Summary
本文提出了用气管内注入聚丙烯酸/纳米二氧化硅建立大鼠胸腔积液模型的方案。
Abstract
胸腔积液是许多肺部疾病的临床流行发现。建立一个有用的动物胸腔积液模型对研究这些肺部疾病具有重要意义。以往的胸腔积液模型更关注的是生物因素, 而不是环境中的纳米颗粒。本文介绍了用气管内注入聚丙烯酸/纳米菌的方法制作大鼠胸腔积液的模型, 以及一种在胸腔积液中分离纳米颗粒的方法。通过气管内注入浓度为3.125、6.25 和 12.5 mg/kg * ml 的聚丙烯酸盐, 在第3天出现的大鼠胸腔积液, 在6.25 天和 12.5 mg kg * 组中达到7-10 天的高峰, 然后在第14天慢慢减少和消失。当聚丙烯/纳米二氧化硅浓度增加时, 胸腔积液产生的速度越来越快。经超声检查或 CT 胸部扫描检测这种胸膜液, 并经大鼠解剖证实。透射电镜观察大鼠胸腔积液中的二氧化硅纳米颗粒。这些结果表明, 接触聚丙烯/纳米二氧化硅导致胸腔积液的诱导, 这与我们上一次在人类身上的报告是一致的。此外, 该模型还有利于进一步研究纳米毒理学和胸腔积液疾病。
Introduction
胸腔积液是肺部疾病的一种非常常见的临床表现, 其原因多种多样。建立一个有用的动物胸腔积液模型对研究这些肺部疾病、两层胸膜层的作用、胸腔积液的机制及其治疗具有重要意义。然而, 一些报道的胸腔积液模型主要集中在恶性胸腔积液或生物因素上, 而不是环境中的纳米颗粒 1,2。本文介绍了一种简单、安全、有效的胸腔积液新模型。
随着纳米技术的发展和纳米产品的广泛使用, 人们对纳米材料对环境和人类健康的潜在危害表示担忧.纳米材料引入了风险因素, 并可能导致工作场所或环境污染带来新的危害。体外和体内研究表明, 纳米材料可导致多器官损伤的肺, 心脏, 肝脏, 肾脏, 和神经系统, 以及生殖和免疫系统的5,6。此外, 一些研究报告说, 纳米材料的具体毒性是由于其独特的物理化学特性3,4,7。
我们报告说, 一组职业接触纳米材料的工人临床上出现胸膜和心包积液、肺纤维化和肉芽肿 8,9.在这些患者的胸腔积液中分离出二氧化硅纳米颗粒9。为了复制和验证吸入纳米颗粒在人体中引起的胸腔积液, 我们通过大鼠的呼吸道注入聚丙烯/纳米二氧化硅 (pac7月 nnosi), 模拟了人体的呼吸。环境, 并发现气管内灌注 papacsi 可导致大鼠胸腔积液。本文介绍了如何通过气管内注入 pansi 制作大鼠胸腔积液, 以及如何分离胸腔积液中的纳米颗粒。该模型可用于进一步研究纳米毒理学和胸腔积液疾病。
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Protocol
这项研究遵循了首都医科大学 (中国北京) 关于实验动物护理和使用的指导方针。所有程序均由中国首都医科大学动物伦理委员会批准。
1. 实验制剂
注: 在给药前一周 (环境条件: ligeny:12 h\ 12h, 温度 22±2°c, 湿度 50±10%)。
- 使用新鲜的10毫升 paumnsi 悬浮液 (纳米直径: 20±5 nm 通过原位乳液聚合) 在正常盐水中稀释, 浓度分别为3.125、6.25 和 12.5 mgml, 分别为 10.给药前, 将悬浮液超声至 20-30, 涡旋 10分钟, 以防止纳米颗粒聚集。
- 平均共将20只大鼠分为四组: 每组 papsenpsi (0、3.125、6.25 和 12.5 mgml), 每组一组。
- 要麻醉它们, 请将大鼠放入一个封闭的容器中, 容器中装有1.5 毫升的乙醚 (99.5%)或任何其他 IACUC 批准的协议。麻醉60-90 后, 检查是否缺乏对踏板反射的反应。确保老鼠有呼吸。
- 将麻醉后的大鼠放在板子上, 并在板子上用一条经过消毒的尼龙线固定其门牙。
- 张开嘴, 在手术钳和额叶晶状体的帮助下暴露声门炎的裂隙。
- 将0.5 毫升的 paunpsi 悬浮液将大鼠注射到每只大鼠的肺中, 总共1毫升, 用一根带消毒钝针的细管进入双侧支气管。
- 将老鼠放在塑料板上, 使其处于仰角位置, 让老鼠在5-10 内缓慢恢复。
2. 胸腔积液的超声检查
- 使用带有线性阵列传感器 (频率: 8 MHz) 的超声波系统在第1天、第3天、第7天和第14天10对大鼠进行检查。
- 给大鼠麻醉 (10% 水合氯醛, 0.35 ml·100克, i. p.), 并检查是否缺乏踏板反射。
- 用电动剃须刀从老鼠的胸部和上腹部取下头发。然后将老鼠放在安装板上的仰角位置。
- 用涂布凝胶覆盖皮肤, 然后将换能器放置在肋间空间和肋下区域, 以检测胸膜液。
注: 为了准确地检测积液, 选择左侧和右侧的侧向位置进行超声波检查。 - 超声波检查后, 将大鼠放在塑料板上, 处于仰面位置, 让大鼠在 1 0分钟内慢慢恢复。
3. 胸腔积液的胸部 CT 扫描
- 在给药后第7天和第14天, 用10% 的水合氯醛 (即) 麻醉大鼠。当大鼠对踏板反射没有反应时, 请考虑足够的麻醉深度。
