Summary

Pflanzen Sie Wachstum und Agrobakterium-vermittelten Floral-Dip Transformation des Extremophyte Schrenkiella parvula

Published: January 07, 2019
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Summary

Agrobakterium-vermittelten Transformation mit einem floral-Dip-Methode kann erfolgreich eingesetzt werden, stabilere transgene Linien des Modells Extremophyte Schrenkiella Parvulaerstellen. Wir präsentieren Ihnen ein Protokoll aus, die für Arabidopsis Thaliana, unter Berücksichtigung verschiedener Wachstum Gewohnheiten und physiologischen Eigenschaften der Extremophyte modifiziert.

Abstract

Schrenkiella Parvula ist eine Extremophyte, die verschiedenen abiotischen Belastungen ausgesetzt, darunter mehrere Ionen-Toxizität betont angepasst. Trotz hoher Qualität genomischer Ressourcen zur Verfügung zu studieren, wie Pflanzen sich an ökologischen anpassen betont seinen Wert als ein Modell der funktionellen Genomik und Werkzeug hat durch das Fehlen eines Systems möglich Transformation beschränkt worden. Wir berichten in diesem Protokoll wie stabile transgenen S. Parvula erzeugt Linien mit einem Agrobakterium-vermittelten floral-Dip Verfahren. Wir modifiziert das Umwandlung Protokoll A. Thaliana , um einzigartige Merkmale von S. Parvula, wie eine unbestimmte blühenden Gewohnheit und eine hohe epikutikulären Wachsgehalt auf den Blättern zu berücksichtigen. Kurz, waren S. Parvula Samen bei 4 ° C für fünf Tage vor der Aussaat stratifiziert. Pflanzen wurden angebaut an eine Photoperiode 14 h Licht und dunkel 10 h und eine 130 µmol m-2s-1 Lichtintensität, bei 22 ° C bis 24 ° C. Acht bis neun Wochen alten Pflanzen mit mehreren Blütenständen wurden für die Transformation ausgewählt. Diese Blütenstände wurden in einer Infiltration-Lösung von Agrobacterium Tumefaciens GV3101 tragen das Plasmid pMP90RK getaucht. Wir führten zwei Runden der Blume mit einem Intervall von drei bis vier Wochen zur Steigerung der Effizienz der Umwandlung eintauchen. Die T1-Samen wurden gesammelt und getrocknet für vier Wochen in einem Behälter mit Trockenmittel, bevor Keimung zum Bildschirm für Kandidaten Linien umgewandelt. Widerstand gegen BASTA diente T1 Pflanzen auf den Bildschirm. Die BASTA-Lösung besprüht wir dreimal mit einem Abstand von drei Tagen ab zwei Wochen alten Pflanzen, Fehlalarme zu reduzieren. Ein BASTA Drop durchgeführt wurde auf die Überlebenden Einzelpflanzen um wahre positive Transformanten zu identifizieren. Die Transformationseffizienz war 0,033 %, 3 – 4 transgene Pflanzen pro 10.000 T1 Samen vermehrt nachgeben.

Introduction

In diesem Protokoll beschreiben wir das Wachstum und die Schaffung von stabilen transgenen Linien für das Extremophyte Modell Schrenkiella Parvula. Die Verfügbarkeit eines effizienten Transformation-Systems ist ein Markenzeichen von jedem vielseitige genetisches Modell. Pflanzen, die in extremen Umgebungen, bezeichnet als Extremophytes, liefern eine wichtige Ressource für das Verständnis Pflanze Anpassungen an Umweltbelastungen. Schrenkiella parvula (ehemals Thellungiella Parvula und Eutrema Parvulum) ist ein solches Extremophyte-Modell, mit der Erweiterung genomischer Ressourcen1,2,3,4,5. Jedoch wurden Umwandlung Protokolle nicht noch für S. Parvula in veröffentlichten Studien berichtet.

