים.
- חיסון של MSR-1 בינוני הדרגתיות מוצק למחצה של2 O
- ודא כי הצינור של מדיום חדש מציג OAI מוגדרים היטב, ותתבטא מאת ורוד לממשק השקופה.
- Inoculum בא מתרבות אחרת O2 ריכוז הדרגתי מוצק למחצה, לקצור את החיידקים מאת pipetting 50 µL של התרבות עם טיפ פיפטה סטרילי המוטלות על הלהקה שהוקמה על ידי החיידקים. לאט לאט לחסן חיידקים אלו-OAI במדיום טריים (ממשק חסר צבע/ורוד), הימנעות מטריד את הממשק. Inoculum בא מתרבות קפוא, המשך באותו אופן עם 100 µL של inoculum במקום.
- לאטום את צינור ולתת שהחיידקים לגדול בין 25 ° C 30 ° C. העברת לתוך בינוני טריים באמצעות ההליך אותו לפני הלהקה של חיידקים מגיע לפני השטח של המדיום.
4. תצפית של חיידקים
- לחטא את הפקק של הבקבוק תרבות על-ידי החלת הפתרון אתנול 70% מעליו והעברתה דרך להבת מבער בונזן. בינוני מוצק למחצה, לפתוח את הצינור מתחת להבת מבער בונזן. להשתמש מחט סטרילית ומזרק סטרילי כדי לחלץ את החיידקים.
- שימוש התליה ירידה שיטה8 כדי להבטיח כי החיידקים מגנטי וגם תאי.
הערה: שלב ניגודיות מיקרוסקופ נותן תוצאות מעולות אך אינה חובה. הגדלה ועד 10 X 60 X מתאימים. - השתמש במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים (TEM) כדי לבחון את מבנה התא, magnetosomes את פירוט8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הכנה מוצלחת של התקשורת גדילה יכול להידרש כדלקמן. בסופו של התהליך, נקה פתרונות (כלומר., ללא כל המשקע) צריכה להתקבל (זה נכון גם לגבי התקשורת נוזלי וגם O2 הדרגתי מוצק למחצה המדיום). תמונה הצגת ההיבט הצפוי של MSR-1 בינוני נוזלי לפני חיסון ניתן לראות באיור 2a. מוצלח O2 ריכוז הדרגתי מוצק למחצה מדיום הוא אותת על ידי היווצרות של OAI אחרי כמה שעות, שמסומן על ידי הנוכחות של 1 – 3 ס מ של מדיום ורוד בחלק העליון של הצינור (איור 3, שפופרת A). שאר המדיום צריך להיות נטול צבע. בינוני כל-ורוד לפני חיסון היא סימן של חמצון שלם של resazurin ולכן הכנה לא מוצלח של המילוי ההדרגתי ריכוז של2 O.
צמיחה מוצלחת במדיום נוזלי ניתן לבדוק כ 48 שעות לאחר חיסון (או לאחר מספר ימים אם inoculum באה מתרבות קפואים) פשוט על-ידי בחינת התרבויות עבור עכירות באמצעות מקור אור או ספקטרופוטומטרים. מוצלח צמיחה אושר על ידי עכירות להוכיח כי החיידק גדל למעשה (איור 2b). אם המדיום נשאר נקי לאחר 48 שעות, החיידק לא גדלו. על תרבות בינוני נוזלי גוברת בדרך כלל, הנוכחות של חיידקים לסנתז magnetosomes ניתן לבדוק לאחר 48 שעות על-ידי הצבת את בקבוק בינוני על צלחת מגנטית מערבבים ועל ידי מאירה אותו עם פנס. במהירות נמוכה מלהיב, המדיום צריך "פלאש", מחפש לסירוגין כהה ובהיר יותר בהתאם הכיוון של המגנט מלהיב לגבי המיקום של experimentalist. תרבות מגנטיים, עוצמת האור מפוזר על ידי התאים לכיוון experimentalist ישאר קבוע.
גידול מוצלח של בינוני מוצק למחצה מסומן על ידי היווצרות של להקה microaerophilic של חיידקים-הממשק ורוד/השקופה. בשל צריכת של O2 על ידי החיידקים והשינויים במעבר הצבע2 O, הלהקה לאט להגר בצע את OAI (איור 3, הרכבת התחתית B).
