Summary
Biz birkaç soy-in Magnetospirillum iki farklı büyüme ortamının içinde büyüyen bir yordam mevcut. M. magneticum zorlanma AMB-1 ve M. magnetotacticum zorlanma MS-1 sıvı ortamda yetişir iken Magnetospirillum gryphiswaldense zorlanma MSR-1 yarı katı ortam sıvı ve O2 konsantrasyon gradyanı yetişir.
Abstract
Magnetotactic bakteri gram-negatif, hareketli, esas olarak su prokaryotlarda her yerde birden bulunan tatlı su ve deniz yaşam alanları vardır. Onlar içinde lipid bilayer membran tarafından çevrili manyetik nanometre boyutunda kristalleri manyetit (Fe3O4) veya greigite (Fe3S4) olan biomineralize magnetosomes kendi yeteneği ile karakterizedir onların sitoplazma. En bilinen magnetotactic bakteri için magnetosomes zincirleri böylece hücrelere bir kalıcı manyetik dipol an veriyor ve onları pasif dış manyetik alanlar ile hizalamak neden sitoplazma içine monte edilir. Bu özellikleri nedeniyle, magnetotactic bakteri ticari ve tıbbi uygulamalar için büyük bir potansiyele sahip. Ancak, çoğu türler da mikroaerofilik ve onları düzenli olarak pek çok diğer bakteri Escherichia coligibi daha büyümek daha zor hale belirli O2 toplama gereksinimleri vardır. Burada üç magnetotactic bakteri, tüm Magnetospirillumait en çok çalışılmış suşlarının büyüyen için detaylı protokolleri mevcut. Bu yöntemler bakteri için normalde büyümek ve magnetosomes sentez sağlamak için kullanılabilir O2 konsantrasyonu kesin kontrol için olanak sağlar. Magnetotactic bakteriler bu yordamları kullanarak daha fazla çalışmalar için büyüyen mikrobiyoloji uzmanı olmak deneyci gerektirmez. Büyüme medya kimyasal bileşimi değiştirilmesi gerekecektir olasılığı olmasına rağmen bu makalede sunulan genel yöntemleri yalıtmak ve diğer magnetotactic bakteri kültürü için de kullanılabilir.
Introduction
Magnetotactic bakteri (MTB) gram-negatif prokaryot tatlı su ve deniz sucul yaşam alanları1' her yerde geniş bir temsil eder. Bu bakterilerin içine zincirleri hücrelere toplandı çoğu durumda olan manyetit (Fe3O4) veya greigite (Fe3S4), oluşan manyetik kristalleri üretmek için yetenek paylaşmak. Bu belirli yapısal motifi hem sitoplazmada bakteri ve her kristal2çevreleyen lipid membran üzerinde hareket birkaç spesifik proteinlerin varlığı nedeniyle var. Her bireysel kristal ve onun çevresindeki zar vezikül bir magnetosome denir ve yaklaşık 30 büyüklükleri ile 50 arasında değişen Magnetospirillum türler3nm. Magnetosomes zinciri düzenleme nedeniyle, bu bakterilerin onları pasif dışarıdan uygulanan manyetik alanlarıyla hizalamak yapan kalıcı bir manyetik dipol an sahip. Bu nedenle, bu bakterilerin yüzmek aktif kundağı mikro-pergel muhtemelen için daha etkili bir şekilde en uygun koşullarda bulmak olarak hareket manyetik alan çizgileri (Örn., O2 konsantrasyonu) büyüme için.
MTB ilginç bir özelliği hem Kimya hem de onların magnetosome kristalleri kristalografisi düzenleyen onların yeteneğidir. Çoğu suşları nispeten yüksek saflıkta kristalleri manyetit veya greigite, ancak bazı üretmek biomineralize her iki mineraller4. Her durumda, bakteri tam olarak boyutu ve onların tek manyetik etki kristalleri şeklinde kontrol edebiliyoruz. Bu neden araştırma büyük bir miktar nasıl MTB bu biomineralization süreci gerçekleştirmek daha iyi bir anlayış geliştirmek için üstlenilen açıklar. Bu süreci anlamak araştırmacılar terzi-manyetik nanocrystals birçok ticari ve tıbbi uygulama için yapmak için izin olabilir.
MTB kapsamlı araştırma için önemli bir engel onları laboratuvarda büyüyen zorluk olmuştur. Bu çalışmada kullanılan suşları dahil olmak üzere çoğu, zorunlu O2 elektron alıcısı olarak yetiştirilen da mikroaerofilik türdür. Bu neden bu bakterilerin en sık oxic ve anoksik koşulları (anoksik oxic arabirimi, OAI) arasındaki geçiş bölgesi bulunur açıklar. Bu açıkça MTB var belli ki dikkate alınmak ne zaman büyüme medya bu organizmalar için oluşturulması gereken kesin O2 toplama gereksinimleri gösterir. Ayrıca, mevcut çeşitliliği MTB, farklı suşları kimyasal gradyanlar ve besinlerin optimum büyüme elde etmek için farklı gerekir anlamına gelir.