Das Genom von S. Parvula ist das erste veröffentlichte Extremophyte Genom in Brassicaceae (Senf-Kohl-Familie) und zeigt eine umfangreiche allgemeine Genom trägt mit dem nicht-Extremophyte Modell, Arabidopsis Thaliana1. So könnten Vergleichsstudien zwischen A. Thaliana und S. Parvula profitieren aus der Fülle der genetischen Studien auf A. Thaliana zu informativen Hypothesen über wie das Genom S. Parvula reguliert entwickelt und hat anders zur Bewältigung betont extremer Umwelt5,6,7. S. Parvula ist eines der am meisten salztoleranten Arten (basierend auf Boden NaCl LD50) unter bekannten wilden Verwandten von A. Thaliana8. Neben der NaCl-Toleranz S. Parvula überlebt und seines Lebenszyklus in Anwesenheit von mehreren Salzionen in hohen Konzentrationen giftig für die meisten Pflanzen7vervollständigt. In Reaktion auf die abiotischen betont in seinem natürlichen Lebensraum weit verbreitet hat es verschiedene Merkmale entwickelt, unter denen mehrere biochemische oder physiologische Ebene 8,9,10untersucht worden sind, 11.

Seit 2010 über 400 Peer-getestet-Publikationen, die als ein Zielarten S. Parvula verwendet oder im Vergleich mit anderen Pflanzengenomen verwendet. Jedoch konnte ein klare Engpass identifiziert werden, mit einem genaueren Blick der welche Art von Studien sind durchgeführt worden. Die meisten dieser Berichte die mögliche Verwendung von S. Parvula in zukünftigen Studien zu diskutieren oder in vergleichende genomische oder Phylogenomic Studien verwenden. Aufgrund des Fehlens eines Proof-of-Concept-Transformation-Protokolls eingerichtet für S. Parvula, es nicht in funktionelle Genomik Studien, trotz des Habens eines der höchsten Qualität Pflanzengenomen bisher verfügbaren verwendet wurde (> 5 Mb Contig N50) montiert und kommentiert in Chromosom-Ebene Pseudomolecules1.

Floral-Dip Transformationsmethode Agrobakterium-vermittelten geworden die meisten allgemein verwendeten Methode zum Erstellen von Trasngenic Linien in A. Thalianaund eine reproduzierbare System Transformation entwickelte sich ein kritischer Faktor für seinen Erfolg als eine genetischen Modell12,13. Nicht alle Brassicaceae Arten ist jedoch nachweislich erfolgreich umgewandelt werden mit der floral-Dip-Methode für A. Thalianaentwickelt. Speziell, wurde die Brassicaceae Lineage II-Arten, die S. Parvula gehören widerspenstigen bis floral-Dip nach Umwandlung Methoden14,15.

Die unbestimmten Blüte Wuchsform von S. Parvula, kombiniert mit seiner schmalen Blatt Morphologie machte es schwierig, die standard Agrobakterium-vermittelten floral-Dip Transformationsmethode zu verabschieden. In dieser Studie berichten wir über das geänderte Protokoll, die, das wir für reproduzierbare Transformation von S. Parvulaentwickelt haben.

Protocol

1. Pflanzenwachstum Samen Sterilisation (optional) Bereiten Sie 50 % Bleichmittel in bidestilliertem Wasser (DdH2O) mit 1 oder 2 Tropfen eines nichtionischen Waschmittels (siehe Tabelle der Materialien) in einem 50 mL-Tube. Invertieren Sie das Rohr mehrmals, um die Lösung zu mischen.Hinweis: Es empfiehlt sich, Samen Sterilisation in einem Laminar-Flow Kabinett mit einer UV sterilisierte Oberfläche für 15 min durchzuführen. <…

Representative Results

Wir entwickelt eine Umwandlung Protokoll, die Ernte T0 Samen innerhalb von 150 Tagen kann, mit einer floralen-Dip-Methode aus, die für A. Thalianamodifiziert. Abbildung 1 zeigt eine Zusammenfassung der Chronik und S. Parvula Pflanzen, die die optimale Bühne für die Ausführung der Transformation durch blumig-Dip darstellen. Wir 70 –80 S. Parvula Blumenpflanzen in mehrere Blütenstände bei 60 bis 80 Tage nach der Kei…