התליה ירידה בשיטה מאפשר לצופה לבדוק כי החיידקים הם מגנטיים והן תאי. אחרי כמה דקות, MTB להתרכז בקצה הירידה לתלייה, להוכיח כי הם פעיל לשחות לאורך קווי השדה המגנטי (איור 4a). כדי להבטיח כי התאים מגנטי, להפוך את הכיוון של המגנט יושב ליד הירידה. החיידקים צריכים להתחיל שחייה לכיוון הקצה הנגדי (איור 4b). לבסוף, ניתן לבדוק את צורת magnetosomes עם TEM. Cuboctahedral גבישים של 30 – 45 ננומטר בקוטר להתייחס9. גבישים אלו מסודרים בדרך כלל שרשרת אחת ארוכה או שרשראות קצרות מרובות במינים למד פה (איור 5).
איור 1 : איור של N2 ההמתה תחנת. () הסמלית. (b) תמונה של ההתקנה. תחנת מוצלח יהיה אורך צינור דק וגדול המתאים כך סוף לאורך צינור דק המתוארים שלב 1.9 של הפרוטוקול נשאר שקוע בפעילות המדיום במהלך השלב מבעבע גז. זרימת הגז צריך גם להיות הניתנים לשינוי בכל עת, על מנת להבטיח כי כל O2 מוסר כי המדיום שלא יישפך. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 : בקבוקי מדיום הגידול נוזלי לפני ואחרי חיסון. () ברור MSR-1 בינוני לפני חיסון. (b) MSR עכורים-1 בינוני אחרי 3 ימים של גידול מוצלח. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 : הצינורות של O2 מעבר צבע מוצק למחצה בינונית לפני (שפופרת A), עשרה ימים לאחר חיסון (הרכבת התחתית B). הלהקה של חיידקים בצינור B מסומן על ידי חץ אדום.
איור 4 : תוצאות טיפוסי טיפה תלוי הניסוי בגיל 20 X הגדלה באמצעות מיקרוסקופ לעומת זאת שלב. () MTB לשחות לכיוון הקוטב הדרומי של מגנט ולצבור על הממשק נוזלי/אוויר. (b) 1 דקות לאחר היפוך המגנט, רוב התאים הותירו את שדה הראיה.
איור 5 : התבוננות TEM של השגריר-1 תא. שרשראות Magnetosome מסומנים באמצעות חצים אדומים. שני שוטון מסומנים באמצעות חיצים שחורים.
משלים טבלה 1- אנא לחץ כאן כדי להוריד את השולחן הזה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
O2 ריכוז דרישות ספציפיות של MTB להפוך אותם לא טריוויאלי לגדול במעבדה. צעד. מפתח של הפרוטוקול עבור המדיום הנוזלי היא הסרת הראשונית של כל O2 של המדיום כדי לשלוט הריכוז הסופי על-ידי הוספת אמצעי מובהק של O2, ממש לפני חיסון. הוכח כי MSR-1 גדל בתנאים כמעט במלואה אירובי, עם זאת, המגנטיות של התאים התקצר. התוצאות של אותו מחקר הראה כי זנים השגריר-1 ו- MS-1 לא צומחים תחת תנאים אירובי מלא6. עבור התרבות מוצק למחצה של MSR-1, O כל2 קודם מופחתת לפי הפתרון ציסטאין ולאחר מכן מעבר הצבע ריכוז של2 O, שמוביל להיווצרות OAI. אם תרבות לא גדל טוב או לא מגנטי, ריכוז2 O צריך להיות הדבר הראשון שצריך לבדוק.
מדיום הגידול מוצק למחצה היא בחירה מעניינת עבור בידוד MTB לא ידוע או גידול של מינים רגישים מאוד שני O2 וחמצון-חיזור מעברי צבע, כפי שהוא מבטיח את קיומו של מעברי צבע יציב מאפשר לחיידקים למקם את עצמם- המיקום המציע את התנאים הטובים ביותר של צמיחה. בינוני נוזלי נוח יותר לעבוד עם מתי נדרשים אמצעי אחסון גבוה יותר (למשל., להפקת DNA), או כאשר ניתוח נוסף צריך להתנהל על התאים (למשל., מחקרים magnetosome) שכן היא מאפשרת להפרדה קלה יותר התאים מ מדיום הגידול. אגר במדיום מוצק למחצה עשוי אכן להפריע התא קציר טכניקה.
