Summary

Croissance des plantes et la Transformation par Agrobacterium Floral creux de la Extremophyte Schrenkiella parvula

Published: January 07, 2019
doi:

Summary

La transformation par Agrobacterium en utilisant une méthode floral creux peut être employée avec succès pour créer des lignées transgéniques stables du modèle extremophyte Schrenkiella parvula. Nous présentons un protocole modifié de celui d’ Arabidopsis thaliana, compte tenu des habitudes de croissance différent et les caractéristiques physiologiques de l’extremophyte.

Abstract

Schrenkiella parvula est une extremophyte adaptée aux différents stress abiotiques, y compris les multiples contraintes de la toxicité d’ion. Malgré la qualité des ressources génomiques disponibles pour étudier comment les plantes s’adaptent à l’environnement souligne, sa valeur comme un modèle de génomique fonctionnelle et outil ont été limité par l’absence d’un système de transformation possible. Dans ce protocole, nous rapportons comment générer transgéniques stable S. parvula lignes en utilisant une méthode d’immersion à floral par Agrobacterium. Nous avons modifié le protocole de transformation utilisé pour a. thaliana pour tenir compte des caractéristiques uniques du S. parvula, comme une habitude de floraison pour une période indéterminée et une teneur en cires épicuticulaire élevé sur les feuilles. En bref, S. parvula graines ont été stratifiées à 4 ° C pendant cinq jours avant la plantation. Les plantes ont été cultivées à une photopériode d’une lumière de 14 h et 10 h d’obscurité et une 130 µmol m-2s-1 intensité lumineuse, à 22 ° C à 24 ° C. Huit à neuf semaines plantes avec plusieurs inflorescences ont été sélectionnés pour la transformation. Ces inflorescences sont trempés dans une solution d’infiltration d’Agrobacterium tumefaciens GV3101 portant le plasmide pMP90RK . Nous avons effectué deux séries de fleur plongeant avec un intervalle de trois à quatre semaines pour augmenter l’efficacité de la transformation. Les graines de T1 ont été recueillies et séchées pendant quatre semaines dans un récipient avec gel de silice avant la germination pour dépister le candidat transformé lignes. Résistance aux BASTA a été utilisée pour dépister les plantes T1. Nous avons pulvérisé la solution BASTA trois fois avec un intervalle de trois jours à partir de deux semaines centrales pour réduire les faux positifs. Une épreuve de chute BASTA a été réalisée sur la survie des plantes individuelles afin d’identifier les vrais positifs transformants. L’efficacité de la transformation a été 0,033 %, ce qui donne des plantes transgéniques de 3 – 4 10 000 graines T1 propagées.

Introduction

Dans ce protocole, nous décrivons la croissance et la création de lignées transgéniques stables pour le modèle extremophyte Schrenkiella parvula. La disponibilité d’un système efficace de transformation est une caractéristique de n’importe quel modèle génétique polyvalent. Plantes qui se développent dans des environnements extrêmes, mentionné comme extremophytes, fournissent une ressource cruciale pour comprendre les adaptations des plantes aux stress environnementaux. Schrenkiella parvula (anciennement Thellungiella parvula et Eutrema parvula) est un tel modèle extremophyte, avec l’expansion des ressources génomiques1,2,3,4,5. Toutefois, des protocoles de transformation n’ont pas encore été signalées pour S. parvula études publiées.

Le génome de S. parvula est le premier génome d’extremophyte publiés dans Brassicaceae (famille de la moutarde-chou) et montre une vaste synténie du génome globale avec le modèle non-extremophyte, Arabidopsis thaliana1. Ainsi, des études comparatives entre a. thaliana et S. parvula pourraient bénéficier de la richesse des études génétiques effectuées sur a. thaliana , faire des hypothèses informatives sur comment le génome de s. parvula a évolué et réglementé différemment pour faire face aux extrêmes environnementaux souligne5,6,7. S. parvula est une des espèces plus tolérantes au sel (basés sur sol NaCl LD50) parmi les parents sauvages connues d’a. thaliana8. En plus de la tolérance de NaCl, S. parvula survit et termine son cycle de vie en présence de plusieurs ions salins à de fortes concentrations de toxiques pour la plupart de plantes7. En réponse aux stress abiotiques dans son habitat naturel, il a évolué des traits différents, parmi lesquels plusieurs ont été étudiés à la biochimiques ou physiologiques niveau 8,9,10, 11.

