Summary

Bitki büyüme ve Floral daldırma dönüşümün Agrobacterium aracılı Extremophyte Schrenkiella parvula

Published: January 07, 2019
doi:

Summary

Agrobacterium aracılı dönüşümü daldırma çiçek yöntemini kullanarak başarılı bir şekilde Schrenkiella parvulaextremophyte modelinin kararlı transgenik satırları oluşturmak için istihdam edilebilir. Biz bundan farklı büyüme alışkanlıkları ve extremophyte fizyolojik özellikleri dikkate alınarak Arabidopsis thalianaiçin değiştirilmiş bir iletişim kuralı mevcut.

Abstract

Schrenkiella parvula bir extremophyte birden fazla iyon toksisite gerilmeler de dahil olmak üzere çeşitli abiyotik stres için adapte olduğunu. Rağmen yüksek kaliteli genomik kaynakları kullanılabilir nasıl bitkiler için çevre uyum çalışmaya vurguluyor, fonksiyonel genomik model olarak değerini ve aracı uygun dönüşüm sistemi eksikliği tarafından sınırlı. Bu protokol için biz nasıl istikrarlı transgenik S. parvula oluşturmak için raporu bir Agrobacterium aracılı çiçek daldırma yöntemiyle hatları. S. parvula, benzersiz özellikleri bir belirsiz çiçekli alışkanlık ve yapraklarda yüksek epicuticular balmumu içeriği gibi hesaba A. thaliana için kullanılan dönüştürme iletişim kuralını değiştiren. Kısaca, S. parvula tohum dikim önce beş gün boyunca 4 ° C’de tabakalı. Bitkiler bir photoperiod 14 h ışık ve 10 h karanlık ve bir 130 µmol m-2s-1 ışık şiddeti, 22 ° c ile 24 ° c de yetiştirilmiştir Sekiz dokuz haftalık bitkiler birden fazla çiçek ile dönüşüm için seçildi. Bu çiçek pMP90RK plazmid taşıyan bir infiltrasyon çözümde Agrobacterium tumefaciens GV3101, daldırma. Çiçek üç ila dört hafta dönüşüm verimliliği artırmak için zaman aralığı ile daldırma iki tur gerçekleştirilen. T1 tohum toplanmış ve çimlenme için aday ekran satırları dönüşüm önce dört hafta için bir konteyner Nem Çekiciler ile kurutulmuş. BASTA direnç T1 bitkiler ekran için kullanıldı. BASTA çözüm üç kez üç gün yanlış pozitif azaltmak için iki haftalık bitkiler başlangıç aralığı ile püskürtülür. BASTA damla test gerçek pozitif transformants tanımlamak için bireysel bitkiler kalan gerçekleştirildi. Dönüşüm verimliliği %0.033 3-4 transgenik bitkiler başına 10.000 T1 tohumları yayılır verimli oldu.

Introduction

Bu protokol için büyüme ve extremophyte model Schrenkiella parvulaiçin kararlı transgenik hatları kurulması açıklanmaktadır. Verimli dönüştürme sistemin herhangi bir çok yönlü genetik model damgasını olduğunu. Aşırı ortamlarda gelişirler bitkiler extremophytes, kritik bir kaynak sağlamak bitki uyarlamaları için çevresel stresleri anlamak için kabul edilir. Schrenkiella parvula (eski adıyla Thellungiella parvula ve Eutrema parvulum) genomik kaynakları1,2,3,4,5genişletilmesi ile böyle bir extremophyte model, olduğunu. Ancak, dönüşüm protokolleri henüz S. parvula için yayınlanmış çalışmalarda bildirilmiştir değil.

S. parvula genom Turpgiller (hardal-lahana aile) ilk yayımlanan extremophyte genom olup geniş bir genel genom synteny sigara extremophyte modeli, Arabidopsis thaliana1ile gösterir. Böylece, A. thaliana ve S. parvula arasında karşılaştırmalı çalışmalar genetik çalışmalar parvula S. genom nasıl gelişti ve düzenlenmiş bilgilendirici hipotezler yapmak A. thaliana üzerinde gerçekleştirilen zenginliği yarar farklı şekilde başa çıkmak için5,6,7aşırı çevre vurguluyor. S. parvula (toprak NaCl LD50 dayalı) tuz en dayanıklı türlerin bilinen yabani akrabaları arasında A. thaliana8biridir. Ek olarak NaCl hoşgörü, S. parvula ve hayatta yüksek konsantrasyonlarda toksik çoğu bitkiler7‘ ye birden çok tuz iyonları huzurunda ömrünü tamamlayan. Abiyotik stres doğal tabiatında yaygın yanıt olarak, çeşitli özellikleri, aralarında birkaç biyokimyasal ya da fizyolojik düzey 8,9,10okudu gelmifltir, 11.