בתרבויות מסוימות, התאים לפעמים להפוך ללא-תאי, ככל הנראה עקב מוטציות ספונטניות. בתאים שאינם תאי לשרוד ולצמוח במצע הגידול, כיוון שהם לא צריכים לשחות כדי למצוא חומרים מזינים הדרושים להישרדות שלהם. שיטת המירוץ במסלול רגיל10 ואז ניתן לשחזר תאי תרבות מאז רק תאי תאים יכולים לשחות למטה במסלול המירוץ. אובדן פנוטיפ מגנטי יכול להתרחש גם בתרבות, אפילו אם ריכוז2 O היא אופטימלית, שוב עקב מוטציות ספונטניות11. הפתרון הטוב ביותר במקרה זה היא להתחיל תרבות חדשה מאת מזריקים קפוא מניות של פראי-סוג חיידקים לתוך בינוני טריים. לחלופין, הטכניקה המירוץ במסלול באפשרותך גם לאפשר ההתאוששות של תרבות מגנטי.
זה חיוני כדי למנוע זיהום של התרבות על ידי אורגניזמים אחרים, ולכן רוב הפרוטוקול חייב להתבצע באמצעות טכניקות סטרילי. מניפולציה תחת להבת מבער בונזן בדרך כלל נותן תוצאות משביעות רצון לשמור על תנאים אספטי. עם זאת, אם התרבות היא גדלה בסביבה נוטה זיהום, אמצעי זהירות נוספים צריך לקחת, כגון עבודה תא למינארי בעת הכנת המדיום, מזריקים החיידקים. יצוין, כי הסיכון של זיהום הוא גבוה בינוני מוצק למחצה כמו הצינורות צריך לפתוח כל פעם התאים יוסרו.
פרוטוקולים אלה לאפשר את הצמיחה של חיידקים מספיק כדי לבצע סוגים שונים של ניסויים, כגון מחקרים פיזי המבוסס על12,מיקרוסקופ אופטי13, מיקרוסקופ אלקטרונים הדמיה14,15, רנטגן spectromicroscopy ניתוחים16, גנומית ו חלבון מחקרים17,18. במידת הצורך, ריכוז גבוה של חיידקים ההשעיה יכולה להיות מושגת על ידי צנטריפוגה. בנוסף, magnetosomes יכול להיות מופק וטיהרו לאפליקציות נוספות תא כדורי או השעיות תא עבות מתקבל על ידי צנטריפוגה19.
צמיחה מדיה ניסוחים מבוססים בדרך כלל על אותם עקרונות השלטון (ראה טבלה 1 משלים עבור סיכום של הרשימה של התפקיד של כל רכיב בתקשורת צמיחה המתוארים כאן). מקור הפחמן חייב להיות זמין של חיידקים, באמצעות חומצות אורגניות (למשל., succinate, אצטט, tartrate לקטט) או חומרים אורגניים נדיפים כגון ביקרבונט. הבחירה של מקור פחמן מתאים תלוי חילוף החומרים של החיידק. חנקן נוכח DNA, חלבונים ו זרחן (דנ א, ממברנות) נדרשים גם ומסופקים על ידי NaNO3, NH4קלרנית וח'2פו4 המתכונים המתוארים כאן. מאגר (HEPES, מאגר פוספט) יש צורך להתנגד לשינויים pH. הפתרון תוספת מינרלים מעקב מכילה cofactors עבור אנזימים, הויטמינים יכול לשמש על ידי החיידקים קואנזימים או קבוצות פונקציונליות אנזימים מסוימים. תמצית שמרים שעועית סויה peptone מספקים מקור של חומצות אמינו ומלח לייצור חלבונים. מאז שחרור מהיר למוט אוכף רגיש חמצון-חיזור, אחד או כמה צמצום סוכנים לעיתים קרובות להתווסף המדיום (למשל., ציסטאין, חומצה אסקורבית, לקטט). המקור העיקרי של ברזל (למשל., ציטראט ferric, ferric quinate, ברזל כלוריד) נדרש האמצעי עבור ביומינרליזציה. לבסוף, כמות קטנה של O2 נדרש עבור חיידקים microaerophilic בתור מקבל אלקטרון מסוף. מחייבים שימוש MTB אנאירובית תרכובות אחרות כגון חנקתי או תחמוצת החנקן במקום.