Bu çalışmada, biz üç en çok incelenmiş MTB büyüyen yöntemleri tarif: Magnetospirillum magneticum (zorlanma AMB-1), M. magnetotacticum (MS-1) ve M. gryphiswaldense (MSR-1). Bu türlerin filogenetik Proteobakteriler filum Alphaproteobacteria sınıfta ait, morfoloji Helisel ve hücrenin her uçta kutupsal kamçı sahip. Biz iletişim kurallarını zorlanma MSR-1 sıvı ve önceden yayınlanmış orta tarifleri5,6tarihinde O2 konsantrasyon gradyanı yarı katı medya tabanlı, büyüyen için sağlar. Biz de suşları AMB-1 ve MS-1 değiştirilmiş manyetik Spirillum büyüme orta (MGSM)7' büyüyen için detaylı bir iletişim kuralı mevcut.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. N2 İstasyonu montajı
Not: boru iç çapı en az sızıntı ile gaz tank için bağlanabilir ve 1 mL plastik enjektör silindir sıkıca bu boru içinde uyuyor seçin. Bir illüstrasyon istasyonu gaz tam N2 Şekil 1' de verilmiştir.
- Güvenli bir şekilde N2 benzin deposu bir Bank üzerinde N2 İstasyonu (yaklaşık 50 cm uzunluğunda) ayarlamak için yeterli yer yakın yükleyin.
- Tank için yeterince nerede istasyonu inşa edilecek alana ulaşmak için boru bir parça bağlayın. Gerekirse, herhangi bir sızıntı önlemek için tank çıktısını, Teflon bant geçerlidir.
- Aynı zamanda orta kabarcıklanma beş şişe yetenekli bir istasyonu kurmak için dört adet tüp yaklaşık 5 cm uzunluğu kesti.
- Boru üç üç yönlü T şeklinde plastik parçaları ile bir çizgi parçalarını bir araya getirin. N2 tank ekstra T şeklinde bir montaj yoluyla çıktısını, boru parçası bu çizginin bir ucunu bağlayın. Diğer ucunda uygun bir 90 ° dirsek ekleyin.
- Kullanım bant yatay bir metal çubuk için yapı eklemek için yaklaşık 30 cm tezgah üzerinde yerleştirilir.
- Adım 1.4 yüklü bağlantı parçaları ücretsiz çıktılarının (yaklaşık 20 cm uzunluğunda) boru, beş parçaları bağlayın.
- Beş 1.0 mL plastik şırıngaların pistonlar kaldırmak ve bu şırıngaların büyük sonunda kesti (i.e., iğne tarafına karşısında), sadece mezun bölümü tutmak. Bu şırınga değil çok sıkı pamuk ile doldurun.
- Şırıngaları hortumunun 20 cm uzun dikey parçalar halinde yerleştirebilir ve sabunlu su N2 akıyor zaman hiçbir sızıntı olduğundan emin olmak için kullanabilirsiniz.
- Beş 25 G iğneler (0.5 mm x 25 mm) kapaklar çıkarıp bu iğneler ince boru 10 cm parçalar halinde yerleştirin. İğneler sıkıca boru içinde uygun sağlamak.
Dikkat: Bu adımı sırasında bıçaklama riski vardır. Yavaş yavaş ve dikkatli bir şekilde yap. - Adım 1.9 N2 istasyon şırınga için hazırlanan iğneler iliştirin. N2 tüm beş satır akıyor emin olun ve İstasyonu bekleme üzerinde tutun.
2. büyüme orta hazırlık
Not: 2.1.2, 2.2.2 ve 2.3.8 adımlarda açıklandığı şekilde hazırlanmış, orta miktarını ayarlamak mümkündür. Su ve kimyasal madde miktarı orantılı olarak ayarlanması için adil lüzum kullanılır. Tüm Orta bileşenlerinin rolü ek tablo 1' de anlatılan.
- MSR-1 için sıvı büyüme ortamının hazırlanması
- Bir 10 mM ferrik nitrat çözümü ferrik nitrat 0,245 g 100 mL distile deiyonize su ekleyerek hazırlayın. Isı ve bir sarı turuncu çözüm elde edilen net kadar çözülmeye karıştırın. Otoklav bir standart kullanarak çözüm (en az 15 dk pozlama 121 ° c) döngüsü ve karanlıkta bu hisse senedi çözüm oda sıcaklığında saklayın.
Not: bir çökelti açık olduğunda ferrik nitrat çözüm atın. - Bir ölçek deiyonize distile su, 1 L içeren karıştırma sırasında sırayla aşağıdakileri ekleyin: 1.0 mL iz mineral ek çözüm, KH2PO40.1 g, MgSO4.7 H2O 0,15 g, HEPES, 2,38 gr 0,34 g NaNO3 , 0.1 g maya özü, soya fasulyesi pepton, 3.0 g 4.35 mL potasyum laktat (% 60 w/w çözüm) ve 10 mm Fe(III) sitrat hisse senedi çözüm 5 mL.
Not: büyüme orta daha az sayıda gerekirse miktarları orantılı olarak ayarlayın. Bir N2 istasyonu olan bu iletişim kuralı, adım 1'inşa gibi aynı anda kabarcıklanma beş şişe yeteneğine orta 300 mL hazırlamak.
Dikkat: mineral ve Fe(III) sitrat hisse senedi çözümleri steril tutulması gereken izleme. Kirlenmesini önlemek için onları (alev açık Üstler şişe Bunsen burner kullanarak) kullanırken standart steril tekniği kullanmak ve dağıtımı için steril pipet ipuçlarını kullanın. Mineral çözüm bir buzdolabı 4 ° C'de depolayın - Tüm kimyasallar eklenmesinden sonra 7.0 ile 1 M NaOH çözüm pH ayarlayın. Taze hazırlanmış Orta 125 mL serum şişeleri dağıtmak. Orta her şişe 60 mL dökün.
