Summary
Agrobacterium 중재 변환 꽃 딥 메서드를 사용 하 여 성공적으로 extremophyte 모델 Schrenkiella parvula의 안정적인 유전자 변형 라인을 만드는 데 사용할 수 있습니다. 선물이 프로토콜에서 애기 thaliana, 다른 성장 습관을 고려 하 고는 extremophyte의 생리 적 특성에 대 한 수정.
Abstract
Schrenkiella parvula 는 여러 이온 독성 스트레스를 포함 하 여 다양 한 abiotic 스트레스에 적응 하는 extremophyte입니다. 높은-품질 게놈 자원을 사용할 수 있는도 불구 하 고 식물 환경에 적응 하는 방법을 공부를 강조, 기능 유전체학 모델 값 고 도구 가능한 변환 시스템의 부족에 의해 제한 되어 있다. 이 프로토콜에서 우리는 안정적인 유전자 변형 미 parvula 를 생성 하는 방법을 보고 Agrobacterium 중재 꽃 딥 방법을 사용 하 여 라인. 우리는 A. thaliana 불확정 꽃 습관 등 잎에 높은 epicuticular 왁 스 콘텐츠 S. parvula의 독특한 특성에 대 한 계정에 사용 하는 변환 프로토콜을 수정 합니다. 간단히, S. parvula 씨앗 심기 전에 5 일 동안 4 ° C에서 층 화 되었다. 식물 photoperiod 14 h 빛과 어둠 10 h과는 130 µmol m-2s-1 빛의 강도, 22 ° C 24 ° c에서 성장 했다 8 9 주 된 식물 여러 inflorescences 변환에 대 한 선정 됐다. 이러한 inflorescences Agrobacterium tumefaciens GV3101의 pMP90RK 플라스 미드를 들고 침투 솔루션에서 감소 했다. 우리는 꽃 찍기 변환 효율을 높이기 위해 3 ~ 4 주 간격으로 2 라운드를 수행. T1 씨앗 수집 하 고 후보에 대 한 화면 발 변형 라인 전에 방와 컨테이너에 4 주 동안 건조 했다. 그만하 라고 저항 T1 식물에 사용 되었다. 우리는 가양성을 줄이기 위해 2 주 된 식물에서 시작 하는 3 일 간격으로 세 번 그만하 라고 솔루션을 살포. 그만하 라고 드롭 테스트 살아남는 진정한 긍정적인 transformants를 식별 하기 위해 개별 공장에서 수행 되었다. 변환 효율 0.033%, 10000 T1 씨앗 전파 당 3-4 유전자 변형 식물을 양보 했다.
Introduction
이 프로토콜에서 성장 및 extremophyte 모델 Schrenkiella parvula에 대 한 안정적인 유전자 변형 라인의 설립을 설명합니다. 효율적인 변환 시스템의 가용성은 어떤 다양 한 유전자 모델의 특징 이다. 극한 환경에서 번 창 하는 식물 extremophytes, 식물 환경 스트레스에 적응을 이해 하기 위한 중요 한 리소스 제공 이라고 합니다. Schrenkiella parvula (이전 Thellungiella parvula , Eutrema parvulum) 게놈 자원1,2,3,,45를 확대와 함께 한 같은 extremophyte 모델입니다. 그러나, 변환 프로토콜 하지 아직 보고 되었습니다 S. parvula 에 대 한 게시 된 연구.
S. parvula 의 게놈 십자화과 (겨자 양배추 가족)에 첫 번째 게시 된 extremophyte 게놈 이며 비 extremophyte 모델, 애기 thaliana1광범위 한 전체 게놈 synteny를 보여줍니다. 따라서, A. thaliana S. parvula 사이 비교 연구 A. thaliana 어떻게 parvula S. 게놈 진화 있으며 규제에 유익한 가설을 수행 하는 유전자 연구의 재산에서 혜택을 수 있는 다르게 대처에 극단적인 환경5,,67강조 합니다. S. parvula 는 가장 소금 관대 (토양 NaCl LD50 기준) 알려진된 야생 친척 중의 종 A. thaliana8중 하나입니다. NaCl 내성 이외 S. parvula 통과 대부분 식물7독성 높은 농도에서 여러 소금 이온의 존재 그것의 수명 주기를 완료. 그것의 자연 서식 지에서 널리 퍼진 abiotic 스트레스에 대응, 그것 중 여러 연구에서 생화학 또는 생리 적 레벨 8,,910, 다양 한 특성을 진화 했다 11.
