Summary

Planten groei en Agrobacterium-gemedieerde Floral-dip transformatie van de Extremophyte Schrenkiella parvula

Published: January 07, 2019
doi:

Summary

Agrobacterium-gemedieerde transformatie met een bloemen-dip-methode kan met succes worden gebruikt om het creëren van stabiele transgene lijnen van het extremophyte model Schrenkiella parvula. We presenteren een protocol aangepast ten opzichte van die voor Arabidopsis thaliana, overwegen verschillende groei gewoonten en fysiologische kenmerken van de extremophyte.

Abstract

Schrenkiella parvula is een extremophyte aangepast aan verschillende abiotische stress, met inbegrip van meervoudige ion toxiciteit druk. Ondanks hoge kwaliteit genomic middelen beschikbaar om te bestuderen hoe de planten zich aanpassen aan milieu benadrukt, zijn waarde als een model van de functionele genomica en gereedschap heeft is beperkt door het ontbreken van een haalbaar transformatie-systeem. In dit protocol rapporteren we hoe te genereren van stabiele transgene S. parvula lijnen met behulp van een methode met Agrobacterium-gemedieerde floral-dip. We bewerkt de transformatie-protocol dat wordt gebruikt voor A. thaliana ter verantwoording voor de unieke eigenschappen van S. parvula, zoals de gewoonte van een onbepaalde bloei en een gehalte aan hoge epicuticular was op Bladeren. S. parvula zaden waren kort, gelaagde bij 4 ° C voor vijf dagen voor het planten. Planten zijn geteeld op een fotoperiode van een 14 h licht en 10 uur donker en een 130 µmol m-2s-1 lichtintensiteit, bij 22 ° C tot 24 ° C. Acht tot negen weken oude planten met meerdere bloeiwijzen werden geselecteerd voor transformatie. Deze bloeiwijzen werden ondergedompeld in een oplossing van de infiltratie van Agrobacterium tumefaciens GV3101 uitvoering van de pMP90RK -plasmide. Wij uitgevoerd twee rondes van de bloem dompelen met een interval van drie tot vier weken de transformatie-efficiëntie te verhogen. De T1 zaden werden verzameld en gedroogd voor vier weken in een container met droogmiddelen alvorens kiemkracht aan het scherm voor kandidaat getransformeerd lijnen. Weerstand tegen BASTA werd gebruikt om het scherm T1 planten. Wij de oplossing BASTA gespoten driemaal met een tussenpauze van drie dagen vanaf twee weken oude planten om valse positieven. Een valproef BASTA werd uitgevoerd op het overleven van de individuele planten te identificeren waar positieve transformants. De efficiëntie van de transformatie was 0.033%, opbrengst 3 – 4 transgene planten per 10.000 T1 zaden gekweekt.

Introduction

In dit protocol beschrijven we de groei en de totstandbrenging van stabiele transgene lijnen voor het extremophyte model Schrenkiella parvula. De beschikbaarheid van een efficiënte transformatie-systeem is een kenmerk van een veelzijdige genetische model. Planten die bloeien in extreme omgevingen, waarnaar wordt verwezen als extremophytes, bieden een essentiële hulpbron voor het begrijpen van de plant aanpassingen aan milieu benadrukt. Schrenkiella parvula (voorheen Thellungiella parvula en Eutrema parvulum) is een model van dergelijke extremophyte, met het uitbreiden van genomic middelen1,2,3,4,5. Echter, transformatie protocollen hebben nog niet is gerapporteerd voor S. parvula in gepubliceerde studies.

Het genoom van S. parvula is de eerste gepubliceerde extremophyte genoom in kruisbloemenfamilie (mosterd-kool familie) en toont een uitgebreide totale genoom synteny met het niet-extremophyte model, Arabidopsis thaliana1. Dus, vergelijkende studies tussen A. thaliana en S. parvula kon profiteren van de rijkdom aan genetische studies uitgevoerd op A. thaliana om informatieve hypothesen over hoe het genoom S. parvula heeft zich ontwikkeld en geregeld anders om te gaan met benadrukt extreme milieu5,6,7. S. parvula is een van de meest zout-tolerante soorten (gebaseerd op bodem NaCl LD50) onder bekende wilde verwanten A. thaliana8. Naast de NaCl-tolerantie, S. parvula overleeft en voltooit de levenscyclus in de aanwezigheid van meerdere zout ionen bij hoge concentraties giftig voor de meeste planten7. In reactie op de abiotische stress overwegend in zijn natuurlijke habitat, het heeft zich ontwikkeld van verschillende eigenschappen, waaronder zijn verschillende bestudeerd op de biochemische of fysiologisch niveau 8,,9,10, 11.