- Kabarcık N2 içine çözünmüş O2kaldırmak 30 dk için orta, küçük boru kullanma 1. adımda açıklanan N2 İstasyonu'na bağlı. Bütil kauçuk tıpa aşırı gaz şişe çıkmak izin vermek için küçük bir açılış bırakarak her şişe üzerine yerleştirin.
Dikkat: N2ile köpüren köpük şeklinde. Gaz akışı köpük üretim önlemek için uygun şekilde ayarlayın. - Kıvrım her şişe ile hazırlanan tıpa ve bir alüminyum mühür mühür. Alüminyum mühür şişe protokol geri kalan döneminde kapalı kalmasını sağlar.
- İğneler ve ince boru N2 istasyondan çıkarın ve temiz iğne (1 inç, ≤ 23 G) değiştirin. Gaz, nazik sürekli bir akış (yaklaşık 50 mL/dk) tank çıkar N2 tank valfleri ayarlayın.
Not: İğneler yerine 23 G tıpa kalıcı unsealable delikler bırakmak daha büyük. - N2 tank için orta, kauçuk tıpa aracılığıyla bir şişe içine bağlı iğne yerleştirin. Hemen başka bir temiz iğne aynı şişe içine yerleştirin. Diğer şişeler için bu adımı yineleyin ve N2 akışı şişeleri havada N2tarafından yerine yaklaşık 30 dk için sağlar.
- Bir şişe N2 İstasyonu'na karşılık gelen iğne kaldırarak çıkarın. Orta şişe basıncı atmosferik basınç azalır kadar birkaç saniye bekleyin ve ikinci iğne kaldırın. Tüm kalan şişeler için bu adımı yineleyin.
Dikkat: O2 büyüme orta şişe 2.1.4 adımdan sonra yeniden girmesini önlemek için adımları 2.1.4 - 2.1.8 hızlı art arda uygulayın. Tüm şişeler N2 istasyon için aynı anda bağlı olamaz, adımları 2.1.4-2.1.8 şişe ilk kümesi için devam etmek ve kalan şişeler için bu adımları yineleyin. - Basınçlı Kap şişeler. Onları aşağı oda sıcaklığına kadar serin gecede izin ve onları daha sonra oda sıcaklığında saklayın.
- Bir 10 mM ferrik nitrat çözümü ferrik nitrat 0,245 g 100 mL distile deiyonize su ekleyerek hazırlayın. Isı ve bir sarı turuncu çözüm elde edilen net kadar çözülmeye karıştırın. Otoklav bir standart kullanarak çözüm (en az 15 dk pozlama 121 ° c) döngüsü ve karanlıkta bu hisse senedi çözüm oda sıcaklığında saklayın.
- AMB-1 ve MS-1 için sıvı büyüme orta hazırlanması
- Bir 10 mM ferrik quinate çözüm hazırlamak. Önce 0,19 g deiyonize distile su 100 ml quinic asitin erimesi, sonra FeCl3.6H2O. koyu kırmızı, açık bir çözüm elde edilir kadar çözülmeye heyecan 0,27 g ekleyin. Otoklav standart döngüsü (en az 15 dk pozlama 121 ° c) kullanılarak çözüm.
Not: oda sıcaklığında ferrik quinate çözüm karanlıkta steril bir hisse senedi çözüm olarak depolar. Ne zaman bir çökelti belirginleşmektedir çözüm atın. - Bir ölçek deiyonize distile su, 1 L içeren karıştırma sırasında sırayla aşağıdakileri ekleyin: 10,0 mL vitamini takviyesi çözeltisi, 5.0 mL iz mineral takviyesi çözeltisi, KH2PO4, sodyum süksinat dibasic 0,848 g 0,68 g hekzahidrat, di-sodyum tartarat dihydrate, sodyum asetat trihidrat, %0,1 0,45 mL 0,083 g 0.575 g sulu Resazurin, 0,17 g NaNO3, 0,04 g askorbik asit ve 10 mm Fe(III) quinate hisse senedi çözüm 3,0 mL.
Not: büyüme orta daha az sayıda gerekirse miktarları orantılı olarak ayarlayın. Bir N2 istasyonu olan bu iletişim kuralı, adım 1'inşa gibi aynı anda kabarcıklanma beş şişe yeteneğine orta 300 mL hazırlamak.
Dikkat: Vitamin, iz mineral ve Fe(III) quinate hisse senedi çözümleri steril tutulması gereken. Kirlenmesini önlemek için standart steril tekniği ve steril pipet ipuçları dağıtım kullanın. Mineral ve vitamin çözümleri bir buzdolabı 4 ° C'de depolayın - Tüm kimyasallar eklenmesinden sonra pH 6,75 1 M NaOH çözümü kullanmak için ayarlayın.
- Adımları 2.1.3-2.1.9 protokol sonuna bakın.
- Bir 10 mM ferrik quinate çözüm hazırlamak. Önce 0,19 g deiyonize distile su 100 ml quinic asitin erimesi, sonra FeCl3.6H2O. koyu kırmızı, açık bir çözüm elde edilir kadar çözülmeye heyecan 0,27 g ekleyin. Otoklav standart döngüsü (en az 15 dk pozlama 121 ° c) kullanılarak çözüm.
