Växternas tillväxt och Agrobacterium-medierad Floral-dip omvandlingen av den Extremophyte Schrenkiella parvula
Summary
Agrobacterium-medierad omvandling med en blommig-dip metod kan användas framgångsrikt att skapa stabila transgena linjerna av extremophyte modell Schrenkiella parvula. Vi presenterar ett protokoll ändras från det för Arabidopsis thaliana, med tanke på olika tillväxt vanor och fysiologiska egenskaper av extremophyte.
Abstract
Schrenkiella parvula är en extremophyte som anpassas till olika abiotiska betonar, inklusive flera ion toxicitet betonar. Trots hög kvalitet genomisk resurser tillgängliga att studera hur växter anpassar sig till miljön betonas, dess värde som en funktionell genomik modell och verktyg har begränsats på grund av en möjlig omvandling systemet. I detta protokoll, redovisar vi hur man skapar stabila transgena S. parvula linjer med hjälp av Agrobacterium-medierad blommig-dip metod. Vi ändrade den omvandling-protokoll som används för A. thaliana för unika drag av S. parvula, såsom en obestämd blommande vana och en hög epicuticular vaxinnehåll på bladen. Kort, S. parvula frön stratifierades vid 4 ° C i fem dagar innan plantering. Växter har odlats på en fotoperiod en 14 h ljus och 10 h mörka och en 130 µmol m-2s-1 ljusintensitet, vid 22 ° C till 24 ° C. Åtta till nio veckor gamla växter med flera blomställningar valdes för omvandling. Dessa blomställningar var doppad i en infiltration lösning av Agrobacterium tumefaciens GV3101 bär pMP90RK Plasmiden. Vi genomförde två rundor av blomma doppa med ett intervall av tre till fyra veckor att effektivisera omvandling. T1 fröna samlades in och torkas i fyra veckor i en behållare med torkmedel innan groning till skärmen för kandidat omvandlas linjer. Resistens mot BASTA användes till skärmen T1 växter. Vi sprutade BASTA lösningen tre gånger med ett intervall på tre dagar med start på två veckor gamla växter att minska falska positiva. En BASTA drop test som utfördes på överleva enskilda växter för att identifiera sant positiva transformants. Omvandling effektivitet var 0,033%, vilket ger 3 – 4 transgena växter per 10.000 T1 frön sprids.
Introduction
I detta protokoll beskriver vi tillväxt och etablering av stabil transgena linjerna för extremophyte modell Schrenkiella parvula. Tillgången till en effektiv omvandling systemet är ett kännetecken för någon mångsidig genetisk modell. Växter som trivs i extrema miljöer, avses som extremophytes, ge en kritisk resurs för att förstå växt anpassningar till miljöpåfrestningar. Schrenkiella parvula (tidigare Thellungiella parvula och Eutrema parvulum) är ett sådant extremophyte modell, med expanderande genomisk resurser1,2,3,4,5. Dock har omvandlingen protokoll inte ännu rapporterats för S. parvula i publicerade studier.
Genomet hos S. parvula är det första publicerade extremophyte genomet i korsblommiga växter (senap-kål familjen) och visar en omfattande övergripande genomet synteny med icke-extremophyte modell, Arabidopsis thaliana1. Således, jämförande studier mellan A. thaliana och S. parvula kunde dra nytta av rikedomen av genetiska studier utförs på A. thaliana att göra informativa hypoteser om hur S. parvula genomet har utvecklats och reglerade annorlunda för att klara betonar extrema miljö5,6,7. S. parvula är en av de mest salt-toleranta arter (baserat på jord NaCl LD50) bland kända vilda släktingar av A. thaliana8. Utöver NaCl toleransen, S. parvula överlever och avslutar sin livscykel i närvaro av flera salt joner vid höga koncentrationer giftiga för de flesta växter7. Svar på de abiotiska påfrestningarna som är förhärskande i sitt naturliga habitat, har det utvecklats olika egenskaper, bland vilka flera har studerats på biokemiska eller fysiologisk nivå 8,9,10, 11.
Sedan 2010 har förekommit över 400 peer-reveiwed publikationer som används S. parvula som målart eller använt det vid en jämförelse med andra växt-genomet. Dock kunde en tydlig flaskhals identifieras med en närmare titt på vilken typ av studier har genomförts. Majoriteten av dessa rapporter diskutera den potentiella användningen av S. parvula i framtida studier eller använda det i jämförande genomisk och phylogenomic studier. På grund av ett proof-of-concept omvandling protokoll upprättats för S. parvula, det inte har använts i funktionella genomisk studier, trots att en av högsta kvalitet växt genomen hittills tillgängliga (> 5 Mb contig N50) monteras och Kommenterad i kromosomnivå pseudomolecules1.
Metoden Agrobacterium-medierad blommig-dip omvandling har blivit den mest allmänt använda metoden att skapa trasngenic linjer i A. thaliana, och utvecklingen av en reproducerbar system för omvandling var avgörande för dess framgång som en genetisk modell12,13. Dock har inte alla korsblommiga växter arter visat att omvandlas framgångsrikt med blommig-dip metod utvecklats för A. thaliana. Speciellt, har de korsblommiga Lineage II arter som inkluderar S. parvula varit motsträviga till blommig-dip baserad omvandling metoder14,15.