2010 년부터 대상 종으로 S. parvula 를 사용 하거나 다른 식물 게놈 비교에 사용 하는 400 개 이상의 피어 reveiwed 게시 되었습니다. 그러나, 분명 병목 어떤 유형의 연구를 실시 했습니다의 면밀 한으로 확인 될 수 있습니다. 대부분의 이러한 보고서의 미래 연구에 S. parvula 의 잠재적인 사용을 논의 하거나 비교 genomic 또는 phylogenomic 연구에서 그것을 사용 하 여. 개념 증명 변환 프로토콜의 부족으로 인해 설립 S. parvula에 대 한 날짜에 사용할 수 있는 최고 품질 식물 게놈의 한이 있는도 불구 하 고 기능 게놈 연구에 사용 되지 않은 (> 5 Mb contig N50) 조립 및 염색체 수준 pseudomolecules1에 주석을 답니다.
Agrobacterium 중재 꽃 dip 변환 방법 A. thaliana에서 trasngenic 라인을 만드는 가장 광범위 하 게 사용 되는 방법은 되고있다 그리고 변환의 재현 시스템의 개발은으로 그것의 성공에 중요 한 요소는 유전자 모델12,13. 그러나, 모든 십자화과 종 A. thaliana개발 꽃 딥 방법을 사용 하 여 변환 성공적으로 표시 되었습니다. 특히, S. parvula 를 포함 하는 십자화과 리니지 II 종 꽃-딥 기반된 변환 방법14,15고집 불통 되었습니다.
S. parvula, 그것의 좁은 잎 형태와 결합의 불확정 꽃 성장 습관 도전 표준 Agrobacterium 중재 꽃 딥 변환 방법을 채택 했다. 이 연구에서 우리는 수정 된 프로토콜 S. parvula의 재현성 변화에 대 한 개발 했습니다 보고 합니다.
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Protocol
1. 식물 성장
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종자 살 균 (선택 사항)
- 이중 증 류 물 (ddH2O) 1 표 백제 50% 준비 또는 비 이온 세제의 2 상품 ( 재료의 표참조) 50 mL 튜브에. 여러 번 솔루션을 혼합 튜브를 반전.
참고: 그것은 층 류 캐비닛 15 분 동안 UV 살 균된 표면 살 균 씨를 수행 하는 것이 좋습니다. - ~ 100-200 표 백제 솔루션 추가 1.5 mL 튜브에 S. parvula 씨. 철저 하 게 혼합 하 고 튜브를 5 분 동안 앉아 보자.
- 튜브에서 표 백제를 제거 하 고 70% 에탄올을 추가. 여러 번 pipetting으로 씨앗을 세척 하 고 에탄올 솔루션을 즉시 제거.
- 초과 표 백제 및 에탄올, 제거 하는 소독된 물에 씨앗을 씻어 다음 물을 제거 합니다. 5 ~ 6 배가이 단계를 반복 합니다.
- 이중 증 류 물 (ddH2O) 1 표 백제 50% 준비 또는 비 이온 세제의 2 상품 ( 재료의 표참조) 50 mL 튜브에. 여러 번 솔루션을 혼합 튜브를 반전.
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씨앗 층 리
- 소독된 물에 씨앗을 담가 그리고 4 ° c.에 5 ~ 7 일 동안 저장 또는, 젖은 토양에 직접 말린된 unsterilized 씨앗을 뿌리 다 하 고 토양 트레이 4 ° c.에 5 ~ 7 일에 대 한 장소
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변화의 준비에서 성장 하는 식물
- 작성 토양 7 x 6 cm2 냄비에 ( 재료의 표참조)를 혼합, 냄비, 물에 담가 고 균일 하 게 젖은 성장 매체를 되도록 위에서 물 스프레이. 각 포트의 토양 표면에 5-비료 구슬 ( 재료의 표참조)를 추가 합니다.
참고: 마찬가지로 지금까지 우리가 경험한 S. parvula A. thaliana 성장할 수 있는 토양 혼합에서 잘 자 랍니다. - 젖은 이쑤시개를 사용 하 여 전송 20 ~ 25 씨앗 토양 표면에 당.
참고: 편리한 방법은 네 모퉁이 냄비 (그림 1, 하루 15, 왼쪽된 패널)의 센터에 4-5 씨앗의 배치를 넣어 것입니다. - 발 아 중 높은 습도에서 씨앗을 계속 분명 돔 냄비 트레이 커버.
