여기, 선물이 문자열 어셈블리 gRNA 복제 (STAgR), CRISPR/Cas9 접근에 쉽게 gRNA 벡터를 다중화 하는 방법. STAgR은 gRNA 멀티플렉싱 간단 하 고 효율적인 사용자 정의 합니다.
세균 CRISPR/Cas9 시스템은 실질적으로 생명 과학자에 대 한 방법론적 옵션을 증가 했다. 그것의 사용으로 인해 유전자와 게놈 엔지니어링 시스템의 넓은 범위에 적용 되었다. 또한, 많은 transcriptional epigenomic 엔지니어링 접근은 이제 처음으로 일반적으로 가능 하 고. CRISPR의 광범위 한 적용에 대 한 이유 중 하나는 분 자연에 있다. 작은 gRNAs의 복잡 한 게놈 대상, Cas9, 단백질의 변형 및 로컬 분자 결과 결정합니다. 그러나, 많은 CRISPR 접근 개별 셀에 여러 개의 gRNAs의 동시 제공에 따라 다릅니다. 여기, 우리는 문자열 어셈블리 gRNA (STAgR) 복제에 대 한 사용자 정의 프로토콜을 제시, 수 다중화 gRNA의 간단, 신속 하 고 효율적인 세대 단일 복제 식 벡터 방법 단계. STAgR (에이 프로토콜) 개별 대상 시퀀스는 도입 이후 짧은 오버행 뇌관에 의해 gRNA 식 카세트의 긴 DNA 서식 파일 다시 사용할 수 있는 여러 번 하는 동안 비용 효율적,입니다. 또한, STAgR gRNAs의 많은 다른 gRNA 변종, 벡터 및 발기인의 조합에의 한 단계 설립을 허용 한다.
문자열 어셈블리 gRNA (STAgR) 복제 여러 gRNA 식 카세트 하나의 단일 복제에 단계를 포함 하는 식 벡터의 효율적인 하룻밤 생성을 활성화 하는 방법입니다. STAgR 프로토콜 전문 지식 또는 재료에 의존 하지 않는 하 고 사용자 지정에 대 한 여러 옵션을 제공 합니다.
세균 CRISPR 단백질 Cas9에 한 고유 용량이 있습니다. 그것은 찾아서 선택적으로 자연스럽 게 발생 crRNAs 또는 조작된 gRNAs1에 인코딩된 그 DNA 시퀀스만 바인딩할 수 있습니다. 분자 도구로 이용 불가능, unfeasible 접근 또는 특정 휴대 전화 모델을 최근까지 유일한 제한의 많은 수가 있었습니다. 타겟된 유전자 변이2, 게놈 엔지니어링3,4,,56, transcriptional 활성화 및 유전자7,8입을 편집 epigenome 포함 됩니다. 우리가 아는 한 CRISPR은 보편적으로 구축, 응용 프로그램의 보고서 다양 한 대상 사이트, 세포 유형 및 종에 대 한 존재 합니다. 그러나, 많은 CRISPR 응용 프로그램에 따라 달라 직접 또는 간접적으로 게놈 조작 (translocations9,10, 중간11 및 대규모 게놈 변경의 일련을 포함 하는 여러 gRNAs의 납품 12 , 13) 게놈 엔지니어링 (Cas9 nickases14의 사용), 조건부 대립11,15 또는 직렬 돌연변이16생성 및 추적 전략17. 그러나 또한, 여러 대상 사이트는 다른 접근 (transcriptional 엔지니어링18, epigenome 엔지니어링19,20)에 대 한 엄격 하 게 필수이 고, 그들은 도달 자주이 아래 에서만 그들의 최대 효과 조건입니다.
여러 가지 유용한 방법은 포함 하는 하나 이상의 gRNA 식 카세트21,22,23,,2425,26, gRNA 벡터 생성을 설명 되었습니다. 27. 여기, 선물이 뛰어난 단순의 조합 (하나의 하룻밤 복제 단계) 속도, 낮은 비용 (DNA 템플릿을 여러 번 다시 사용할 수 있습니다), STAgR, 문자열 어셈블리 gRNA 복제에 대 한 프로토콜 (에 대 한 사용자 다른 gRNA 시스템 및 발기인)와 효과 (gRNA 카세트의 높은 숫자를 포함 하는 벡터의 세대 수 있습니다)28.
