Här presenterar vi sträng församlingen gärna kloning (STAgR), en metod för att enkelt multiplex gärna vektorer för CRISPR/Cas9 närmar sig. STAgR gör gärna multiplexing enkel, effektiv och anpassningsbar.
Det bakteriella CRISPR/Cas9-systemet ökat väsentligt metodologiska alternativ för life forskare. Tack vare dess utnyttjande blev genetiska och genomisk engineering tillämpliga på ett stort utbud av system. Dessutom många transkriptionell och epigenetisk engineering metoder är nu allmänt genomförbara för första gången. En beror bred tillämpligheten av CRISPR på dess bipartit natur. Små gRNAs bestämma genomisk målen av komplexet, varianter av proteinet Cas9 och lokala molekylär konsekvenserna. Men beror många CRISPR metoder på samtidig leverans av flera gRNAs i enskilda celler. Här presenterar vi ett anpassningsbara protokoll för sträng församlingen gärna kloning (STAgR), en metod som möjliggör enkel, snabb och effektiv generering av multiplexade gärna uttryck vektorer i en enda kloning steg. STAgR är kostnadseffektiv, eftersom (i detta protokoll) införs individuell inriktning sekvenser av kort överhäng primers medan de långa DNA-mallarna av gärna uttryck kassetter kan återanvändas flera gånger. Dessutom tillåter STAgR enda steg införlivandet av ett stort antal gRNAs, samt kombinationer av olika gärna varianter, vektorer och initiativtagare.
Sträng församlingen gärna kloning (STAgR) är en metod som möjliggör effektiv övernattning generation av uttrycket vektorer som innehåller flera gärna uttryck kassetter i en enda kloning steg. Protokollet STAgR beror inte på specialistkompetens eller material och erbjuder flera alternativ för anpassning.
Proteinet bakteriell CRISPR Cas9 har en unik kapacitet. Det ska kunna hitta och selektivt binder endast dessa DNA-sekvenser som kodats i naturligt förekommande crRNAs eller konstruerade gRNAs1. Dess utnyttjande som molekylära verktyg har möjliggjort ett stort antal strategier som var omöjligt, omöjligt eller endast begränsat till vissa cellular-modeller tills nyligen. Dessa inkluderar riktade genen mutationer2, genomet engineering3, epigenomet redigera4,5,6, transkriptionell aktivering och nedtystning7,8. Såvitt vi vet CRISPR är universellt distribuerbara, som rapporter om dess tillämpning finns för en rad mål platser, celltyper och arter. Men beror många CRISPR program direkt eller indirekt på leveransen av flera gRNAs inklusive en serie av genetiska manipulationer (flyttningar9,10, medellång11 och storskalig genomisk förändringar 12 , ( 13), genomet engineering (användning av Cas9 nickases14), generering av villkorlig alleler11,15 eller seriell mutationer16och spårning strategier17. Dessutom för andra metoder (transkriptionell engineering18, epigenomet engineering19,20) flera inriktning webbplatser inte är strikt obligatoriskt, men de når sin maximala effekt ofta endast under detta skick.
Flera användbara metoder har beskrivits för att generera gärna vektorer som innehåller mer än en gärna uttryck kassett21,22,23,24,25,26, 27. Här presenterar vi ett protokoll för STAgR, sträng församlingen gärna kloning, som är enastående i sin kombination av enkelhet och hastighet (endast en övernattning kloning steg behövs), låg kostnad (som DNA mallar kan återanvändas flera gånger), customizability (för olika gärna system och initiativtagare) och effektivitet (det gör generationen av vektorer som innehåller höga siffror gärna kassetter)28.
STAgR kan i princip användas för att generera uttryck vektorer med några (1 – 2 gRNAs), flera (3 – 5 gRNAs) och några av det högsta antalet uttryck kassetter rapporterats hittills (6 – 8 gRNAs)28. Likaså är STAgR tillämplig på gärna sekvens, ryggrad eller arrangören. Eftersom STAgR är dock främst baserad på polymeras kedjereaktioner (PCR) och Gibson montering, ska gRNAs med hög sekvens likheter genereras med hjälp av en alternativ metod.
Här presenterar vi ett detaljerat protokoll för STAgR möjliggör snabb och enkel generering av gärna uttryck plasmider av varierande storlek. Detta protokoll kan användas för one-step generation gärna plasmider med 2 – 8 gärna uttryck kassetter (med eller utan två MS2 RNA aptamers) in gärna uttryck vektorn STAgR_Neo, och användningen av mänskliga U6, mus U6, mänskliga 7sK och mänskliga H1 initiativtagare28 ,32,33. Om fler än fyra kassetter önskas, rekommenderas att använda minst två olika arrangören/byggnadsställning typer för att öka effektiviteten. Andra vektorer, initiativtagare och arrangören kombinationer samt fler än 8 gärna kassetter kan vara genomförbart samt; Detta har dock inte testats. Även om vår erfarenhet metoden fungerar tillförlitligt och reproducibly, har vi fastställt kritiska steg och felsökningsstrategier bör det förväntade resultatet inte omedelbart inträffa. Vår erfarenhet några steg är avgörande för framgången med metoden: först och främst är det viktigt att använda rätt molar nyckeltalen skär till vektor ryggraden vid Gibson församlingen steg (3:1). Vi märkte dock att för vissa gärna uppsättningar förhållandet 1:1 skär till vektor är fördelaktig, även när antalet gärna kassett överstiger två. För det andra, Gibson församlingen reaktionen bör vara tillräckligt lång (minst 45 min rekommenderas).