המגבלה העיקרית של פרוטוקולים אלה היא שאין שום ערובה לכך שהם יעבדו עבור מינים אחרים של שחרור מהיר למוט אוכף. זנים השגריר-1, MS-1 ו- MSR-1 MTB כל מים מתוקים, ולכן אינו יכול לשמש את המתכונים המתוארות במאמר זה לגדול magnetospirilla ימיים כגון Magnetospira thiophila זן MMS-1, Magnetospira זן QH-2 או MTB ימיים אחרים, אשר דורשים ריכוז המלח גבוה. עם זאת, לגדל זנים אחרים של שחרור מהיר למוט אוכף, ועבור בידודו של זנים חדשים, ניתן את שיטות כלליות שהוצגו במאמר זה לקבלת מדיה נוזלי ומוצק למחצה כדי להכין מדיה עם מתכונים שונים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
אנו מודים ריצ'רד ב' פרנקל לעזרתו עם שחרור מהיר למוט אוכף תרבויות, אדם עמ' היצ'קוק, ז'ו Xiaohui על תמיכתם תוך הגדרת התרבויות MTB באוניברסיטת מקמסטר, וריד מרשה הכשרה וגישה אל המתקן מיקרוסקופ אלקטרונים (אוניברסיטת מקמסטר, הפקולטה למדעי הבריאות). עבודה זו נתמכה על ידי מדעי הטבע, הנדסה מחקר המועצה של קנדה (NSERC), בנו הקרן הלאומית למדע.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AMB-1 | American Type Culture Collection (ATCC) | ATCC 700264 | |
| MS-1 | ATCC | ATCC 31632 | |
| MSR-1 | Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) | DSM 6361 | |
| Ferric citrate | Sigma-Aldrich | F3388-250G | |
| Trace mineral supplement | ATCC | MD-TMS | |
| KH2PO4 | EMD | PX1565-1 | |
| MgSO4.7 H2O | EMD | MX0070-1 | |
| HEPES | BioShop Canada Inc | HEP001.250 | |
| NaNO3 | Sigma-Aldrich | S5506-250G | |
| Yeast extract | Fischer scientific | DF210929 | |
| Peptone | Fischer scientific | DF0436-17-5 | |
| Potassium L-lactate solution (60%) | Sigma-Aldrich | 60389-250ML-F | |
| D-(-)-Quinic acid | Sigma-Aldrich | 138622 | |
| FeCl3.6H2O | Fischer scientific | I88-100 | |
| Vitamin supplement | ATCC | MD-VS | |
| Sodium succinate hexahydrate | Fischer scientific | S413-500 | |
| Sodium L-tartrate dibasic dihydrate | Sigma-Aldrich | 228729-100G | |
| Sodium acetate trihydrate | EMD | SX0255-1 | |
| Resazurin | Difco | 0704-13 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544-25G | |
| K2HPO4 | Caledon | 6620-1-65 | |
| FeCl2 .4H2O | Sigma-Aldrich | 44939-250G | |
| Sodium bicarbonate | EMD | SX0320-1 | |
| NaCl | Caledon | 7560-1 | |
| NH4Cl | EMD | 1011450500 | |
| CaCl2.2 H2O | EMD | 1023820500 | |
| Agar A | Bio Basic Canada Inc | FB0010 | |
| L-cysteine.HCl.H2O | Sigma-Aldrich | C7880-100G | |
| 1.0 mL syringes | Fischer scientific | B309659 | |
| 25G x 1 needles | BD | 305125 | |
| 125 mL serum bottles | Wheaton | 223748 | |
| 20 mm aluminum seals | Wheaton | 224223-01 | |
| 20mm E-Z Crimper | Wheaton | W225303 | |
| Butyl-rubber stoppers | Bellco Glass, Inc. | 2048-11800 | |
| Hungate tubes | Chemglass (VWR) | CLS-4208-01 | |
| Septum stopper, 13mm, Hungate | Bellco Glass, Inc. | 2047-11600 | |
| Glass culture Tubes | Corning (VWR) | 9826-16X | |
| Hydrochloric acid 36.5-38%, BioReagent | Sigma-Aldrich | H1758-100ML | 11.6 - 12 N |
References
- Blakemore, R. P. Magnetotactic bacteria. Annual Reviews in Microbiology. 36 (1), 217-238 (1982).
- Uebe, R., Schüler, D. Magnetosome biogenesis in magnetotactic bacteria. Nature Reviews Microbiology. 14 (10), 621 (2016).