Depuis 2010, ont été plus de 400 publications peer-reveiwed utilisé S. parvula comme espèce cible ou utilisèrent dans une comparaison avec d’autres génomes de plantes. Toutefois, un goulot d’étranglement clair pourrait être identifié avec un examen approfondi de ce type d’études ont été menées. La majorité de ces rapports discute l’utilisation potentielle de S. parvula dans de futures études ou l’utilise dans la génomique comparative ou études de phylogenomic. En raison de l’absence d’un protocole de validation de la transformation établie pour S. parvula, il n’a pas été utilisé dans les études de génomique fonctionnelles, malgré avoir un des plus hautes génomes de plantes de qualité disponibles à ce jour (> 5 Mo contig N50) assemblés et annoté en pseudomolécules au niveau du chromosome1.

La méthode de la transformation par Agrobacterium floral creux est devenue la méthode la plus largement utilisée pour créer des lignes de trasngenic dans Arabidopsis, et l’élaboration d’un système reproductible de transformation a été un facteur essentiel à son succès comme un modèle génétique12,13. Cependant, pas toutes les espèces de Brassicaceae ont démontré être transformée avec succès en utilisant la méthode floral creux mis au point pour a. thaliana. Spécialement, les espèces de Brassicaceae Lineage II qui incluent S. parvula a été récalcitrant à floral creux transformation fonction méthodes14,15.

L’habitude de croissance floraison pour une période indéterminée de S. parvula, combinée à sa morphologie de feuille étroite rend difficile d’adopter la méthode de transformation de floral creux standard par Agrobacterium. Dans cette étude, nous présentons le protocole modifié, que nous avons développé pour transformation reproductible de S. parvula.

Protocol

1. la croissance des plantes Stérilisation des semences (facultative) Préparer 50 % eau de Javel dans l’eau bidistillée (ddH2O) avec 1 ou 2 gouttes d’un détergent non ionique (voir Table des matières) dans un tube de 50 mL. Inverser le tube plusieurs fois pour mélanger la solution.Remarque : Il est préférable de procéder à la stérilisation des semences dans un flux laminaire avec une surface stérilisée UV pendant 15 m…

Representative Results

Nous avons développé un protocole de transformation qui permet la récolte de graines0 T dans les 150 jours suivant, en utilisant une méthode d’immersion à floral modifiée de celle d’a. thaliana. La figure 1 montre un résumé de la chronologie et les plantes de S. parvula qui représentent le stade optimal pour l’exécution de la transformation par le biais de floral-dip. Nous avons choisi S. parvula plantes a…

Discussion

L’état physiologique de la plante influence significativement l’efficacité de transformation25. L’utilisation de plants sains et vigoureux pour transformation est une condition essentielle pour la réussite de la transformation en S. parvula. L’eau ou lumière des plantes stressées auront moins de fleurs par rapport à l’idéal de transformation (Figure 1, panneau central) des plantes saines. S. parvula peuvent pousser à une intensité …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par une bourse de la National Science Foundation 1616827 MCB.