- MSR-1 yarı katı büyüme orta hazırlanması
- 0, 5 M fosfat tampon çözüm pH 7,0 3.362 g K2HPO4 ve KH2PO4 deiyonize distile su 100 ml 4.178 g çözülerek hazırlayın. PH 7,0 ise kontrol edin ve biraz ile KH2PO4 veya gerekirse NaOH pH ayarlayın. Çözüm mühürlü cam şişe (oksijen değişimi önlemek için plastik tercih edilir) saklayın.
- 100 mL 0,02 M hidroklorik çözeltisi hazırlamak. FeCl2.4H2O 0.2 g bu ekleyin ve 10 mM Demir klorür çözüm elde etmek için dağıtılması için ilave edin. Çözüm mühürlü cam şişe karanlıkta saklayın.
- 0, 8 M sodyum bikarbonat çözüm 6,72 g / 100 ml distile deiyonize su NaHCO3 çözülerek hazırlayın. Çözüm mühürlü cam şişede depolayın.
- Otoklav çözüm adımları 2.2.1 - 2.2.3 standart döngüsü (en az 15 dk pozlama 121 ° c) kullanılarak hazırlanan. Karanlıkta olarak steril hisse senedi çözümleri stok onları.
- Bir ölçek deiyonize distile su, 1 L içeren karıştırma sırasında sırayla aşağıdakileri ekleyin: 5 mL iz mineral takviyesi çözeltisi 0.2 mL % 1'sulu resazurin çözeltisi, 0.4 gram NaCl, 0.3 g NH4Cl, 0.1 g MgSO4.7H2 O,2.2H2O, 1 g / sodyum süksinat, 0.5 g sodyum asetat, Maya 0.2 g ayıklamak CaCl 0,05 g ve agar 1.6 g.
- Alüminyum folyo ve otoklav 2.3.5 adımda hazırlanan solüsyona kabı kapağı.
- Otoklav döngüsünün sonuna önce taze %4 hazırlamak L-cysteine· HCl· L-cysteine·, 0.8 g eriterek tarafından H2O çözüm HCl· H2O 20 mL deiyonize distile su içinde. PH 7,0 çözümü 5 M NaOH çözüm ile etkisiz hale getirin.
Dikkat: sistein çözüm sistein oksidasyonunu önlemek için taze hazırlanır önemlidir. Mineral çözüm bir buzdolabı 4 ° C'de depolayın - Isıyla sonra 50-60 ° C aşağı orta soğumaya bırakın ve kabı Bunsen burner alev altında getir. Alüminyum folyo kaldırın ve hızlı bir şekilde yavaşça karıştırarak aşağıdaki sırayla ekleyin: 0.5 mL 2,8 mL steril fosfat tampon stok çözeltisi, 3 mL steril Demir klorür stok çözeltisi, 1,8 mL steril sodyum bikarbonat stokunun vitamini çözeltisi çözüm ve 10 mL filtre sterilize sistein çözeltisi.
Not: büyüme orta daha az sayıda gerekirse miktarları orantılı olarak ayarlayın. Genellikle bir toplu iş olarak orta 120 mL hazırlamak uygundur.
Dikkat: Tüm çözümler gelecekteki kullanım için steril olarak kalması gerekir. Adımı gerçekleştirmeniz standart steril tekniği ve steril pipet kullanarak 2.3.8 ipuçları dağıtımı ne zaman. - Tüm kimyasallar eklenmesinden sonra sıcak orta 16 mL steril vida-cap Hungate tüpler içine aktarın. Orta 12 mL her tüpün içine aktarmak ve tüpler mühür.
Dikkat: kirlenmesini önlemek için adımı 2.3.9 Bunsen burner Alevi altında gerçekleştirin. Orta 40 ° C'de ya da yukarıda sırasında agar katılaşır önce gerçekleştirin. - Tüpler rahatsız agar katılaşır ve OAI bir pembe renksiz arabirimine, yaklaşık 1-3 cm aşağıda orta olarak materializing belirgin hale gelir kadar birkaç saat bekletin.
Not: Orta yavaş yavaş tüp renksiz açmalısınız. Bu geçiş için gereken süreyi değişkendir ve başlangıçta ortamda çözünmüş O2 miktarına bağlıdır.
3. aşı MTB
Not: Suşları AMB-1, MS-1 ve MSR-1 kültürleri ticari olarak elde edilebilir (Tablo malzeme).
Dikkat: steril koşullarda Bunsen burner Alevi tüm aşağıdaki adımları gerçekleştirin.
- Aşı suşları MSR-1, AMB-1 ve MS-1 sıvı ortamda
- Bir boş 125 mL serum şişeyle bütil kauçuk tıpa ve alüminyum kıvrım mühür mühür. İki iğne tıpa ile şişe takın ve olduğu gibi adım 1.7 onlardan biri için hazırlanan bir şırınga takın. O2 boru N2 istasyon için kullanılan aynı tür ile silindir şırıngayı takın.
- O2 akışı için yaklaşık 30 dk, şişe şişe tüm hava O2tarafından değiştirilir emin olmak için izin. Her iki iğneler, şişe ve basınçlı kap içinde hafif bir aşırı basınç için izin kaldırın. Oda sıcaklığında kullanmadan önce soğumasını şişeyi ver.
Not: zaman kazanmak için adımları 3.1.1 ve 3.1.2 sırasında Orta hazırlama ve otoklav şişe ile birlikte orta veya hisse senedi çözümleri uygulayın. - Stoper taze orta şişe ve O2 Şişe Üstler % 70 etanol çözüm onları üstüne birkaç damlacıkları uygulamak ve onları Bunsen burner alev sterilize.