- 공장 트레이 성장 챔버에 130 µmol m−2 s− 1 , 22-24 ° C 온도, 조명과 밤 사이클 당 하루/10 h 당 14 h에서 빛의 강도 유지. 7-10 일 발 아 후 돔을 제거 합니다. 바람직한 수준에 균일 하 게 습 토양을 유지 하는 쟁반의 바닥에서 물을 추가 합니다.
- 여분의 묘 밖으로 대마초와 냄비 (그림 1, 하루 15, 오른쪽 패널) 서로 잘 분리 당 유일한 4-5 건강 한 묘를 두고.
- 부드럽게 물 식물 2 일 마다 하 고 교류가 솔루션16 x 0.2와 거 름을 한 번 매 2 주.
참고: 균일 한 수준에 토양 수 분을 유지 하는 것은 키 성장과 S. parvula 일관 되 게 건강 하. - 여러 inflorescences 생산 공장 (그림 1, 하루 60-80) 당 100-150 꽃 봉 오리 때까지 8-10 주 동안 식물 성장을 계속 합니다. 당일 꽃 딥 기반된 변환 (4.5 단계)에 대 한 계획, 식물에서 모두 성숙 하 고 발전 siliques를 제거 합니다.
- 작성 토양 7 x 6 cm2 냄비에 ( 재료의 표참조)를 혼합, 냄비, 물에 담가 고 균일 하 게 젖은 성장 매체를 되도록 위에서 물 스프레이. 각 포트의 토양 표면에 5-비료 구슬 ( 재료의 표참조)를 추가 합니다.
2. 공장 변환에 대 한 벡터에 관심사의 유전자 또는 Genomic 요소 복제
- 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR)17 분리 젤 추출을 사용 하 여 PCR 제품 키트 ( 재료의 표참조)을 사용 하 여 대상 DNA 파편을 증폭 키트 프로토콜 또는 정화 DNA agarose 젤을 사용 하 여 다른 적절 한 방법을 전기 이동 법17,18. 생어 시퀀싱19통해 격리 된 PCR 제품의 시퀀스를 확인 합니다.
- 복제의 복제 유능한 대장균 에 복제 구성 세포 topoisomerase 기반 복제를 사용 하 여 변환 벡터에 원하는 PCR 제품 키트 ( 재료의 표참조) 제조 업체의 지침에 따라.
- 적절 한 항생제, Luria Bertani20 (파운드) 한 천 세균성 성장 미디어 (표 1)에 변형 된 제품의 50 µ L를 확산 예., 50 µ g / mL Spectinomycin ( 재료의 표참조), 그리고 37 °에서 품 어 C 하룻밤입니다.
- 다음 날 5 – 10 단일 식민지를 선택, 적절 한 항생제로 액체 LB 매체에 접종 하 고 부드러운 하룻밤 37 ° C에서 흔들어와 품 어.
- 격리 플라스 미드 플라스 미드 격리를 사용 하 여 키트 ( 재료의 표참조)를 생어 시퀀싱19 통해 2.1 증폭 대상 시퀀스 제대로 복제 여부를 확인 합니다.
- 복제 및 확인 된 PCR 제품을 전송 공장 변환 ( 재료의 표참조) 복제 재결합 기반 호환에 대 한 대상 벡터 ( 재료의 표참조), 다음 키트 recombinase 효소 혼합을 사용 하 여 장비 제조 업체의 지시입니다. 2.3 단계에서 단계로 2.5 분리 하 고 적절 한 플라스 미드 구조를 은닉 하는 클론을 확인을 반복 합니다.
3. 변환 벡터 생성 식물의 변화를 위한 Agrobacterium tumefaciens
- A. tumefaciens 스트레인 GV3101:pMP90RK21, 리 팜 피신 저항 유전자 염색체 배경 선택에 대 한 항구는 2.6에서 벡터 구성의 플라스 미드를 변환 합니다. 예를 들어 Gentamycin 또는 대 적절 한 항생제를 사용 하 여 ( 재료의 표참조), 식물의 선택에 대 한 변환 구성 (Ti 플라스 미드). A. tumefaciens electroporation 통해 변환에 대 한 간단한 프로토콜 섹션 3.2에에서 포함 됩니다.
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A. tumefaciens 변환 electroporation에 의해
- A. tumefaciens 유능한 세포22 얼음에 녹여 2.6에서 준비 하는 플라스 미드의 믹스 0.1-1 µ g ddH2O, 얼음에 유능한 세포와의 1-2 µ L에 녹아. Electroporation 베트로 혼합물을 전송 ( 재료의 표참조).