Obestämt blommande tillväxt vanan att S. parvula, kombinerat med dess smala blad morfologi har gjort det utmanande att anta metoden standard Agrobacterium-medierad blommig-dip omvandling. I denna studie rapporterar vi det ändrade protokollet har vi utvecklat för reproducerbara omvandling av S. parvula.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det fysiologiska tillståndet av anläggningen påverkar avsevärt effektiviteten i transformation25. Användning av friska och livskraftiga växter för omvandling är en viktig förutsättning för framgångsrik omvandling i S. parvula. Vatten eller ljus stressade växter kommer att ha färre blommor jämfört med de friska växterna som är idealisk för omvandling (figur 1, center panel). S. parvula kan växa med låg intensitet mindre än 130 µ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds av en National Science Foundation award MCB 1616827.
Materials
| Agar | VWR International, Radnor, PA | 90000-762 | Bacto Agar Soldifying Agent, BD Diagnostics |
| B5 vitamins | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | G1019 | Gamborg’s Vitamin Solution |
| Desiccant | W A Hammond Drierite, Xenia, OH | 22005 | Indicating DRIERITE 6 mesh |
| Destination vector for plant transformation | TAIR | Vector:6531113857 | pKGWFS7 |
| Electroporation cuvette | USA Scientific | 9104-5050 | Electroporation cuvette, round cap, 0.2 cm gap |
| Electroporator | BIO-RAD Laboratories, Hercules, CA | 1652100 | MicroPulser Electroporator |
| Fertilizer beads | Osmocote Garden, Marysville, OH | N/A | Osmocote Smart-Release Plant Food Flower & Vegetable |
| Gel extraction kit | iNtRON Biotechnology, Boston, MA | 17289 | MEGAquick-spin Total fragment DNA purification kit |
| Gentamicin | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | G1914-5G | Gentamicin sulfate |
| Glufosinate-ammonium (11.3%) herbicide (BASTA) | Bayer environmental science, Montvale, NJ | N/A | FINALE herbicide |
| Kanamycin | VWR International, Radnor, PA | 200004-444 | Kanamycin monosulfate |
| MES | Bioworld, Dublin, OH | 41320024-2 | MES, Free Acid |
| MS salt | MP Biomedicals, Santa Anna, CA | 092621822 | Hoagland's modified basal salt mixture |
| N6-benzylaminopurine (BA) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | B3274 | 6-Benzylaminopurine solution |
| NaCl | Sigma-Alrich | S7653 | Sodium chloride |
| Non-ionic detergent | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 9005-64-5 | TWEEN 20 |
| Plasmid isolation kit | Zymo Research, Irvine, CA | D4036 | Zyppy Plasmid Kits |
| Recombinase enzyme mix kit | Life Technology | 11791-020 | Gateway LR Clonase II Enzyme mix |
| Rifampicin | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | R3501-1G | Rifampicin, powder, >= 97% (HPLC) |
| Shaking incubator | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA | SHKE4450 | MaxQ 4450 Benchtop Orbital Shakers |
| Soil mix | Sun Gro | SUN239223328CFLP | Sun Gro Metro-Mix 360 Grower Mix |
| Spectinomycin | VWR International, Radnor, PA | IC15206705 | |
| Sterile 50ml conical tubes | USA Scientific, Ocala, FL | 1500-1811 | 50 ml conical screw cap tubes, copolymer, racks, sterile |
| Sucrose | VWR International, Radnor, PA | 57-50-1 | Sucrose, ACS |
| Surfactant solution | Lehle seeds, Round Rock, TX | VIS-02 | Silwet L-77 |
| Topoisomerase-based cloning kit | Life Technologies, Carlsbad, CA | K240020 | pENTR/D-TOPO Cloning Kit, with One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli |
| Tryptone | VWR International, Radnor, PA | 90000-282 | BD Bacto Tryptone, BD Biosciences |
| Yeast Extract | VWR International, Radnor, PA | 90000-722 | BD Bacto Yeast Extract, BD Biosciences |
References
- Dassanayake, M., et al. The genome of the extremophile crucifer Thellungiella parvula. Nature Genetics. 43 (9), 913-918 (2011).
- Oh, D. -. H., Dassanayake, M., Bohnert, H. J., Cheeseman, J. M. Life at the extreme: lessons from the genome. Genome Biology. 13 (3), 241 (2012).
- Whited, J. The Next Top Models. Cell. 163 (1), 18-20 (2015).
- Dassanayake, M., Yun, D. O. D., Bressan, R. A., Cheeseman, J. M., Bohnert, J. H. The scope of things to come: New paradigms in biotechnology. Plant Biotechnology and Agriculture: Prospects for the 21st Century. , 19-34 (2009).