- Steril bir şırınga ve iğne kullanarak, O2 1 mL O2 şişeden ayıklamak ve taze orta şişe içine aktarın. İğne sıkıca şırıngayı bu adımı sırasında şırınga herhangi bir havada önlemek için sığdığından emin olmak.
- İnoculum cam şişede yetiştirilen başka bir kültürden kullanıyorsanız, yanında bir kaç % 70 etanol çözüm onları üstüne damlacıkları uygulamak ve bunları Bunsen burner alev iletme stoper taze orta şişesi ve eski kültür şişe sterilize. İnoculum bir tüp donmuş kültürünün kullanıyorsanız, oda sıcaklığına kadar sıcak bir Bunsen burner alev altında kapalı tüp ile bırak.
- İnoculum cam şişede yetiştirilen başka bir kültürden kullanıyorsanız, eski kültür 1 mL taze orta aşılamak. İnoculate donmuş bir stoktan kullanıyorsanız, sadece 0.1 mL gliserol veya dimetil sülfoksit (DMSO) dondurma işleminde kullanılan seyreltik aşılamak. Her iki durumda da, steril bir iğne ve steril bir şırınga kullanın.
- 32 ° c kültür kuluçkaya ve 4-7 gün sonra taze orta aşılamak.
- MSR-1 aşılama O2 degrade yarı katı orta
- Taze orta tüp bir pembe renksiz arabirimi tarafından hayata iyi tanımlanmış bir OAI yazdığını doğrulayın.
- Eğer inoculum başka bir O2 konsantrasyon gradyanı yarı katı kültüründen geliyor, bakteri kültürü pipetting 50 µL tarafından bakteriler tarafından kurulan grubu yerleştirilir steril pipet ucu ile hasat. Yavaş yavaş bu bakterilerin adlı arabirimin rahatsız edici kaçınarak OAI taze Orta (pembe/renksiz arabirimi), aşılamak. İnoculum donmuş bir kültürden geliyor, bunun yerine aynı şekilde inoculum 100 µL ile devam edin.
- Tüp ve 25 ° C ile 30 ° c arasında bakteri büyümeye izin mühür Bakteri grubu orta yüzeyine ulaşmadan önce aynı yordam kullanılarak taze orta aktarın.
4. bakteri gözlenmesi
- Yanında %70 etanol çözeltisi üzerine uygulamak ve Bunsen burner alev geçen kültür şişe tıpa sterilize. Yarı katı orta için tüp Bunsen burner Alevi altında açın. Steril bir iğne ve şırınga steril bakteri ayıklamak için kullanın.
- Kullanım asılı bırakın bakteri manyetik ve hareketli olduğundan emin olmak için yöntem8 .
Not: Faz kontrast mikroskobu mükemmel sonuçlar verir ancak zorunlu değildir. 10 X 60 X arasında değişen büyüklüklerde uygundur. - Hücre yapısı ve ayrıntı8magnetosomes gözlemlemek için iletim elektron mikroskobu (TEM) kullanın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Büyüme ortamının başarılı hazırlık aşağıdaki gibi tespit edilebilir. İşlemin sonunda, çözümleri temizleyin (i.e., ücretsiz herhangi bir çökelti olarak) alınmalıdır (sıvı medya ve O2 degrade yarı katı orta için de geçerlidir bu). Önce aşı Şekil 2agörülebilir MSR-1 sıvı orta beklenen yönünü gösteren bir resim. Başarılı bir O2 konsantrasyon gradyanı yarı katı orta varlığı 1-3 cm pembe orta üst kısmındaki tüp (Şekil 3, tüp A) ile gösterilen oluşumu bir OAI birkaç saat sonra tarafından sinyalini verdi. Orta geri kalanı renksiz olmalıdır. Aşı resazurin tam oksidasyonunu belirtisi olmadan bir all-pembe orta ve bu nedenle O2 konsantrasyon geçişin başarısız bir hazırlık.
Sıvı ortamda başarılı büyüme yaklaşık 48 h (veya inoculum donmuş bir kültürden geliyor Eğer birkaç gün sonra) aşı sonra sadece bir ışık kaynağı veya bir spektrofotometre kullanarak bulanıklık için kültürler inceleyerek denetlenebilir. Başarılı büyüme bakteri aslında (Şekil 2b) büyümüş kanıtlayan bulanıklık tarafından onaylanır. Orta 48 saat sonra açık kalırsa, bakteri büyüdü değil. Normalde büyüyen bir sıvı orta kültür için magnetosomes sentezleme bakteri varlığı 48 h sonra orta şişe manyetik heyecan tabağa yerleştirerek ve bir el feneri ile aydınlatıcı tarafından denetlenebilir. Vasıl a alçak karıştırma hız, Orta ", dönüşümlü olarak bağlı olarak karıştırma mıknatıs ile ilgili deneyci konumunu yönünü daha parlak ve koyu seyir flash". Manyetik olmayan bir kültür için deneyci karşı hücreleri tarafından dağınık ışık yoğunluğu sabit kalır.
Yarı katı ortamda başarılı büyüme da mikroaerofilik Wataha pembe/Renksiz arayüz bakterilerin oluşumunu simgesiyle gösterilir. O2 bakteri ve O2 degrade değişiklikleri tüketimi nedeniyle, Grup yavaş yavaş OAI (Şekil 3, tüp B) takip etmek göç edecek.