- 플라스 미드와는 electroporator를 사용 하 여, 3.2.1에서 유능한 세포의 혼합물에 electroporation 수행 ( 재료의 표참조) 제조 업체의 지침에 따라.
참고: electroporation 시작 하기 전에 멧의 표면 청소. - 액체 LB의 1.5 mL를 포함 하는 microcentrifuge 튜브에는 베트에서 반응 혼합물을 전송 pipetting으로 잘 혼합 하 고 부드러운 떨고와 28 ° C에서 1 시간에 품 어.
- 3.2 파운드 접시 포함 하는 적절 한 선택 항생제에 섹션에서 변환 된 A. tumefaciens 를 접종 (예: 대 25 µ g / mL, Spectinomycin 50 µ g / mL, Gentamycin 25 µ g / mL, 그리고 리 팜 피신 50 µ g / mL)와 28 ° C에서 3 일 동안 품 어.
4. S. parvula 의 변화 Agrobacterium 중재
- 단일 변형 예방 살 균 50 mL 원뿔에 항생제 (3.3와 동일)를 포함 된 파운드 액체 미디어 10 mL에 격판덮개에서 식민지 튜브 ( 재료의 표참조). 떨고 인큐베이터에서 24 h에 대 한 품 어 ( 재료의 표참조)에서 250 r.p.m.에서 28 ° c.
- 메 마른 250 mL 플라스 크에 세균성 솔루션 3.4.1에서 전송, 적절 한 항생제로 파운드 액체 미디어의 40 mL를 추가 하 고 600 nm 파장 (OD600)에서 광학 밀도 약 2.0에 도달할 때까지 12 h를 품 어.
- 원심 10 분 제거에 대 한 A. tumefaciens cultureat 3100 x g 는 상쾌한 고 다시 A. tumefaciens 침투 솔루션 (표 1) 40 mL에 세균성 문화를 일시 중단.
- 최종 세600 0.8의 침투 솔루션 resuspended A. tumefaciens 를 희석. 계면 활성 제 솔루션 (표 1)의 25 µ L 희석된 A. tumefaciens 50 mL에 추가 솔루션 및 여러 번 반전에 의해 혼합.
- A. tumefaciens 솔루션 6 화분에서 꽃이 핌을 찍기 후 20 s. 사용 신선한 세균 솔루션에 대 한 섹션 4.4에에서 준비에 있는 식물의 꽃이 핌을 찍어. 모든 꽃은 솔루션 접촉 다는 것을 확인 하십시오. 피펫으로 솔루션으로 감소 될 수 없는 경우는 화 서의 아래 부분에 있는 꽃에 직접 세균 솔루션.
참고: 1 라운드 변환에 대 한 날카로운 메스 또는 작은 위를 사용 하 여 모든 성숙 하 고 발전 siliques를 제거 해야 합니다. 두 번째 시간에 대 한 변환을 수행 하는 경우에 siliques을 제거 하지 마십시오.
5. 후 변환 공장 관리와 두 번째 변환
- 1-2 일에 대 한 어두운 성장 방에 식물을 커버 하는 돔 가진 깨끗 한 쟁반에 담근 꽃 식물을 가로로 놓습니다.
참고: 높은 습도 아래 꽃을 유지 하는 것은 (그림 1, 변환 후에 식물)이이 단계에서 중요 하다입니다. - 수직 위치에 식물을 반환 하 고/10 일 밤 주기, 130 µmol m-2 s-1 빛의 강도 및 온도 22 ~ 24 ° C h 당 14 h로 성장 방에 식물을 전송.
- 다음 주에 담근된 inflorescences를 모니터링 합니다. 꽃의 상당수는 (그림 2)를 중단, 또는 꽃의 많은 수는 새로 개발 된 후 약 4 주 후 꽃 딥 (4 단계)를 반복 합니다.
참고: 첫 번째 변환 (단계 1.3.7)에 대 한 준비 단계와 달리 제거 하지 마십시오 siliques (그림 2)를 개발 하거나 기존 변환의 두 번째 라운드 전에. - 씨 성숙 하 고 ~ 21 주에 씨앗을 수확 때까지 식물을 성장.
- 실내 온도 밀폐 용기에 2-3 주 동안 건조 씨 방 ( 재료의 표참조)으로 가득 합니다.
6입니다. 긍정적인 Transformants의 선택
- 야생 타입 씨앗 1.2 1.3 단계에서 설명한 대로 T1 씨앗 공장.
- 처음 2 진정한 잎 개발, 발 아 후 약 10-14 일 때까지 식물을 성장.