2010 yılından bu yana, S. parvula bir hedef tür olarak ya bir karşılaştırma ile diğer bitki genom kullanılan 400’den fazla eş-reveiwed yayınları olmuştur. Ancak, açık bir performans sorunu ne tür çalışmalar yürütülen bir daha yakından bakmak ile belirlenmiştir. Bu raporlar çoğunluğu S. parvula potansiyelini kullanmak gelecek çalışmalarda tartışmak veya karşılaştırmalı genomik veya phylogenomic çalışmalar kullanın. Bir kanıtı-of-concept dönüştürme iletişim kuralı olmaması nedeniyle kurulan S. parvulaiçin o değil kullanılan en yüksek kalite bitki genom bugüne kadar mevcut biri olmasına rağmen fonksiyonel genomik çalışmalar (> 5 Mb dokunma N50) toplandı ve kromozom düzeyi pseudomolecules1açıklamalı.

Agrobacterium aracılı daldırma çiçek dönüşüm yöntemi A. thalianaiçinde trasngenic satırları oluşturmak için en geniş kullanılan yöntem haline gelmiştir ve dönüşümünün bir tekrarlanabilir sisteminin geliştirilmesi başarısını kritik bir faktör oldu bir genetik model12,13. Ancak, tüm turpgiller türler başarıyla A. thalianaiçin geliştirilen çiçek daldırma yöntemiyle dönüştürülmesi için gösterilmiştir. Özel olarak, S. parvula dahil turpgiller Lineage II tür çiçek daldırma tabanlı dönüştürme yöntemleri14,15‘ e inatçı oldu.

S. parvuladar yaprak morfolojisi ile kombine, belirsiz çiçekli büyüme alışkanlığı zorlu standart Agrobacterium aracılı daldırma çiçek dönüşüm yöntemi benimsemeye yaptı. Bu çalışmada, S. parvulatekrarlanabilir dönüşüm için geliştirdiğimiz değiştirilmiş Protokolü rapor.

Protocol

1. bitki büyüme Tohum sterilizasyon (isteğe bağlı) 1 çift-distile su (GKD2O) % 50 çamaşır suyu hazırlamak veya 2 damla non-iyonik bir deterjan ( Tablo malzemelerigörmek) 50 mL tüp içinde. Tüp birkaç kez çözüm karıştırmak için tersine çevirin.Not: Tohum sterilizasyon 15dk için bir UV steril yüzey ile kabine laminar akışı yapmak için tercih edilir. Çamaşır suyu çözüm ~ 100-200’e ekleyin S…

Representative Results

Geliştirdiğimiz T0 tohumları 150 gün içinde hasat sağlayan dönüştürme protokol bundan A. thalianaiçin değiştirilmiş bir çiçek daldırma yöntemiyle. Şekil 1 zaman çizelgesi ve dönüşümü daldırma çiçek üzerinden yürütmek için en iyi sahne temsil S. parvula bitkiler bir özetini gösterir. 60-80 gün sonra dönüştürme için hedef sahne olarak çimlenme sırasında birden fazla çiçek S. parvula</…

Discussion

Bitkinin fizyolojik devlet dönüştürme25verimliliğini önemli ölçüde etkiler. Sağlıklı ve dinç bitkilerin kullanımı için dönüştürme başarılı dönüşüm içinde S. parvulaiçin anahtar bir gereksinimdir. Su veya hafif stresli bitkiler sağlıklı bitkiler için dönüşüm (Şekil 1, merkezi panel) ideal kıyasla daha az çiçek olacak. S. parvula hafif yoğunlukta büyüyebilir daha az 130 µmol m-2 s-1ama …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu eser bir Ulusal Bilim Vakfı Ödülü MCB 1616827 tarafından desteklenmiştir.