Discussion

Der physiologische Zustand der Anlage beeinflusst maßgeblich die Effizienz der Umwandlung25. Die Verwendung von gesunde und kräftige Pflanzen für die Transformation ist eine wesentliche Voraussetzung für erfolgreiche Transformation in S. Parvula. Wasser oder leicht gestresste Pflanzen haben weniger Blüten, die im Vergleich zu den gesunden Pflanzen ideal für Transformation (Abbildung 1, Mittelkonsole). S. Parvula kann bei einer Lichtintensität …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde durch den National Science Foundation Award MCB 1616827 unterstützt.

Materials

Agar VWR International, Radnor, PA 90000-762 Bacto Agar Soldifying Agent, BD Diagnostics
B5 vitamins Sigma-Aldrich, St. Louis, MO G1019 Gamborg’s Vitamin Solution
Desiccant W A Hammond Drierite, Xenia, OH 22005 Indicating DRIERITE 6 mesh
Destination vector for plant transformation TAIR Vector:6531113857 pKGWFS7
Electroporation cuvette USA Scientific 9104-5050 Electroporation cuvette, round cap, 0.2 cm gap
Electroporator BIO-RAD Laboratories, Hercules, CA 1652100 MicroPulser Electroporator
Fertilizer beads Osmocote Garden, Marysville, OH N/A Osmocote Smart-Release Plant Food Flower & Vegetable
Gel extraction kit iNtRON Biotechnology, Boston, MA 17289 MEGAquick-spin Total fragment DNA purification kit
Gentamicin Sigma-Aldrich, St. Louis, MO G1914-5G Gentamicin sulfate
Glufosinate-ammonium (11.3%) herbicide (BASTA) Bayer environmental science, Montvale, NJ N/A FINALE herbicide
Kanamycin VWR International, Radnor, PA 200004-444 Kanamycin monosulfate
MES Bioworld, Dublin, OH 41320024-2 MES, Free Acid
MS salt MP Biomedicals, Santa Anna, CA 092621822 Hoagland's modified basal salt mixture
N6-benzylaminopurine (BA)  Sigma-Aldrich, St. Louis, MO B3274 6-Benzylaminopurine solution
NaCl Sigma-Alrich S7653 Sodium chloride
Non-ionic detergent Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 9005-64-5 TWEEN 20 
Plasmid isolation kit Zymo Research, Irvine, CA D4036 Zyppy Plasmid Kits
Recombinase enzyme mix kit Life Technology 11791-020 Gateway LR Clonase II Enzyme mix
Rifampicin Sigma-Aldrich, St. Louis, MO R3501-1G Rifampicin, powder, >= 97% (HPLC)
Shaking incubator ThermoFisher Scientific, Waltham, MA SHKE4450 MaxQ 4450 Benchtop Orbital Shakers
Soil mix Sun Gro SUN239223328CFLP Sun Gro Metro-Mix 360 Grower Mix
Spectinomycin VWR International, Radnor, PA IC15206705
Sterile 50ml conical tubes USA Scientific, Ocala, FL 1500-1811 50 ml conical screw cap tubes, copolymer, racks, sterile
Sucrose VWR International, Radnor, PA 57-50-1 Sucrose, ACS
Surfactant solution Lehle seeds, Round Rock, TX VIS-02 Silwet L-77
Topoisomerase-based cloning kit Life Technologies, Carlsbad, CA K240020 pENTR/D-TOPO Cloning Kit, with One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli
Tryptone VWR International, Radnor, PA 90000-282 BD Bacto Tryptone, BD Biosciences
Yeast Extract VWR International, Radnor, PA 90000-722  BD Bacto Yeast Extract, BD Biosciences

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Cite This Article
Wang, G., Pantha, P., Tran, K., Oh, D., Dassanayake, M. Plant Growth and Agrobacterium-mediated Floral-dip Transformation of the Extremophyte Schrenkiella parvula. J. Vis. Exp. (143), e58544, doi:10.3791/58544 (2019).

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