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제 초 제 저항 (그림 3A와 3B)으로 아래에 대 한 첫 번째 선택 항목을 수행 합니다.
- Glufosinate 염화 (11.3%) 제 초 제 (또는 바스) 희석 (표 1) 1:1,000 (v/v)을. 묘에 희석된 바스 솔루션 스프레이 하 고 하룻밤 돔 가진 식물을 커버.
- 반복 2-3 회 분사 라고 매 5-7 일.
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아래로 바스 드롭 테스트를 사용 하 여 두 번째 선택을 수행 합니다.
- 그만하 라고 솔루션 3-4 회 분무 되 후 생존 하는 식물을 식별 합니다. 3-5 잎 비교적 큰 표면 영역을 개발할 때까지 또 다른 2-3 주에 대 한 식물을 성장.
- 식물 당 최대 성숙한 잎을 선택 하 고 왁 스 층을 제거 하는 손가락으로 부드럽게 잎의 표면을 문질러 (6.3.1 단계)에서 희석된 바스 솔루션의 드롭 장소.
참고: 그만하 라고 드롭과 가까운 줄기에 종이 테이프를 배치 하 여 적용 하는 잎의 위치를 표시 합니다. - 나뭇잎 바스 드롭 최대 1 주일까지 들고의 흔적에 대 한 적용을 모니터링 합니다. 그만하 라고 상품에 의해 영향을 받지 않는 잎을 가진 식물을 선택 합니다.
참고: 가장 거짓 양성 식물에서 잎 바스 솔루션의 드롭그림 3(C) 건조 후에 진정한 긍정에서 잎은 그대로 2 일 이내 시 들고를 시작 합니다.
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긍정적인 transformants 게놈 PCR를 사용 하 여 확인 합니다.
- 2-3 잎 단계 6.4.5에서 살아남은 식물에서 수집 합니다.
- CTAB 방법23 또는 다른 적절 한 DNA 추출 방법을 사용 하 여 잎에서 게놈 DNA를 추출 합니다.
- (긍정적인 컨트롤로) 대상 식물, 야생-타입 식물 (컨트롤로 부정적인), 단계 3.1에서에서 플라스 미드 구조에서 추출 된 genomic DNA 견본을 사용 하 여 PCR을 수행 합니다. 예를 들어 선택적 마커 유전자 특정 PCR 뇌관의 적절 한 쌍을 사용 하 여, 라고 내성 유전자 (바), TCAGCAGGTGGGTGTAGA (앞으로)와 GTCAACCACTACATCGAGACAA (반전)에 대 한.
- 예제에서는 PCR 뇌관 바 유전자를 대상으로 사용 하 여 다음 PCR 조건: 30 98 ° C에 초기 변성 단계 s; 뒤에 98 ° C 30에서 변성 시키기의 30 주기 s, 59 ° C 30에서 어 닐 링 s, 그리고 30 대 72 ° C에서 확장 s; 그리고 5 분 동안 72 ° C에서 최종 확장.
참고: 전체 T-DNA의 삽입을 위해,이 좋습니다 또한 선택적 마커 유전자에서 PCR 뇌관을 사용 하 여 게놈 PCR을 수행 하 고 다른 PCR 뇌관 대상 시퀀스에 단계에서 공장 변환 벡터를 복제
- 예제에서는 PCR 뇌관 바 유전자를 대상으로 사용 하 여 다음 PCR 조건: 30 98 ° C에 초기 변성 단계 s; 뒤에 98 ° C 30에서 변성 시키기의 30 주기 s, 59 ° C 30에서 어 닐 링 s, 그리고 30 대 72 ° C에서 확장 s; 그리고 5 분 동안 72 ° C에서 최종 확장.
- Agarose 젤 전기 이동 법17 대상 샘플(그림 4)에 대 한 뿐만 아니라 사용 하 여 격리 된 PCR 제품19 시퀀싱 증폭된 바 PCR 제품의 예상된 크기의 존재를 확인 2.1 단계 에서처럼 동일한 절차입니다.