Materials

Agar VWR International, Radnor, PA 90000-762 Bacto Agar Soldifying Agent, BD Diagnostics
B5 vitamins Sigma-Aldrich, St. Louis, MO G1019 Gamborg’s Vitamin Solution
Desiccant W A Hammond Drierite, Xenia, OH 22005 Indicating DRIERITE 6 mesh
Destination vector for plant transformation TAIR Vector:6531113857 pKGWFS7
Electroporation cuvette USA Scientific 9104-5050 Electroporation cuvette, round cap, 0.2 cm gap
Electroporator BIO-RAD Laboratories, Hercules, CA 1652100 MicroPulser Electroporator
Fertilizer beads Osmocote Garden, Marysville, OH N/A Osmocote Smart-Release Plant Food Flower & Vegetable
Gel extraction kit iNtRON Biotechnology, Boston, MA 17289 MEGAquick-spin Total fragment DNA purification kit
Gentamicin Sigma-Aldrich, St. Louis, MO G1914-5G Gentamicin sulfate
Glufosinate-ammonium (11.3%) herbicide (BASTA) Bayer environmental science, Montvale, NJ N/A FINALE herbicide
Kanamycin VWR International, Radnor, PA 200004-444 Kanamycin monosulfate
MES Bioworld, Dublin, OH 41320024-2 MES, Free Acid
MS salt MP Biomedicals, Santa Anna, CA 092621822 Hoagland's modified basal salt mixture
N6-benzylaminopurine (BA)  Sigma-Aldrich, St. Louis, MO B3274 6-Benzylaminopurine solution
NaCl Sigma-Alrich S7653 Sodium chloride
Non-ionic detergent Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 9005-64-5 TWEEN 20 
Plasmid isolation kit Zymo Research, Irvine, CA D4036 Zyppy Plasmid Kits
Recombinase enzyme mix kit Life Technology 11791-020 Gateway LR Clonase II Enzyme mix
Rifampicin Sigma-Aldrich, St. Louis, MO R3501-1G Rifampicin, powder, >= 97% (HPLC)
Shaking incubator ThermoFisher Scientific, Waltham, MA SHKE4450 MaxQ 4450 Benchtop Orbital Shakers
Soil mix Sun Gro SUN239223328CFLP Sun Gro Metro-Mix 360 Grower Mix
Spectinomycin VWR International, Radnor, PA IC15206705
Sterile 50ml conical tubes USA Scientific, Ocala, FL 1500-1811 50 ml conical screw cap tubes, copolymer, racks, sterile
Sucrose VWR International, Radnor, PA 57-50-1 Sucrose, ACS
Surfactant solution Lehle seeds, Round Rock, TX VIS-02 Silwet L-77
Topoisomerase-based cloning kit Life Technologies, Carlsbad, CA K240020 pENTR/D-TOPO Cloning Kit, with One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli
Tryptone VWR International, Radnor, PA 90000-282 BD Bacto Tryptone, BD Biosciences
Yeast Extract VWR International, Radnor, PA 90000-722  BD Bacto Yeast Extract, BD Biosciences