Asılı bırak yöntemi sağlar gözlemci bakteri manyetik ve hareketli olduğundan emin olun. Birkaç dakika sonra MTB aktif manyetik alan çizgileri (4a rakam) yüzmek kanıtlayan asılı damla kenarında konsantre olmalı. Hücreleri manyetik olması için damla yanında oturan mıknatıs yönünü ters çevir. Bakteri karşı kenarına (Şekil 4b) doğru yüzme başlayacaktır. Son olarak, magnetosomes şeklinde TEM ile kontrol edilebilir. Cuboctahedral kristalleri yaklaşık 30-45 nm çapında9dikkat edilmelidir. Bu kristaller normalde bir uzun zincirli düzenlenir veya birden çok kısa zincirler içinde belgili tanımlık tür burada (Şekil 5) okudu.
Resim 1 : Resimde N2 İstasyonu gazlama. (bir) şematik Gösterim. (b) resmi kur. Başarılı bir istasyonu büyük ve ince boru uygun uzunluğu sahip olacaksınız, böylece iletişim kuralı içinde adım 1.9 açıklanan ince boru sonuna gaz kabarcıklanma adımı sırasında ortamda dalmış kalır. Gaz akışını da ayarlanabilir, tüm O2 kaldırıldığından emin olmak için sürekli ve orta değil dökmek olmalıdır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 : Sıvı büyüme orta öncesi ve sonrası aşılama şişe. (bir) açık MSR-1 orta aşılama önce. (b) bulanık MSR-1 orta başarılı büyüme 3 gün sonra. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 : O2 tüp (a tüp) önce degrade yarı katı orta ve 10 gün sonra (tüp B) aşı. Tüp B bakteri grubu kırmızı bir okla belirtilir.
Şekil 4 : Tipik bir asılı damla sonuçlarını deney 20 X faz kontrast mikroskobu kullanarak büyütme. (bir) MTB doğru Güney Kutbu bir mıknatıs yüzmek ve sıvı/hava arayüzü birikir. (b) mıknatıs saygısız sonra 1 dk, en hücreleri görüş alanı terk etti.
Şekil 5 : TEM gözlem AMB-1 hücre. Magnetosome zincirleri kırmızı oklarla belirtilmiştir. İki kamçı siyah oklarla belirtilmiştir.
Ek tablo 1. Bu tabloyu indirmek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
MTB özel O2 konsantrasyon gereksinimlerini onları olmayan önemsiz laboratuvarda büyümeye yapmak. Bir anahtar için sıvı orta protokolün tüm O2 orta ilk kaldırılması O2, hemen önce aşı kesin hacmi ekleyerek son konsantrasyonu kontrol edebilmek için adımdır. MSR-1 neredeyse tamamen aerobik koşullarda büyür, ancak, manyetizma hücrelerin büyük ölçüde azalır kanıtlanmıştır. Aynı çalışma sonuçlarından suşları AMB-1 ve MS-1 tam aerobik koşulları6altında yetişir mi gösterdi. MSR-1 yarı katı kültürü, tüm O2 ilk sistein çözüm tarafından azalır ve daha sonra O2 konsantrasyon gradyanı, OAI oluşumu için önde gelen görünür. Bir kültür de büyümek değil veya manyetik değilse, O2 konsantrasyonu kontrol etmek için ilk şey olmalıdır.
Yarı katı büyüme orta bilinmeyen MTB izole veya bu istikrarlı degradeler varlığını sağlar ve kendilerini konumlandırmak bakteri sağlar gibi her iki O2 ve redoks gradyanlar, son derece hassas olan türler büyüyen için ilginç bir tercihtir en iyi büyüme koşulları sunan konum. Sıvı orta yüksek birimleri ne zaman gereklidir ile çalışmak daha uygun (e.g., DNA ekstraksiyon), veya ne zaman daha fazla çözümleme ihtiyacı hücreleri üzerinde yapılacak (Örn., magnetosome çalışmalar) hücrelerden daha kolay ayrılması için izin verdiği büyüme orta. Yarı katı ortamda agar gerçekten tekniği hasat hücre ile etkileşebilir.
Bazı kültürlerde, hücreleri bazen hareketli olmayan-büyük olasılıkla spontan mutasyonlar nedeniyle olur. Sigara hareketli hücreleri hayatta kalmak ve onların yaşam için gerekli besin bulmak için yüzmek zorunda değildir bu yana büyüme aracı olarak büyür. Standart yarış pisti yöntemi10 daha sonra sadece hareketli hücreleri yarış pisti yüzebilir miyim beri hareketli kültür kurtarmak için kullanılabilir. Manyetik fenotip kaybı-ebilmek da var olmak kültüründe O2 konsantrasyonu nedeniyle tekrar11spontan mutasyonlar en uygun olsa bile. En iyi çözüm bu durumda yeni bir kültür taze orta stokları vahşi-türü bakterilerin donmuş aşı başlamaktır. Alternatif olarak, yarış pisti tekniği de manyetik bir kültürün kurtarma izin verebilirsiniz.
Diğer organizmalar tarafından kültür kirlenmesini önlemek için önemlidir ve bu nedenle çoğu Protokolü'nün steril teknikleri kullanılarak gerçekleştirilmelidir. Bunsen burner alev altında genellikle manipüle aseptik koşullar tutmak tatmin edici sonuçlar verir. Kültür kirlenme eğilimli bir ortamda büyüdü eğer Ancak, ek önlemler, orta hazırlarken bir laminar akış mahallede çalışma ve bakteri aşı gibi alınmalıdır. Bu bulaşma riskini tüpler hücreleri kaldırılır ne zaman açılacak kadar yarı katı ortamda daha yüksek olduğunu belirtmek gerekir.