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Representative Results
우리는 150 일 이내 T0 씨앗의 수확을 가능 하 게 변환 프로토콜을 A. thaliana에서 수정 꽃 딥 방법을 사용 하 여 개발 했다. 그림 1 타임 라인 및 S. parvula 식물 꽃 딥 통해 변화를 실행 하기 위한 최적의 단계를 나타내는 요약을 보여 줍니다. 우리는 변환에 대 한 대상 무대도 발 아 후 60-80 일에 여러 inflorescences에 S. parvula 70 –80 꽃을 가진 식물을 선택. 기존의 오픈 또는 수정 된 꽃 및이 단계에서 siliques의 작은 수 꽃 dip 방법으로 A. tumefaciens 침투 하기 전에 제거 되었다. A. tumefaciens 감염 (그림 2(a) 괄호) 꽃의 낙태 귀착되는. Siliques 꽃 딥 변형된 씨앗 (그림 2, 브래킷 (b))을 포함 것 후에 완벽 하 게 개발. 변환 후에 미 parvula 으로 식물 건강 (그림 2, 흰색 화살표)를 유지 했다 새로운 inflorescences와 꽃 개발을 계속 했다. 이 미정 개화 습관 때문 식물 스트레스 나 노화의 징후를 표시 하지 않습니다 경우 변환의 두 번째 라운드를 수행할 수 있습니다. 그림 2 A 와 2B 보여줍니다 S. parvula 식물의 변환의 첫 번째 및 두 번째 라운드 후 각각 서로 25 일. 두 번째 변환에서 기존 siliques 해야 제거할 수 없습니다 때문에 그들은 유전자 변형 종자를 포함 될 수 있습니다. 또한, A. tumefaciens 적용할 수 pipetting 침투 솔루션 (표 1)에 의해 새로 신흥 꽃 클러스터, 처음부터 siliques을 피해를 최소화 하기 위해 솔루션으로 전체 촬영을 찍기 대신에 변환입니다.
변환 효율은 현재 프로토콜을 사용 하 여 전파 하는 10000 T1 씨앗 당 3-4 유전자 변형 식물 저조한 0.033%. 이 예상 ~ 50000 T1 씨앗 10 독립적인 변환 시도 하는 동안 테스트를 기반으로 합니다. 효율성은 애기 thaliana보다 낮은, 그것은 다른 extremophyte 식물 Eutrema salsugenium24 의 변화와 애기 thaliana ecotypes25의 일부에 비해. 변환 효율 대체 Agrobacterium 긴장 및 계면 활성 제와 침투 솔루션의 수정을 사용 하 여 추가 최적화 될 수 있습니다. 여러 바스 스프레이 드롭 테스트 (6.3, 6.4 단계) 진정한 긍정적인 transformants를 확인 하 고 샘플 단계 6.5(그림 4)에서 PCR 확인을 사용 하 여 테스트의 수를 감소에 중요 한 것. 복제 시퀀스 취재 원 유전자 (그림 4B) 포함 되어 있는 경우 변환의 더 확인 취재 원 유전자 발현을 확인할 수 있습니다.
그림 1 : S. parvula 변환의 타임 라인. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: S. parvula 식물 꽃 dip.로 변환 후 식물 촬영된 10 일 후에 첫 번째 꽃-하루 60 (A)과 25 일 꽃-딥 하루 85 (B)에서 두 번째 라운드 후 했다. Agrobacterium 와 침투 괄호는 는에서 같이 꽃의 silique 개발을 중단 수 있습니다. Siliques 꽃 딥 변형된 씨앗 (대괄호 b)를 포함할 가능성이 후에 완전 개발. 흰색 화살표는 꽃과 inflorescences 각 변환 후 새로 등장을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : 그만하 라고 저항을 기반으로 하는 다양 한 미 parvula transformants. (A) 바스 스프레이 하기 전에 T1 묘. (B) 빨간색 원이 1 라운드 선택 바스 스프레이 의해 살아남은 후보자 transformant를 나타냅니다. (C) 라고 하 여 두 번째 라운드 선택 드롭 테스트 합니다. 가양성 (상단 패널)와 진정한 유전자 변형 식물 (하단 패널)의 예로 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 : S. parvula 변환 확인. S. parvula 식물에서 추출한 게놈 DNAs에서 바 유전자의의 (A) PCR 증폭 레인 1과 13: 크기 마커; 레인 2: 부정적인 제어; 레인 3-5: 야생-타입 S. parvula ; 레인 6-10: 유전자 변형 미 parvula 후보자; 레인 11, 12: 벡터 제어 합니다. 7, 8, 및 9 레인 예증 긍정적인 transformants. 긍정적인 거 스 기자 유전자 발현의 (B) 예 미 parvula transformant. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 미디어 / 솔루션 | 시 약 | 금액 |
| Luria Bertani (파운드) 세균성 성장 미디어 | NaCl Tryptone 효 모 추출 물 한 천 (번호판)에 대 한 ddH2O |
10 g 10 g 5 g 20 g 955 mL |
| Agrobacterium 침투 솔루션 | MS 소금 (1/4 x) B5 비타민 (1x) 자당 (5%w/v) MES N6-benzylaminopurine (BA) Silwet L-77 (0.05%v/v) pH |
2.16 g 1 mL 50 g 0.5 g 10 Μ L 500 Μ 5.7 |
표 1: 세균성 성장 매체의 구성 및 Agrobacterium 침투 솔루션.