STAgR kan användas med ett stort antal ändringar. Inriktning sekvenser, gärna kan siffror och ställningar, initiativtagare och vektor ryggrader anpassas och fritt kombineras. Varje kombination kan dock ha lite olika krav. Vår erfarenhet om medium eller höga siffror gärna kassetter (> 4) är önskvärt men inte erhållits omedelbart, oftast det snabbaste sättet att lösa problemet är att ändra ordningen på de enskilda gärna kassetterna i vektorn. På samma sätt kombinera olika gärna initiativtagare och ställningar förbättrar effektiviteten (och således sänker antalet krävs för kolonin primärvården som har som skall poängsättas) när många gärna kassetter klonas. Vi hittade att felaktiga kloner vanligen genereras genom spontan konjunktionen upprepade sekvenser under Gibson montering. Även detta kan minska effektiviteten i metoden, resulterar detta också i samtidig framställning av vektorer med funktionella gärna delmängder28.
Generation av multiplexing gärna vektorer som innehåller mer än en gärna uttryck kassett har rapporterats med ett antal olika metoder21,22,23,24,25, 26,27. Medan vissa anställa simultana eller sekventiella kloning av gärna par22,34, beror andra på Golden Gate församling och flera sekventiella kloning steg25,35. Ett särskilt tillvägagångssätt har använts av Xie et al., genom att anställa endogena cellulära tRNA tillverkningssystemet att skära flera gRNAs ur en enda stamceller avskrift36. Advangetage av denna metod är kravet på endast en arrangören; Nackdelen är behovet av nya syntetiskt DNA-fragment för varje gärna kombination. Varje gärna multiplexing metod har fördelar och nackdelar; STAgR kombinerar enkelhet med effektivitet, hög antal möjligt gärna kassetter med låg kostnad.
STAgR (och andra multiplexering system) kommer sannolikt att bidra möjliggör effektiv (och samtidiga) störningar av flera gener i vivo, som banat väg i zebrafiskar hjärnor28. En annan framtida tillämpning av gärna multiplexering vektorer är löftet för manipulation av kompletta transkriptionell program i motsats till den induktion eller förtryck av enskilda gener. Dessa metoder gör troligt, att omvandla celler och organ på kommer i mycket högre grad än idag är det möjligt.
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka Prof. Dr. Stephan Beck och Prof. Dr. Jovica Ninkovic för deras insats, hjälp och stöd i att utveckla den STAgR metoden. Tobias Klötzer, Anna Köferle och Valentin Baumann för hjälpsamma kommentarer. Arbetet har stötts av DFG (STR 1385/1-1).
Phusion High- Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0530L | Polymerase for Gibson Master Mix as well as all PCRs |
dNTPs | Life Technology | R0191 | dNTPs for all PCRs |
dATP | Life Technology | R0141 | dNTPs for Gibson Master Mix |
dCTP | Life Technology | R0151 | dNTPs for Gibson Master Mix |
dGTP | Life Technology | R0161 | dNTPs for Gibson Master Mix |
dTTP | Life Technology | R0171 | dNTPs for Gibson Master Mix |
Agarose | VWR | 443666A | |
DpnI | NEB | R0176S | |
AMPure XP Beads | Beckman Coulter | A63881 | for DNA clean up |
Tris HCL | Roth | 9090.2 | for Gibson Master Mix |
DTT | Life Technology | R0861 | for Gibson Master Mix |
PEG 8000 | VWR | RC- 077 | for Gibson Master Mix |
NAD | Cayman Chemicals Company | 16077 | for Gibson Master Mix |
T5 Exonuclease | NEB | M0363S | for Gibson Master Mix |
Taq DNA Ligase | NEB | M0208S | for Gibson Master Mix |
Ampicilin | SigmaAldrich | PHR1393-1G | |
DNA Ladder 1kb Plus | Thermo Scientific | SM0311 | |
Plasmid Mini Kit | Thermo Scientific | K0503 | |
Plasmid and Primer Sequences | All sequences available at Figshare (https://goo.gl/UGdc3Q). | ||
EDTA | PanReacAppliChem | 6381-92-6 | for TLE Buffer |
MgCl2 | SigmaAldrich | M8266 | for Gibson Master Mix |
Top10 chemically competent bacteria | Thermo Scientific | C404003 | |
S.O.C. Medium | Thermo Scientific | 15544034 | |
Yeast- Extract | SigmaAldrich | Y1625 | for lysogenic broth (LB Media) |
NaCl | SigmaAldrich | S7653 | for lysogenic broth (LB Media) |
Peptone | SigmaAldrich | 91249 | for lysogenic broth (LB Media) |
Agar-Agar | SigmaAldrich | 5040 | for lysogenic broth (LB Media) |
Taq DNA Polymerase | Quiagen | 201203 |