Materials

Agar VWR International, Radnor, PA 90000-762 Bacto Agar Soldifying Agent, BD Diagnostics
B5 vitamins Sigma-Aldrich, St. Louis, MO G1019 Gamborg’s Vitamin Solution
Desiccant W A Hammond Drierite, Xenia, OH 22005 Indicating DRIERITE 6 mesh
Destination vector for plant transformation TAIR Vector:6531113857 pKGWFS7
Electroporation cuvette USA Scientific 9104-5050 Electroporation cuvette, round cap, 0.2 cm gap
Electroporator BIO-RAD Laboratories, Hercules, CA 1652100 MicroPulser Electroporator
Fertilizer beads Osmocote Garden, Marysville, OH N/A Osmocote Smart-Release Plant Food Flower & Vegetable
Gel extraction kit iNtRON Biotechnology, Boston, MA 17289 MEGAquick-spin Total fragment DNA purification kit
Gentamicin Sigma-Aldrich, St. Louis, MO G1914-5G Gentamicin sulfate
Glufosinate-ammonium (11.3%) herbicide (BASTA) Bayer environmental science, Montvale, NJ N/A FINALE herbicide
Kanamycin VWR International, Radnor, PA 200004-444 Kanamycin monosulfate
MES Bioworld, Dublin, OH 41320024-2 MES, Free Acid
MS salt MP Biomedicals, Santa Anna, CA 092621822 Hoagland's modified basal salt mixture
N6-benzylaminopurine (BA)  Sigma-Aldrich, St. Louis, MO B3274 6-Benzylaminopurine solution
NaCl Sigma-Alrich S7653 Sodium chloride
Non-ionic detergent Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 9005-64-5 TWEEN 20 
Plasmid isolation kit Zymo Research, Irvine, CA D4036 Zyppy Plasmid Kits
Recombinase enzyme mix kit Life Technology 11791-020 Gateway LR Clonase II Enzyme mix
Rifampicin Sigma-Aldrich, St. Louis, MO R3501-1G Rifampicin, powder, >= 97% (HPLC)
Shaking incubator ThermoFisher Scientific, Waltham, MA SHKE4450 MaxQ 4450 Benchtop Orbital Shakers
Soil mix Sun Gro SUN239223328CFLP Sun Gro Metro-Mix 360 Grower Mix
Spectinomycin VWR International, Radnor, PA IC15206705
Sterile 50ml conical tubes USA Scientific, Ocala, FL 1500-1811 50 ml conical screw cap tubes, copolymer, racks, sterile
Sucrose VWR International, Radnor, PA 57-50-1 Sucrose, ACS
Surfactant solution Lehle seeds, Round Rock, TX VIS-02 Silwet L-77
Topoisomerase-based cloning kit Life Technologies, Carlsbad, CA K240020 pENTR/D-TOPO Cloning Kit, with One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli
Tryptone VWR International, Radnor, PA 90000-282 BD Bacto Tryptone, BD Biosciences
Yeast Extract VWR International, Radnor, PA 90000-722  BD Bacto Yeast Extract, BD Biosciences