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Discussion
식물의 생리 적 상태 변환25의 효율을 크게 영향을 줍니다. 변환에 대 한 건강 하 고 활기찬 식물의 사용 S. parvula에서 성공적인 변환에 대 한 주요 요구 사항입니다. 물 또는 가벼운 스트레스 식물 변환 (그림 1, 센터 패널)에 대 한 이상적인 건강 한 식물에 비해 적은 꽃 있을 것 이다. S. parvula 는 빛의 강도에 성장할 수 있는 보다 작은 130 µmol m-2의 -1하지만 식물 경향이 frailer; 이러한 식물 들이 더 이어질 것 이다 꽃 꽃 찍어 다음 중단. S. parvula 보다 더 높은 속도로 Agrobacterium 담근 꽃을 중단 하는 경향이 있다 A. thaliana. 따라서, 중단된 꽃 A. tumefaciens 침투 솔루션에서는 감소 하는 경우를 최소화 하기 위해 이동 하는 모든 단계는 높은 변환 효율성에 기여 한다. 하루 14 h 보다 더 이상 가벼운 기간을 권장합니다. 종종, A. thaliana 의 변화 또는 지속적인 빛 에서도 긴 하루 조건 (예: 18 h 라이트와 6 h 다크)에 성장 하는 식물에 수행 됩니다. 그러나, 우리는 덜 탄력 S. parvula 식물에 이러한 관행 결과 발견 하 고 낮은 변환 효율으로 이어질.
꽃 봉 오리는 S. parvula (그림 2, 흰색 화살표)의 화 서 축에 지속적으로 생산 됩니다. 따라서, 새로운 꽃의 변화를 수 있도록 긍정적인 transformants를 얻기의 기회가 크게 증가할 것입니다. 두 번째 꽃-수영 (단계 5.3) 필수, 하지만 강력 하 게 제안 하지 않습니다. 그러나,이 단계는 상대적으로 시간이 걸리는 A. thaliana 꽃 찍기에 비해 S. parvula 여러 화 서 축 생산 하기 때문에.
야생-타입 S. parvula 는 비록 바스 스프레이 (단계 6.3) 긍정적인 transformants에 대 한 초기 화면 100 씨앗 세균 (그림 3A 와 3B) 5-8 살아남은 식물을 떠날 것 이다 라고에 민감합니다. 이것의 대부분 (> 80%) 오판이 될 것입니다. 이것은 크게 좁은 잎 형태와 S. parvula의 잎 각도 표현 형을 관찰 하는 충분 한 기간에 대 한 바스 솔루션을 유지 하는 적절 한 방향에 충분 한 잎 표면을 제공 하지 않습니다. 또한, S. parvula10adaxial 잎 표면 왁 스 높은 콘텐츠로 인해 그것은 그만하 라고에 대 한 더 통하지 않는 표면을 만들 경향이 있다. 따라서, 개별 잎 (6.4 그림 3C단계)에 바스 드롭을 사용 하 여 긍정적인 transformants에 대 한 두 번째 검사 PCR 가양성 (단계 6.5)의 수백에 테스트를 피하기 위해 필수적인 단계는.
현재 프로토콜 pMP90RK 플라스 미드를 운반 하 여 A. tumefaciens 긴장 GV3101 테스트 했다. 변환의 효율성 다른 A. tumefaciens 긴장, A. thaliana 에서에서 변환 효율을 높이 보고 pMP90 독성 플라스 미드와 긴장 ABI, LMG20, 및 C58C1 Rifr를 포함 하 여 향상 될 수 있습니다. 25. 브라 시카 및 Eutrema 동물 taxonomically 더 밀접 하 게 관련 parvula S. A. thaliana1에 비해. 따라서, A. tumefaciens 브라시카 napus 및 EHA105 Eutrema salsugineum 를 변환 하는 데 성공적으로 사용 된 더 높은 변환 제공할 수 있습니다 긴장을 변환 하는 데 성공적으로 사용 된 LBA4404 변형 긴장의 보고 된 효율 보다 효율은 현재26,,2728을 사용합니다.