References

  1. Dassanayake, M., et al. The genome of the extremophile crucifer Thellungiella parvula. Nature Genetics. 43 (9), 913-918 (2011).
  2. Oh, D. -. H., Dassanayake, M., Bohnert, H. J., Cheeseman, J. M. Life at the extreme: lessons from the genome. Genome Biology. 13 (3), 241 (2012).
  3. Whited, J. The Next Top Models. Cell. 163 (1), 18-20 (2015).
  4. Dassanayake, M., Yun, D. O. D., Bressan, R. A., Cheeseman, J. M., Bohnert, J. H. The scope of things to come: New paradigms in biotechnology. Plant Biotechnology and Agriculture: Prospects for the 21st Century. , 19-34 (2009).
  5. Dittami, S. M., Tonon, T. Genomes of extremophile crucifers: New platforms for comparative genomics and beyond. Genome Biology. 13 (8), 166 (2012).
  6. Amtmann, A. Learning from evolution: Thellungiella generates new knowledge on essential and critical components of abiotic stress tolerance in plants. Molecular Plant. 2 (1), 3-12 (2009).
  7. Oh, D. -. H., Hong, H., Lee, S. Y., Yun, D. -. J., Bohnert, H. J., Dassanayake, M. Genome structures and transcriptomes signify niche adaptation for the multiple-ion-tolerant extremophyte Schrenkiella parvula. Plant Physiology. 164 (4), 2123-2138 (2014).
  8. Orsini, F., et al. A comparative study of salt tolerance parameters in 11 wild relatives of Arabidopsis thaliana. Journal of Experimental Botany. 61 (13), 3787-3798 (2010).
  9. Uzilday, B., Ozgur, R., Sekmen, A. H., Yildiztugay, E., Turkan, I. Changes in the alternative electron sinks and antioxidant defence in chloroplasts of the extreme halophyte Eutrema parvulum (Thellungiella parvula) under salinity. Annals of Botany. 115 (3), 449-463 (2015).
  10. Teusink, R. S., Rahman, M., Bressan, R. A., Jenks, M. A. Cuticular waxes on Arabidopsis thaliana close relatives Thellungiella halophila and Thellungiella parvula. International Journal of Plant Sciences. 163 (2), 309-315 (2002).
  11. Jarvis, D. E., Ryu, C. H., Beilstein, M. A., Schumaker, K. S. Distinct roles for SOS1 in the convergent evolution of salt tolerance in Eutrema salsugineum and Schrenkiella parvula. Molecular Biology and Evolution. 31 (8), 2094-2107 (2014).
  12. Clough, S. J., Bent, A. F. Floral dip: A simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana. Plant Journal. 16 (6), 735-743 (1998).
  13. Koornneef, M., Meinke, D. The development of Arabidopsis as a model plant. Plant Journal. 61 (6), 909-921 (2010).
  14. Bai, J., Wu, F., Mao, Y., He, Y. In planta transformation of Brassica rapa and B. napus via vernalization-infiltration methods. Protocol Exchange. 10, 1028 (2013).
  15. Sparrow, P. A. C., Goldsack, C. M. P., Østergaard, L. Transformation technology in the Brassicaceae. Genetics and Genomics of the Brassicaceae. , 505-525 (2011).
  16. Hoagland, D. R., Arnon, D. I. The water-culture method for growing plants without soil. California Agricultural Experiment Station Circular. 347 (347), 1-32 (1950).
  17. Saiki, R., et al. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science. 239 (4839), 487-491 (1988).
  18. Sun, Y., Sriramajayam, K., Luo, D., Liao, D. J. A Quick, cost-free method of purification of dna fragments from agarose gel. Journal of Cancer. 3, 93-95 (2012).
  19. Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (12), 5463-5467 (1977).
  20. Bertani, G. Studies on Lysogenesis I. The mode of phage liberation by lysogenic Eschericia coli. Journal of Bacteriolgy. 62 (3), 293-300 (1951).
  21. Koncz, C., Martini, N., Szabados, L., Hrouda, M., Bachmair, A., Schell, J. Specialized vectors for gene tagging and expression studies. Plant Molecular Biology Manual. , 53-74 (1994).
  22. Weigel, D., Glazebrook, J. Transformation of Agrobacterium using electroporation. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (30), (2006).
  23. Murray, M. G., Thompson, W. F. Rapid isolation of high molecular weight plant DNA. Nucleic Acids Research. 8 (19), 4321-4326 (1980).
  24. Inan, G. Salt cress. a halophyte and cryophyte Arabidopsis relative model system and its applicability to molecular genetic analyses of growth and development of extremophiles. Plant Physiol. 135 (3), 1718-1737 (2004).
  25. Ghedira, R., De Buck, S., Nolf, J., Depicker, A. The efficiency of Arabidopsis thaliana floral dip transformation is determined not only by the Agrobacterium strain used but also by the physiology and the ecotype of the dipped plant. Molecular Plant-Microbe Interactions. 26 (7), 823-832 (2013).
  26. Shaohong, F. U., Xianya, W. E. I., Yingze, N. I. U., Shixing, G. U. O. Transformation of Brassica napus with the method of floral-dip. Biotechnology: Genomics and Its Applications. , 45-49 (2005).
  27. Li, J., Tan, X., Zhu, F., Guo, J. A rapid and simple method for Brassica napus floral-dip transformation and selection of transgenic plantlets. International Journal of Biology. 2 (1), 127 (2010).
  28. Li, H. Q., Xu, J., Chen, L., Li, M. R. Establishment of an efficient Agrobacterium tumefaciens-mediated leaf disc transformation of Thellungiella halophila. Plant Cell Reports. 26 (10), 1785-1789 (2007).
  29. Wu, G., Rossidivito, G., Hu, T., Berlyand, Y., Poethig, R. S. Traffic lines: New tools for genetic analysis in Arabidopsis thaliana. Genetics. 200 (1), 35-45 (2015).

Play Video

Cite This Article
Wang, G., Pantha, P., Tran, K., Oh, D., Dassanayake, M. Plant Growth and Agrobacterium-mediated Floral-dip Transformation of the Extremophyte Schrenkiella parvula. J. Vis. Exp. (143), e58544, doi:10.3791/58544 (2019).

View Video