Sinds 2010 zijn er meer dan 400 publicaties van peer-reveiwed die S. parvula gebruikt als doelsoort of gebruikt in een vergelijking met andere plant genomen. Echter kan een duidelijk knelpunt worden geïdentificeerd met een kijkje van wat voor soort studies zijn uitgevoerd. De meerderheid van deze verslagen bespreken het potentiële gebruik van S. parvula in toekomstige studies of het gebruik in vergelijkende genomic of phylogenomic studies. Als gevolg van het ontbreken van een proof-of-concept transformatie protocol vastgesteld voor S. parvula, het is niet gebruikt in functionele genomische studie, ondanks het feit dat een van de hoogste kwaliteit plant genomen beschikbaar tot op heden (> 5 Mb aanliggend N50) gemonteerd en geannoteerde in pseudomolecules van chromosoom-niveau1.

De Agrobacterium-gemedieerde floral-dip transformatie methode is de meest algemeen gebruikte methode lijnen te maken trasngenic in A. thalianageworden, en de ontwikkeling van een reproduceerbare systeem van transformatie was een kritieke factor in het succes als een genetische model12,13. Niet alle soorten van de Brassicaceae hebben echter aangetoond dat het met succes worden omgezet met behulp van de methode van de bloemen-dip ontwikkeld voor A. thaliana. Speciaal, de Brassicaceae Lineage II-soorten die S. parvula omvatten geweest recalcitrante floral-dip op basis transformatie methoden14,15.

De onbepaalde bloeiende groei gewoonte van S. parvula, gecombineerd met haar smalle blad morfologie heeft gemaakt het uitdagend om de standaard Agrobacterium-gemedieerde floral-dip transformatie methode te hanteren. In deze studie rapporteren we het gewijzigde protocol die wij hebben ontwikkeld voor reproduceerbare transformatie van S. parvula.

Protocol

1. de plantengroei Zaad sterilisatie (optioneel) Bereiden van 50% bleekwater in tweemaal gedestilleerd water (ddH2van O) met 1 of 2 druppels van een niet-ionogene detergens (Zie Tabel van materialen) in een tube van 50 mL. Omkeren van de buis meerdere malen te mengen van de oplossing.Opmerking: Het verdient de voorkeur om te voeren zaad sterilisatie in een laminaire flow-kast met een UV gesteriliseerde oppervlak voor 15 min. <li…

Representative Results

Ontwikkelden we een transformatie-protocol waarmee oogsten van T0 zaden binnen 150 dagen, met behulp van een methode van de bloemen-dip aangepast ten opzichte van die voor A. thaliana. Figuur 1 toont een overzicht van de tijdlijn en S. parvula planten die de optimale fase vertegenwoordigen voor het uitvoeren van de transformatie via floral-dip. Wij hebben gekozen S. parvula planten met 70 –80 bloemen in meerdere bloeiwi…

Discussion

De fysiologische toestand van de plant aanzienlijk invloed op de efficiëntie van transformatie25. Het gebruik van gezonde en krachtige planten voor transformatie is een basisvereiste voor een succesvolle hervorming van S. parvula. Water of lichte gestresst planten zullen hebben minder bloemen in vergelijking met de gezonde planten ideaal voor transformatie (Figuur 1, midden paneel). S. parvula kunnen groeien met een lage intensiteit minder dan 130 ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd gesteund door een award van de National Science Foundation MCB 1616827.