STAgR 원리에서를 사용할 수 있는 몇 가지 (1-2 gRNAs)와 식 벡터 생성, 여러 (3-5 gRNAs)와 식 카세트의 가장 높은 번호의 일부 보고 지금까지 (6-8 gRNAs)28. 마찬가지로, STAgR는 gRNA 시퀀스, 백본 또는 발기인 적용 됩니다. 그러나, STAgR은 주로 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR)과 깁슨 어셈블리에 기반 하 고, 높은 순서 상사 성 가진 gRNAs는 대체 방법을 사용 하 여 생성 되어야 합니다.
여기 우리가 현재 자세한 프로토콜 STAgR에 대 한 다양 한 크기의 gRNA 식 플라스 미드의 신속 하 고 간단한 세대 수 있습니다. 이 프로토콜 2-8 gRNA 식 카세트 (또는 두 MS2 RNA aptamers 없이)와 gRNA 플라스 미드의 원스텝 세대 gRNA 식 벡터 STAgR_Neo, 인간의 U6, 마우스 U6, 인간의 7sK와 인간 H1 발기인28 의 사용으로 사용 될 수 있습니다. ,3233. 이상 4 개의 카세트 바란다면 형식을 사용 하 여 두 개 이상의 다른 발기인/비 효율성을 증가 하는 것이 좋습니다. 다른 벡터, 발기인 및 발기인 조합으로 8 gRNA 카세트 수도 가능할 뿐; 그러나, 이것은 테스트 되지. 우리의 경험에서 방법은 안정적으로 그리고 reproducibly, 비록 우리는 중요 한 단계를 결정 하 고 문제 해결 전략 예상된 결과 즉시 발생 한다. 우리의 경험에서 몇 가지 단계는 접근의 성공을 위한 중추적인: 맨먼저, 그것은 깁슨 어셈블리 단계 (3:1)에서 벡터 백본 삽입의 올바른 어 금 니 비율을 사용 하는 것이 중요. 그러나, 우리는 일부 gRNA 집합에 대 한 벡터에 삽입의 1:1 비율 도움이 됩니다, gRNA 카세트 수 두를 초과 않도록 하는 경우에 것으로 나타났습니다. 둘째, 깁슨 어셈블리 반응의 기간을 충분히 긴 있어야 (적어도 45 분 권장).
STAgR 수정 많은 함께 사용할 수 있습니다. 대상 시퀀스, gRNA 숫자 및 건설 기계, 발기인 및 벡터 백본 사용자 지정 고 자유롭게 결합. 그러나, 각 조합에는 약간 다른 요구 사항이 있을 수 있습니다. 우리의 경험에서는, 중간 또는 높은 경우 gRNA 카세트의 숫자 (> 4) 원하는 하지만 얻지 못하면 즉시, 일반적으로이 문제를 극복 하는 가장 빠른 방법은 개별 gRNA 카세트는 벡터에서의 순서를 변경 하는. 마찬가지로, 다른 gRNA 발기인 및 건설 기계 결합 효율 향상 (그리고 따라서 득점 해야 식민지 PCRs의 필요한 수를 낮춘 다) 때 많은 gRNA 카세트 복제 됩니다. 우리는 잘못 된 클론 깁슨 조립 하는 동안 반복된 시퀀스의 자연 스러운 결합에 의해 일반적으로 생성 됩니다 발견. 이 방법의 효율성을 줄일 수 있습니다, 하지만이 또한 기능 gRNA 하위 집합28와 벡터의 동시 발생을 발생 합니다.