Bu protokoller deneyler, optik mikroskobu12,13, elektron mikroskobu görüntüleme14,15temel fiziksel çalışmaları gibi birçok farklı türde yapmak için yeterli bakterilerin büyümesini sağlar, Spectromicroscopy analizleri16, genomik ve protein çalışmaları17,18x-ışını. Gerekirse, bakteri süspansiyon daha yüksek konsantrasyonlarda Santrifüjü tarafından sağlanabilir. Buna ek olarak, magnetosomes çıkarılan ve uygulamalarda daha fazla hücre topakları veya yoğun hücre süspansiyonlar Santrifüjü19tarafından elde edilen arıtılmış.
Büyüme medya formülasyonları genellikle aynı yönetim ilkeleri (bakınız ek tablo 1 büyüme medyada her bileşeninin rol Listesi Özeti için burada açıklanan) temel alır. Bir karbon kaynağı organik asitler ile bakteri için kullanılabilir olması gerekir (Örn., süksinat, asetat, tartarat, laktat) veya bikarbonat gibi inorganik bileşikler. Uygun karbon kaynağı seçimi bakteri metabolizması üzerinde bağlıdır. Azot DNA ve proteinler ve fosfor (DNA, membran) mevcut da gereklidir ve NaNO3, NH4Cl ve KH2PO4 burada açıklanan tariflerde sağladığı. Bir arabellek (HEPES, fosfat tampon) pH değişiklikleri karşı koymak gereklidir. İz mineral takviyesi çözüm enzimler için kofaktör içerir ve vitaminler bakteriler tarafından Koenzimler veya fonksiyonel gruplar olarak bazı enzimler için kullanılabilir. Maya özü ve soya fasulyesi pepton amino asit ve tuzları protein üretimi için kullanılan bir kaynak sağlar. MTB redoks duyarlı olduğundan, bir ya da birkaç azalan bakiyeli aracı kez orta olarak eklenmiş olması gerekir (Örn., sistein, askorbik asit, laktat). Demir büyük bir kaynak (Örn., ferrik nitrat, demir quinate, Demir klorür) orta biomineralization için gereklidir. Son olarak, O2 az miktarda elektron alıcısı olarak da mikroaerofilik bakterilerin için gereklidir. Anaerobik MTB kullanmak yerine diğer bileşikler nitrat veya azot oksit gibi zorunlu.
Bu protokoller asıl sınırlandırılması onlar-ecek iş MTB diğer türler için hiçbir garanti olduğunu. Suşları AMB-1, MS-1 ve MSR-1 tüm tatlı su MTB ve bu nedenle bu makalede açıklanan tarifleri Magnetospira thiophila zorlanma MMS-1, Magnetospira zorlanma QH-2 veya diğer deniz MTB gibi deniz magnetospirilla büyümeye kullanılamaz Hangi yüksek tuz konsantrasyonları gerektirir. Ancak, diğer suşların MTB ve yeni suşları yalıtım büyümeye, sıvı ve yarı katı ortam için bu makalede sunulan genel yöntemleri farklı yemek tarifleri ile ortam hazırlamak için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Biz Richard B. Frankel elektron mikroskobu tesise (McMaster Üniversitesi, eğitim ve erişim için MTB kültürler, Adam P. Hitchcock ve destekleri MTB kültürler McMaster Üniversitesi'nde kurma sırasında Xiaohui Zhu ve Marcia Reid ile onun yardım için teşekkür ««Sağlık Bilimleri Fakültesi). Bu eser Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Konseyi, Kanada (NSERC) ve bize Ulusal Bilim Vakfı tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AMB-1 | American Type Culture Collection (ATCC) | ATCC 700264 | |
| MS-1 | ATCC | ATCC 31632 | |
| MSR-1 | Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) | DSM 6361 | |
| Ferric citrate | Sigma-Aldrich | F3388-250G | |
| Trace mineral supplement | ATCC | MD-TMS | |
| KH2PO4 | EMD | PX1565-1 | |
| MgSO4.7 H2O | EMD | MX0070-1 | |
| HEPES | BioShop Canada Inc | HEP001.250 | |
| NaNO3 | Sigma-Aldrich | S5506-250G | |
| Yeast extract | Fischer scientific | DF210929 | |
| Peptone | Fischer scientific | DF0436-17-5 | |
| Potassium L-lactate solution (60%) | Sigma-Aldrich | 60389-250ML-F | |
| D-(-)-Quinic acid | Sigma-Aldrich | 138622 | |
| FeCl3.6H2O | Fischer scientific | I88-100 | |
| Vitamin supplement | ATCC | MD-VS | |
| Sodium succinate hexahydrate | Fischer scientific | S413-500 | |
| Sodium L-tartrate dibasic dihydrate | Sigma-Aldrich | 228729-100G | |
| Sodium acetate trihydrate | EMD | SX0255-1 | |
| Resazurin | Difco | 0704-13 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544-25G | |
| K2HPO4 | Caledon | 6620-1-65 | |
| FeCl2 .4H2O | Sigma-Aldrich | 44939-250G | |
| Sodium bicarbonate | EMD | SX0320-1 | |
| NaCl | Caledon | 7560-1 | |
| NH4Cl | EMD | 1011450500 | |
| CaCl2.2 H2O | EMD | 1023820500 | |
| Agar A | Bio Basic Canada Inc | FB0010 | |
| L-cysteine.HCl.H2O | Sigma-Aldrich | C7880-100G | |
| 1.0 mL syringes | Fischer scientific | B309659 | |
| 25G x 1 needles | BD | 305125 | |
| 125 mL serum bottles | Wheaton | 223748 | |
| 20 mm aluminum seals | Wheaton | 224223-01 | |
| 20mm E-Z Crimper | Wheaton | W225303 | |
| Butyl-rubber stoppers | Bellco Glass, Inc. | 2048-11800 | |
| Hungate tubes | Chemglass (VWR) | CLS-4208-01 | |
| Septum stopper, 13mm, Hungate | Bellco Glass, Inc. | 2047-11600 | |
| Glass culture Tubes | Corning (VWR) | 9826-16X | |
| Hydrochloric acid 36.5-38%, BioReagent | Sigma-Aldrich | H1758-100ML | 11.6 - 12 N |
References
- Blakemore, R. P. Magnetotactic bacteria. Annual Reviews in Microbiology. 36 (1), 217-238 (1982).