Materials

Agar VWR International, Radnor, PA 90000-762 Bacto Agar Soldifying Agent, BD Diagnostics
B5 vitamins Sigma-Aldrich, St. Louis, MO G1019 Gamborg’s Vitamin Solution
Desiccant W A Hammond Drierite, Xenia, OH 22005 Indicating DRIERITE 6 mesh
Destination vector for plant transformation TAIR Vector:6531113857 pKGWFS7
Electroporation cuvette USA Scientific 9104-5050 Electroporation cuvette, round cap, 0.2 cm gap
Electroporator BIO-RAD Laboratories, Hercules, CA 1652100 MicroPulser Electroporator
Fertilizer beads Osmocote Garden, Marysville, OH N/A Osmocote Smart-Release Plant Food Flower & Vegetable
Gel extraction kit iNtRON Biotechnology, Boston, MA 17289 MEGAquick-spin Total fragment DNA purification kit
Gentamicin Sigma-Aldrich, St. Louis, MO G1914-5G Gentamicin sulfate
Glufosinate-ammonium (11.3%) herbicide (BASTA) Bayer environmental science, Montvale, NJ N/A FINALE herbicide
Kanamycin VWR International, Radnor, PA 200004-444 Kanamycin monosulfate
MES Bioworld, Dublin, OH 41320024-2 MES, Free Acid
MS salt MP Biomedicals, Santa Anna, CA 092621822 Hoagland's modified basal salt mixture
N6-benzylaminopurine (BA)  Sigma-Aldrich, St. Louis, MO B3274 6-Benzylaminopurine solution
NaCl Sigma-Alrich S7653 Sodium chloride
Non-ionic detergent Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 9005-64-5 TWEEN 20 
Plasmid isolation kit Zymo Research, Irvine, CA D4036 Zyppy Plasmid Kits
Recombinase enzyme mix kit Life Technology 11791-020 Gateway LR Clonase II Enzyme mix
Rifampicin Sigma-Aldrich, St. Louis, MO R3501-1G Rifampicin, powder, >= 97% (HPLC)
Shaking incubator ThermoFisher Scientific, Waltham, MA SHKE4450 MaxQ 4450 Benchtop Orbital Shakers
Soil mix Sun Gro SUN239223328CFLP Sun Gro Metro-Mix 360 Grower Mix
Spectinomycin VWR International, Radnor, PA IC15206705
Sterile 50ml conical tubes USA Scientific, Ocala, FL 1500-1811 50 ml conical screw cap tubes, copolymer, racks, sterile
Sucrose VWR International, Radnor, PA 57-50-1 Sucrose, ACS
Surfactant solution Lehle seeds, Round Rock, TX VIS-02 Silwet L-77
Topoisomerase-based cloning kit Life Technologies, Carlsbad, CA K240020 pENTR/D-TOPO Cloning Kit, with One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli
Tryptone VWR International, Radnor, PA 90000-282 BD Bacto Tryptone, BD Biosciences
Yeast Extract VWR International, Radnor, PA 90000-722  BD Bacto Yeast Extract, BD Biosciences