시간과 노동 변환 프로토콜에 필요한 변환 효율 향상에 또 다른 중요 한 요소 이다. 잎에 개별 바스 방울을 배치 하 고 여러 식물 (단계 6.4)에 주에 대 한 리프를 모니터링 지루한 있습니다. 변환 효율성을 증가 하는 미래의 노력 적절 한 대체 선택 가능한 마커 유전자29에 대 한 검색 수 있습니다.
설립된 변환 프로토콜의 가용성 크게 유전자 및 생존 여러 abiotic 스트레스2,4extremophyte 모델 식물을 허용 하는 새로운 메커니즘을 식별 하는 우리의 기능을 사전 것입니다. S. parvula 에 새로운 유전 변이 됨으로 상대적으로 스트레스에 민감한 모델, A. thaliana 스트레스 반응 유전자 집단 유전자 변이에서 채굴 될 수 없는 유전 변이의 광범위 한 수영장을 제공 합니다. 팬-게놈5,6. 따라서, 우리의 꽃 딥 기반된 A. tumefaciens 중재 변환 프로토콜 S. parvula 에 대 한 개발 extremophyte 모델 A. 밀접 하 게 관련 기능 게놈 실험을 수행 하기 위해 이러한 도구에 대 한 필요성에 대 한 갭을 채울 것입니다. thaliana.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작품은 국립 과학 재단 수상 MCB 1616827에 의해 지원 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | VWR International, Radnor, PA | 90000-762 | Bacto Agar Soldifying Agent, BD Diagnostics |
| B5 vitamins | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | G1019 | Gamborg’s Vitamin Solution |
| Desiccant | W A Hammond Drierite, Xenia, OH | 22005 | Indicating DRIERITE 6 mesh |
| Destination vector for plant transformation | TAIR | Vector:6531113857 | pKGWFS7 |
| Electroporation cuvette | USA Scientific | 9104-5050 | Electroporation cuvette, round cap, 0.2 cm gap |
| Electroporator | BIO-RAD Laboratories, Hercules, CA | 1652100 | MicroPulser Electroporator |
| Fertilizer beads | Osmocote Garden, Marysville, OH | N/A | Osmocote Smart-Release Plant Food Flower & Vegetable |
| Gel extraction kit | iNtRON Biotechnology, Boston, MA | 17289 | MEGAquick-spin Total fragment DNA purification kit |
| Gentamicin | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | G1914-5G | Gentamicin sulfate |
| Glufosinate-ammonium (11.3%) herbicide (BASTA) | Bayer environmental science, Montvale, NJ | N/A | FINALE herbicide |
| Kanamycin | VWR International, Radnor, PA | 200004-444 | Kanamycin monosulfate |
| MES | Bioworld, Dublin, OH | 41320024-2 | MES, Free Acid |
| MS salt | MP Biomedicals, Santa Anna, CA | 092621822 | Hoagland's modified basal salt mixture |
| N6-benzylaminopurine (BA) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | B3274 | 6-Benzylaminopurine solution |
| NaCl | Sigma-Alrich | S7653 | Sodium chloride |
| Non-ionic detergent | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 9005-64-5 | TWEEN 20 |
| Plasmid isolation kit | Zymo Research, Irvine, CA | D4036 | Zyppy Plasmid Kits |
| Recombinase enzyme mix kit | Life Technology | 11791-020 | Gateway LR Clonase II Enzyme mix |
| Rifampicin | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | R3501-1G | Rifampicin, powder, ≥ 97% (HPLC) |
| Shaking incubator | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA | SHKE4450 | MaxQ 4450 Benchtop Orbital Shakers |
| Soil mix | Sun Gro | SUN239223328CFLP | Sun Gro Metro-Mix 360 Grower Mix |
| Spectinomycin | VWR International, Radnor, PA | IC15206705 | |
| Sterile 50 mL conical tubes | USA Scientific, Ocala, FL | 1500-1811 | 50 mL conical screw cap tubes, copolymer, racks, sterile |
| Sucrose | VWR International, Radnor, PA | 57-50-1 | Sucrose, ACS |
| Surfactant solution | Lehle seeds, Round Rock, TX | VIS-02 | Silwet L-77 |
| Topoisomerase-based cloning kit | Life Technologies, Carlsbad, CA | K240020 | pENTR/D-TOPO Cloning Kit, with One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli |
| Tryptone | VWR International, Radnor, PA | 90000-282 | BD Bacto Tryptone, BD Biosciences |
| Yeast Extract | VWR International, Radnor, PA | 90000-722 | BD Bacto Yeast Extract, BD Biosciences |
References
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