- Faivre, D., Schuler, D. Magnetotactic bacteria and magnetosomes. Chemical Reviews. 108 (11), 4875-4898 (2008).
- Bazylinski, D. A., et al. Controlled biomineralization of magnetite (Fe3O4) and greigite (Fe3S4) in a magnetotactic bacterium. Applied and Environmental Microbiology. 61 (9), 3232-3239 (1995).
- Lefèvre, C. T., et al. Diversity of magneto-aerotactic behaviors and oxygen sensing mechanisms in cultured magnetotactic bacteria. Biophysical Journal. 107 (2), 527-538 (2014).
- Heyen, U., Schüler, D. Growth and magnetosome formation by microaerophilic Magnetospirillum strains in an oxygen-controlled fermentor. Applied Microbiology and Biotechnology. 61 (5-6), 536-544 (2003).
- Blakemore, R. P., Maratea, D., Wolfe, R. S. Isolation and pure culture of a freshwater magnetic spirillum in chemically defined medium. Journal of bacteriology. 140 (2), 720-729 (1979).
- Oestreicher, Z., Lower, S. K., Lin, W., Lower, B. H. Collection, isolation and enrichment of naturally occurring magnetotactic bacteria from the environment. Journal of Visualized Experiments. (69), (2012).
- Pósfai, M., Lefèvre, M., Trubitsyn, C., Bazylinski, D. A., Frankel, R. Phylogenetic significance of composition and crystal morphology of magnetosome minerals. Frontiers in Microbiology. 4, 344 (2013).
- Wolfe, R. S., Thauer, R. K., Pfennig, N. A 'capillary racetrack' method for isolation of magnetotactic bacteria. FEMS Microbiology Ecology. 3 (1), 31-35 (1987).
- Schübbe, S., et al. Characterization of a spontaneous nonmagnetic mutant of Magnetospirillum gryphiswaldense reveals a large deletion comprising a putative magnetosome island. Journal of Bacteriology. 185 (19), 5779-5790 (2003).
- Nadkarni, R., Barkley, S., Fradin, C. A comparison of methods to measure the magnetic moment of magnetotactic bacteria through analysis of their trajectories in external magnetic fields. PloS One. 8 (12), e82064 (2013).
- Waisbord, N., Lefèvre, C. T., Bocquet, L., Ybert, C., Cottin-Bizonne, C. Destabilization of a flow focused suspension of magnetotactic bacteria. Physical Review Fluids. 1 (5), 053203 (2016).
- Komeili, A., Vali, H., Beveridge, T. J., Newman, D. K. Magnetosome vesicles are present before magnetite formation, and MamA is required for their activation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (11), 3839-3844 (2004).
- Scheffel, A., et al. An acidic protein aligns magnetosomes along a filamentous structure in magnetotactic bacteria. Nature. 440 (7080), 110 (2006).
- Zhu, X., et al. Measuring spectroscopy and magnetism of extracted and intracellular magnetosomes using soft X-ray ptychography. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (51), E8219-E8227 (2016).
- Schüler, D. Molecular analysis of a subcellular compartment: the magnetosome membrane in Magnetospirillum gryphiswaldense. Archives of Microbiology. 181 (1), 1-7 (2004).
- Kolinko, I., et al. Biosynthesis of magnetic nanostructures in a foreign organism by transfer of bacterial magnetosome gene clusters. Nature Nanotechnology. 9 (3), 193 (2014).
- Hergt, R., et al. Magnetic properties of bacterial magnetosomes as potential diagnostic and therapeutic tools. Journal of Magnetism and Magnetic Materials. 293 (1), 80-86 (2005).
- Lefevre, C. T., et al. Novel magnetite-producing magnetotactic bacteria belonging to the Gammaproteobacteria. The ISME Journal. 6 (2), 440 (2012).
- Williams, T. J., Lefèvre, C. T., Zhao, W., Beveridge, T. J., Bazylinski, D. A. Magnetospira thiophila gen. nov., sp. nov., a marine magnetotactic bacterium that represents a novel lineage within the Rhodospirillaceae (Alphaproteobacteria). International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 62 (10), 2443-2450 (2012).
- Zhu, K., et al. Isolation and characterization of a marine magnetotactic spirillum axenic culture QH-2 from an intertidal zone of the China Sea. Research in Microbiology. 161 (4), 276-283 (2010).