- Dittami, S. M., Tonon, T. Genomes of extremophile crucifers: New platforms for comparative genomics and beyond. Genome Biology. 13 (8), 166 (2012).
- Amtmann, A. Learning from evolution: Thellungiella generates new knowledge on essential and critical components of abiotic stress tolerance in plants. Molecular Plant. 2 (1), 3-12 (2009).
- Oh, D. -. H., Hong, H., Lee, S. Y., Yun, D. -. J., Bohnert, H. J., Dassanayake, M. Genome structures and transcriptomes signify niche adaptation for the multiple-ion-tolerant extremophyte Schrenkiella parvula. Plant Physiology. 164 (4), 2123-2138 (2014).
- Orsini, F., et al. A comparative study of salt tolerance parameters in 11 wild relatives of Arabidopsis thaliana. Journal of Experimental Botany. 61 (13), 3787-3798 (2010).
- Uzilday, B., Ozgur, R., Sekmen, A. H., Yildiztugay, E., Turkan, I. Changes in the alternative electron sinks and antioxidant defence in chloroplasts of the extreme halophyte Eutrema parvulum (Thellungiella parvula) under salinity. Annals of Botany. 115 (3), 449-463 (2015).
- Teusink, R. S., Rahman, M., Bressan, R. A., Jenks, M. A. Cuticular waxes on Arabidopsis thaliana close relatives Thellungiella halophila and Thellungiella parvula. International Journal of Plant Sciences. 163 (2), 309-315 (2002).
- Jarvis, D. E., Ryu, C. H., Beilstein, M. A., Schumaker, K. S. Distinct roles for SOS1 in the convergent evolution of salt tolerance in Eutrema salsugineum and Schrenkiella parvula. Molecular Biology and Evolution. 31 (8), 2094-2107 (2014).
- Clough, S. J., Bent, A. F. Floral dip: A simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana. Plant Journal. 16 (6), 735-743 (1998).
- Koornneef, M., Meinke, D. The development of Arabidopsis as a model plant. Plant Journal. 61 (6), 909-921 (2010).
- Bai, J., Wu, F., Mao, Y., He, Y. In planta transformation of Brassica rapa and B. napus via vernalization-infiltration methods. Protocol Exchange. 10, 1028 (2013).
- Sparrow, P. A. C., Goldsack, C. M. P., Østergaard, L. Transformation technology in the Brassicaceae. Genetics and Genomics of the Brassicaceae. , 505-525 (2011).
- Hoagland, D. R., Arnon, D. I. The water-culture method for growing plants without soil. California Agricultural Experiment Station Circular. 347 (347), 1-32 (1950).
- Saiki, R., et al. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science. 239 (4839), 487-491 (1988).
- Sun, Y., Sriramajayam, K., Luo, D., Liao, D. J. A Quick, cost-free method of purification of dna fragments from agarose gel. Journal of Cancer. 3, 93-95 (2012).
- Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (12), 5463-5467 (1977).
- Bertani, G. Studies on Lysogenesis I. The mode of phage liberation by lysogenic Eschericia coli. Journal of Bacteriolgy. 62 (3), 293-300 (1951).
- Koncz, C., Martini, N., Szabados, L., Hrouda, M., Bachmair, A., Schell, J. Specialized vectors for gene tagging and expression studies. Plant Molecular Biology Manual. , 53-74 (1994).
- Weigel, D., Glazebrook, J. Transformation of Agrobacterium using electroporation. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (30), (2006).
- Murray, M. G., Thompson, W. F. Rapid isolation of high molecular weight plant DNA. Nucleic Acids Research. 8 (19), 4321-4326 (1980).
- Inan, G. Salt cress. a halophyte and cryophyte Arabidopsis relative model system and its applicability to molecular genetic analyses of growth and development of extremophiles. Plant Physiol. 135 (3), 1718-1737 (2004).
- Ghedira, R., De Buck, S., Nolf, J., Depicker, A. The efficiency of Arabidopsis thaliana floral dip transformation is determined not only by the Agrobacterium strain used but also by the physiology and the ecotype of the dipped plant. Molecular Plant-Microbe Interactions. 26 (7), 823-832 (2013).
- Shaohong, F. U., Xianya, W. E. I., Yingze, N. I. U., Shixing, G. U. O. Transformation of Brassica napus with the method of floral-dip. Biotechnology: Genomics and Its Applications. , 45-49 (2005).
- Li, J., Tan, X., Zhu, F., Guo, J. A rapid and simple method for Brassica napus floral-dip transformation and selection of transgenic plantlets. International Journal of Biology. 2 (1), 127 (2010).
- Li, H. Q., Xu, J., Chen, L., Li, M. R. Establishment of an efficient Agrobacterium tumefaciens-mediated leaf disc transformation of Thellungiella halophila. Plant Cell Reports. 26 (10), 1785-1789 (2007).
- Wu, G., Rossidivito, G., Hu, T., Berlyand, Y., Poethig, R. S. Traffic lines: New tools for genetic analysis in Arabidopsis thaliana. Genetics. 200 (1), 35-45 (2015).