References

  1. Dassanayake, M., et al. The genome of the extremophile crucifer Thellungiella parvula. Nature Genetics. 43 (9), 913-918 (2011).
  2. Oh, D. -. H., Dassanayake, M., Bohnert, H. J., Cheeseman, J. M. Life at the extreme: lessons from the genome. Genome Biology. 13 (3), 241 (2012).
  3. Whited, J. The Next Top Models. Cell. 163 (1), 18-20 (2015).
  4. Dassanayake, M., Yun, D. O. D., Bressan, R. A., Cheeseman, J. M., Bohnert, J. H. The scope of things to come: New paradigms in biotechnology. Plant Biotechnology and Agriculture: Prospects for the 21st Century. , 19-34 (2009).
  5. Dittami, S. M., Tonon, T. Genomes of extremophile crucifers: New platforms for comparative genomics and beyond. Genome Biology. 13 (8), 166 (2012).
  6. Amtmann, A. Learning from evolution: Thellungiella generates new knowledge on essential and critical components of abiotic stress tolerance in plants. Molecular Plant. 2 (1), 3-12 (2009).
  7. Oh, D. -. H., Hong, H., Lee, S. Y., Yun, D. -. J., Bohnert, H. J., Dassanayake, M. Genome structures and transcriptomes signify niche adaptation for the multiple-ion-tolerant extremophyte Schrenkiella parvula. Plant Physiology. 164 (4), 2123-2138 (2014).
  8. Orsini, F., et al. A comparative study of salt tolerance parameters in 11 wild relatives of Arabidopsis thaliana. Journal of Experimental Botany. 61 (13), 3787-3798 (2010).
  9. Uzilday, B., Ozgur, R., Sekmen, A. H., Yildiztugay, E., Turkan, I. Changes in the alternative electron sinks and antioxidant defence in chloroplasts of the extreme halophyte Eutrema parvulum (Thellungiella parvula) under salinity. Annals of Botany. 115 (3), 449-463 (2015).
  10. Teusink, R. S., Rahman, M., Bressan, R. A., Jenks, M. A. Cuticular waxes on Arabidopsis thaliana close relatives Thellungiella halophila and Thellungiella parvula. International Journal of Plant Sciences. 163 (2), 309-315 (2002).
  11. Jarvis, D. E., Ryu, C. H., Beilstein, M. A., Schumaker, K. S. Distinct roles for SOS1 in the convergent evolution of salt tolerance in Eutrema salsugineum and Schrenkiella parvula. Molecular Biology and Evolution. 31 (8), 2094-2107 (2014).
  12. Clough, S. J., Bent, A. F. Floral dip: A simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana. Plant Journal. 16 (6), 735-743 (1998).
  13. Koornneef, M., Meinke, D. The development of Arabidopsis as a model plant. Plant Journal. 61 (6), 909-921 (2010).
  14. Bai, J., Wu, F., Mao, Y., He, Y. In planta transformation of Brassica rapa and B. napus via vernalization-infiltration methods. Protocol Exchange. 10, 1028 (2013).
  15. Sparrow, P. A. C., Goldsack, C. M. P., Østergaard, L. Transformation technology in the Brassicaceae. Genetics and Genomics of the Brassicaceae. , 505-525 (2011).
  16. Hoagland, D. R., Arnon, D. I. The water-culture method for growing plants without soil. California Agricultural Experiment Station Circular. 347 (347), 1-32 (1950).
  17. Saiki, R., et al. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science. 239 (4839), 487-491 (1988).
  18. Sun, Y., Sriramajayam, K., Luo, D., Liao, D. J. A Quick, cost-free method of purification of dna fragments from agarose gel. Journal of Cancer. 3, 93-95 (2012).
  19. Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (12), 5463-5467 (1977).
  20. Bertani, G. Studies on Lysogenesis I. The mode of phage liberation by lysogenic Eschericia coli. Journal of Bacteriolgy. 62 (3), 293-300 (1951).
  21. Koncz, C., Martini, N., Szabados, L., Hrouda, M., Bachmair, A., Schell, J. Specialized vectors for gene tagging and expression studies. Plant Molecular Biology Manual. , 53-74 (1994).
  22. Weigel, D., Glazebrook, J. Transformation of Agrobacterium using electroporation. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (30), (2006).
  23. Murray, M. G., Thompson, W. F. Rapid isolation of high molecular weight plant DNA. Nucleic Acids Research. 8 (19), 4321-4326 (1980).
  24. Inan, G. Salt cress. a halophyte and cryophyte Arabidopsis relative model system and its applicability to molecular genetic analyses of growth and development of extremophiles. Plant Physiol. 135 (3), 1718-1737 (2004).
  25. Ghedira, R., De Buck, S., Nolf, J., Depicker, A. The efficiency of Arabidopsis thaliana floral dip transformation is determined not only by the Agrobacterium strain used but also by the physiology and the ecotype of the dipped plant. Molecular Plant-Microbe Interactions. 26 (7), 823-832 (2013).
  26. Shaohong, F. U., Xianya, W. E. I., Yingze, N. I. U., Shixing, G. U. O. Transformation of Brassica napus with the method of floral-dip. Biotechnology: Genomics and Its Applications. , 45-49 (2005).
  27. Li, J., Tan, X., Zhu, F., Guo, J. A rapid and simple method for Brassica napus floral-dip transformation and selection of transgenic plantlets. International Journal of Biology. 2 (1), 127 (2010).
  28. Li, H. Q., Xu, J., Chen, L., Li, M. R. Establishment of an efficient Agrobacterium tumefaciens-mediated leaf disc transformation of Thellungiella halophila. Plant Cell Reports. 26 (10), 1785-1789 (2007).
  29. Wu, G., Rossidivito, G., Hu, T., Berlyand, Y., Poethig, R. S. Traffic lines: New tools for genetic analysis in Arabidopsis thaliana. Genetics. 200 (1), 35-45 (2015).

Play Video

Cite This Article
Wang, G., Pantha, P., Tran, K., Oh, D., Dassanayake, M. Plant Growth and Agrobacterium-mediated Floral-dip Transformation of the Extremophyte Schrenkiella parvula. J. Vis. Exp. (143), e58544, doi:10.3791/58544 (2019).

View Video