References

  1. Dassanayake, M., et al. The genome of the extremophile crucifer Thellungiella parvula. Nature Genetics. 43 (9), 913-918 (2011).
  2. Oh, D. -. H., Dassanayake, M., Bohnert, H. J., Cheeseman, J. M. Life at the extreme: lessons from the genome. Genome Biology. 13 (3), 241 (2012).
  3. Whited, J. The Next Top Models. Cell. 163 (1), 18-20 (2015).
  4. Dassanayake, M., Yun, D. O. D., Bressan, R. A., Cheeseman, J. M., Bohnert, J. H. The scope of things to come: New paradigms in biotechnology. Plant Biotechnology and Agriculture: Prospects for the 21st Century. , 19-34 (2009).
  5. Dittami, S. M., Tonon, T. Genomes of extremophile crucifers: New platforms for comparative genomics and beyond. Genome Biology. 13 (8), 166 (2012).
  6. Amtmann, A. Learning from evolution: Thellungiella generates new knowledge on essential and critical components of abiotic stress tolerance in plants. Molecular Plant. 2 (1), 3-12 (2009).
  7. Oh, D. -. H., Hong, H., Lee, S. Y., Yun, D. -. J., Bohnert, H. J., Dassanayake, M. Genome structures and transcriptomes signify niche adaptation for the multiple-ion-tolerant extremophyte Schrenkiella parvula. Plant Physiology. 164 (4), 2123-2138 (2014).
  8. Orsini, F., et al. A comparative study of salt tolerance parameters in 11 wild relatives of Arabidopsis thaliana. Journal of Experimental Botany. 61 (13), 3787-3798 (2010).
  9. Uzilday, B., Ozgur, R., Sekmen, A. H., Yildiztugay, E., Turkan, I. Changes in the alternative electron sinks and antioxidant defence in chloroplasts of the extreme halophyte Eutrema parvulum (Thellungiella parvula) under salinity. Annals of Botany. 115 (3), 449-463 (2015).
  10. Teusink, R. S., Rahman, M., Bressan, R. A., Jenks, M. A. Cuticular waxes on Arabidopsis thaliana close relatives Thellungiella halophila and Thellungiella parvula. International Journal of Plant Sciences. 163 (2), 309-315 (2002).
  11. Jarvis, D. E., Ryu, C. H., Beilstein, M. A., Schumaker, K. S. Distinct roles for SOS1 in the convergent evolution of salt tolerance in Eutrema salsugineum and Schrenkiella parvula. Molecular Biology and Evolution. 31 (8), 2094-2107 (2014).
  12. Clough, S. J., Bent, A. F. Floral dip: A simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana. Plant Journal. 16 (6), 735-743 (1998).
  13. Koornneef, M., Meinke, D. The development of Arabidopsis as a model plant. Plant Journal. 61 (6), 909-921 (2010).
  14. Bai, J., Wu, F., Mao, Y., He, Y. In planta transformation of Brassica rapa and B. napus via vernalization-infiltration methods. Protocol Exchange. 10, 1028 (2013).
  15. Sparrow, P. A. C., Goldsack, C. M. P., Østergaard, L. Transformation technology in the Brassicaceae. Genetics and Genomics of the Brassicaceae. , 505-525 (2011).
  16. Hoagland, D. R., Arnon, D. I. The water-culture method for growing plants without soil. California Agricultural Experiment Station Circular. 347 (347), 1-32 (1950).
  17. Saiki, R., et al. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science. 239 (4839), 487-491 (1988).
  18. Sun, Y., Sriramajayam, K., Luo, D., Liao, D. J. A Quick, cost-free method of purification of dna fragments from agarose gel. Journal of Cancer. 3, 93-95 (2012).
  19. Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (12), 5463-5467 (1977).
  20. Bertani, G. Studies on Lysogenesis I. The mode of phage liberation by lysogenic Eschericia coli. Journal of Bacteriolgy. 62 (3), 293-300 (1951).
  21. Koncz, C., Martini, N., Szabados, L., Hrouda, M., Bachmair, A., Schell, J. Specialized vectors for gene tagging and expression studies. Plant Molecular Biology Manual. , 53-74 (1994).
  22. Weigel, D., Glazebrook, J. Transformation of Agrobacterium using electroporation. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (30), (2006).
  23. Murray, M. G., Thompson, W. F. Rapid isolation of high molecular weight plant DNA. Nucleic Acids Research. 8 (19), 4321-4326 (1980).
  24. Inan, G. Salt cress. a halophyte and cryophyte Arabidopsis relative model system and its applicability to molecular genetic analyses of growth and development of extremophiles. Plant Physiol. 135 (3), 1718-1737 (2004).
  25. Ghedira, R., De Buck, S., Nolf, J., Depicker, A. The efficiency of Arabidopsis thaliana floral dip transformation is determined not only by the Agrobacterium strain used but also by the physiology and the ecotype of the dipped plant. Molecular Plant-Microbe Interactions. 26 (7), 823-832 (2013).
  26. Shaohong, F. U., Xianya, W. E. I., Yingze, N. I. U., Shixing, G. U. O. Transformation of Brassica napus with the method of floral-dip. Biotechnology: Genomics and Its Applications. , 45-49 (2005).
  27. Li, J., Tan, X., Zhu, F., Guo, J. A rapid and simple method for Brassica napus floral-dip transformation and selection of transgenic plantlets. International Journal of Biology. 2 (1), 127 (2010).
  28. Li, H. Q., Xu, J., Chen, L., Li, M. R. Establishment of an efficient Agrobacterium tumefaciens-mediated leaf disc transformation of Thellungiella halophila. Plant Cell Reports. 26 (10), 1785-1789 (2007).
  29. Wu, G., Rossidivito, G., Hu, T., Berlyand, Y., Poethig, R. S. Traffic lines: New tools for genetic analysis in Arabidopsis thaliana. Genetics. 200 (1), 35-45 (2015).

Play Video

Cite This Article
Wang, G., Pantha, P., Tran, K., Oh, D., Dassanayake, M. Plant Growth and Agrobacterium-mediated Floral-dip Transformation of the Extremophyte Schrenkiella parvula. J. Vis. Exp. (143), e58544, doi:10.3791/58544 (2019).

View Video