- Uebe, R., Schüler, D. Magnetosome biogenesis in magnetotactic bacteria. Nature Reviews Microbiology. 14 (10), 621 (2016).
- Faivre, D., Schuler, D. Magnetotactic bacteria and magnetosomes. Chemical Reviews. 108 (11), 4875-4898 (2008).
- Bazylinski, D. A., et al. Controlled biomineralization of magnetite (Fe3O4) and greigite (Fe3S4) in a magnetotactic bacterium. Applied and Environmental Microbiology. 61 (9), 3232-3239 (1995).
- Lefèvre, C. T., et al. Diversity of magneto-aerotactic behaviors and oxygen sensing mechanisms in cultured magnetotactic bacteria. Biophysical Journal. 107 (2), 527-538 (2014).
- Heyen, U., Schüler, D. Growth and magnetosome formation by microaerophilic Magnetospirillum strains in an oxygen-controlled fermentor. Applied Microbiology and Biotechnology. 61 (5-6), 536-544 (2003).
- Blakemore, R. P., Maratea, D., Wolfe, R. S. Isolation and pure culture of a freshwater magnetic spirillum in chemically defined medium. Journal of bacteriology. 140 (2), 720-729 (1979).
- Oestreicher, Z., Lower, S. K., Lin, W., Lower, B. H. Collection, isolation and enrichment of naturally occurring magnetotactic bacteria from the environment. Journal of Visualized Experiments. (69), (2012).
- Pósfai, M., Lefèvre, M., Trubitsyn, C., Bazylinski, D. A., Frankel, R. Phylogenetic significance of composition and crystal morphology of magnetosome minerals. Frontiers in Microbiology. 4, 344 (2013).
- Wolfe, R. S., Thauer, R. K., Pfennig, N. A 'capillary racetrack' method for isolation of magnetotactic bacteria. FEMS Microbiology Ecology. 3 (1), 31-35 (1987).
- Schübbe, S., et al. Characterization of a spontaneous nonmagnetic mutant of Magnetospirillum gryphiswaldense reveals a large deletion comprising a putative magnetosome island. Journal of Bacteriology. 185 (19), 5779-5790 (2003).
- Nadkarni, R., Barkley, S., Fradin, C. A comparison of methods to measure the magnetic moment of magnetotactic bacteria through analysis of their trajectories in external magnetic fields. PloS One. 8 (12), e82064 (2013).
- Waisbord, N., Lefèvre, C. T., Bocquet, L., Ybert, C., Cottin-Bizonne, C. Destabilization of a flow focused suspension of magnetotactic bacteria. Physical Review Fluids. 1 (5), 053203 (2016).
- Komeili, A., Vali, H., Beveridge, T. J., Newman, D. K. Magnetosome vesicles are present before magnetite formation, and MamA is required for their activation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (11), 3839-3844 (2004).
- Scheffel, A., et al. An acidic protein aligns magnetosomes along a filamentous structure in magnetotactic bacteria. Nature. 440 (7080), 110 (2006).
- Zhu, X., et al. Measuring spectroscopy and magnetism of extracted and intracellular magnetosomes using soft X-ray ptychography. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (51), E8219-E8227 (2016).
- Schüler, D. Molecular analysis of a subcellular compartment: the magnetosome membrane in Magnetospirillum gryphiswaldense. Archives of Microbiology. 181 (1), 1-7 (2004).
- Kolinko, I., et al. Biosynthesis of magnetic nanostructures in a foreign organism by transfer of bacterial magnetosome gene clusters. Nature Nanotechnology. 9 (3), 193 (2014).
- Hergt, R., et al. Magnetic properties of bacterial magnetosomes as potential diagnostic and therapeutic tools. Journal of Magnetism and Magnetic Materials. 293 (1), 80-86 (2005).
- Lefevre, C. T., et al. Novel magnetite-producing magnetotactic bacteria belonging to the Gammaproteobacteria. The ISME Journal. 6 (2), 440 (2012).
- Williams, T. J., Lefèvre, C. T., Zhao, W., Beveridge, T. J., Bazylinski, D. A. Magnetospira thiophila gen. nov., sp. nov., a marine magnetotactic bacterium that represents a novel lineage within the Rhodospirillaceae (Alphaproteobacteria). International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 62 (10), 2443-2450 (2012).
- Zhu, K., et al. Isolation and characterization of a marine magnetotactic spirillum axenic culture QH-2 from an intertidal zone of the China Sea. Research in Microbiology. 161 (4), 276-283 (2010).