포함 하는 하나 이상의 gRNA 식 카세트 gRNA 벡터 멀티플렉싱의 세대 다른 방법21,22,23,,2425의 번호와 함께 보고 되었습니다. 26,27. 일부 고용 동시 또는 순차적 gRNA 쌍22,34의 복제를 하는 동안 다른 골든 게이트 어셈블리 및 여러 순차적 복제 단계25,35에 따라 달라 집니다. 특별 한 접근은 단일 조상 대 본36에서 여러 gRNAs를 잘라 생 세포 tRNA 처리 시스템을 채용 하 여 시 외.에 의해 사용 되었습니다. 이 방법의 advangetage는 하나의 발기인;의 요구 사항 단점은 각 gRNA 조합에 대 한 새로 합성된 DNA 파편의 필요성입니다. 각 gRNA 다중화 하는 방법에는 장점과 단점이; STAgR은 효율성, 낮은 비용으로 가능한 gRNA 카세트의 높은 번호와 단순을 결합합니다.
STAgR (와 다른 멀티플렉싱 시스템) 됩니다 (효율과 동시) 중단 여러 유전자에 vivo에서,의 사용에 zebrafish 두뇌28개척으로. GRNA 멀티플렉싱 벡터의 또 다른 미래의 응용 프로그램에는 유도 또는 단일 유전자의 진압에 대조적으로 완전 한 transcriptional 프로그램의 조작에 대 한 약속 이다. 아마, 이러한 방식을 변형 세포와 장기에는 그것이 가능한 오늘날 보다 훨씬 더 높은 학위를 허용할 것 이다.
The authors have nothing to disclose.
저자 교수 박사 스테판 벡과 교수 박사 Jovica Ninkovic 그들의 입력에 대 한 감사, 도움말 및 STAgR 메서드를 사용 하면 개발에 지원 하 고 싶습니다. Tobias Klötzer, 안 나 Köferle 하 고 유용한 의견에 대 한 발렌틴 바 우만. 작품은 DFG (STR 1385/1-1)에 의해 지원 되었습니다.
Phusion High- Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0530L | Polymerase for Gibson Master Mix as well as all PCRs |
dNTPs | Life Technology | R0191 | dNTPs for all PCRs |
dATP | Life Technology | R0141 | dNTPs for Gibson Master Mix |
dCTP | Life Technology | R0151 | dNTPs for Gibson Master Mix |
dGTP | Life Technology | R0161 | dNTPs for Gibson Master Mix |
dTTP | Life Technology | R0171 | dNTPs for Gibson Master Mix |
Agarose | VWR | 443666A | |
DpnI | NEB | R0176S | |
AMPure XP Beads | Beckman Coulter | A63881 | for DNA clean up |
Tris HCL | Roth | 9090.2 | for Gibson Master Mix |
DTT | Life Technology | R0861 | for Gibson Master Mix |
PEG 8000 | VWR | RC- 077 | for Gibson Master Mix |
NAD | Cayman Chemicals Company | 16077 | for Gibson Master Mix |
T5 Exonuclease | NEB | M0363S | for Gibson Master Mix |
Taq DNA Ligase | NEB | M0208S | for Gibson Master Mix |
Ampicilin | SigmaAldrich | PHR1393-1G | |
DNA Ladder 1kb Plus | Thermo Scientific | SM0311 | |
Plasmid Mini Kit | Thermo Scientific | K0503 | |
Plasmid and Primer Sequences | All sequences available at Figshare (https://goo.gl/UGdc3Q). | ||
EDTA | PanReacAppliChem | 6381-92-6 | for TLE Buffer |
MgCl2 | SigmaAldrich | M8266 | for Gibson Master Mix |
Top10 chemically competent bacteria | Thermo Scientific | C404003 | |
S.O.C. Medium | Thermo Scientific | 15544034 | |
Yeast- Extract | SigmaAldrich | Y1625 | for lysogenic broth (LB Media) |
NaCl | SigmaAldrich | S7653 | for lysogenic broth (LB Media) |
Peptone | SigmaAldrich | 91249 | for lysogenic broth (LB Media) |
Agar-Agar | SigmaAldrich | 5040 | for lysogenic broth (LB Media) |
Taq DNA Polymerase | Quiagen | 201203 |