注: 第7天给药后是通过 CT 扫描观察胸腔积液的最适当时间。 - 将大鼠放在塑料板上, 然后用64通道 CT 扫描其胸部, 以调查胸腔积液. 使用以下设置:64 毫米 x 0.625 mm 探测器配置、120千伏 (峰值) 和 350 Ma。
4. 胸腔积液中胸腔积液的收集及纳米颗粒的分离
- 在大鼠胸部 CT 扫描和水合氯醛麻醉下, 检查大鼠的踏板反射, 将头发从腹部剃光到胸部, 然后用碘对皮肤进行消毒。
- 把老鼠带到手术区。
- 在麻醉下, 迅速削减 1-1. 5 厘米的皮肤和腹部肌肉沿中线与完整的隔膜。
- 小心打开胸部, 并检查双侧胸膜腔的帮助下, 推子, 特别是双侧肋胸膜角度。用2毫升无菌注射器收集1-2 毫升的浅黄色胸腔积液。
- 一旦完成, 牺牲老鼠与 IACUC 批准的协议。
- 在 300 x 克的情况下, 将胸腔积液离心在2毫升管中 15分钟, 以分离纳米颗粒。
- 使用明亮液体的上层的一滴, 并在透射电子显微镜 (TEM) 下观察, 加速电压为60-80千伏。
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Representative Results
使用胸腔超声, 我们在第一天没有发现所有组的胸腔积液。然而, 在第3天, 胸腔积液出现在6.25 和 12.5 mgkg ·Ml 组。积液主要呈右肋脑角, 心包积液仅表现为 12.5 mg/kg mL 组。此外, 第7天, 在 6.25 mg/kg ·ml 组 (图 1) 中检测到胸腔积液 (视频 1) 和心包积液 (视频2)。胸腔积液在7-10 内增长缓慢, 然后逐渐减少。第14天, 没有发现胸腔积液, 但所有组都有胸膜粘连的迹象。10
在第7天和第14天, 3.125 和 6.25 Mgkg ·ml 组没有胸腔积液的迹象。然而, 在 12.5 mg/kg * 组, 胸部 CT 扫描是异常的钝后海岸的角度, 这暗示少量胸腔积液 (图 2a, b)。没有观察到液体水平的迹象, 这是因为水量不足造成的。
在解剖大鼠后, 我们在第3天和第7天观察到 6.25 Mg* kg m 和 12.5 Mgkg * mL 群中的琥珀色或无色渗出物。胸腔积液的体积从每个胸腔的 1-1, 000 毫升不等, 分别为 6.25 mgkg 和 12.5 mgskg * mL 基团。在 3.125 mg kg * ml 组中, 在整个实验过程中不出现胸膜腔中的液体。
利用透射电镜, 分别呈现 NPSi 纳米粒子和在排出胸膜流体中形成的簇。胸膜流体的平均直径 (直径: 20±5纳米) 和形态与制备的悬浮液中的 NPSi 一致。纳米粒子主要为球形和分散良好, 单个纳米粒子的平均尺寸为 ~ 20±5纳米 (图 3a, b)。
图 1: 第7天通过声像图显示的胸腔积液的代表性图像.(a、b)来自 3.125 mgkg * 组的大鼠的超声图像, 胸膜和心包腔没有液体。(c, d)6.25 mg * 组大鼠的声像图图像, 有明显的胸腔积液和心包积液。(e, f)来自 12.5 mgkg 组的大鼠的超声图像, 胸膜和心包腔的液体多很多。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2.大鼠胸部 CT 图像的代表性图像.来自 3.125 mgkg * 的大鼠 ct 图像, 没有胸腔积液 (a), 并且来自 12.5 Mgkg ·ml 组的大鼠的 ct 图像, 在胸腔内发现游离液体的否定, 但后海岸角 (b)。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3.聚丙烯多糖悬浮液中的二氧化硅纳米颗粒和大鼠胸腔积液.(a) 聚丙烯酸/二氧化硅纳米复合材料中的二氧化硅纳米颗粒。(b) 有簇或个别形态的大鼠胸腔积液中的二氧化硅纳米颗粒。刻度柱: 200 纳米。请点击这里查看此图的较大版本.
视频1。6.25 mg* Kg mL 组大鼠胸腔积液。请点击这里观看此视频。(右键单击下载.
视频2。6.25 mg k* ml 组大鼠心包积液.请点击这里观看此视频。(右键单击下载.
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Discussion
超声检查是确定肺部疾病最方便的工具, 因为它对胸腔11中的游离液体具有出色的敏感性.这是因为超声可以立即检测到肺12中空气和液体的声阻抗的对比.此外, 在小型动物的模型中, 超声比 CT 更灵活。然而, 肺中的空气反映了声波, 阻碍了观察纳米颗粒注入后的肺内变化。因此, 我们结合胸部 CT 扫描和肺超声检查, 以调查肺内的变化和胸膜液。
在对成像数据进行浏览后, 我们发现成像结果非常显著。首先, 我们的模型证明了 pamaw npsi 确实诱发了异常毒性, 表现为大鼠模型早期的胸膜和心包积液。其次, 该模型成功地再现了人类多丝性积液的发生和发展;同时, 在胸腔和心包积液、肺纤维化和肉芽肿 8, 9 的患者中观察到了这些过程。因此, 这些事实表明胸膜或心包膜等浆膜是 Papse-npsi 的损伤靶点之一, 其性质与石棉引起的损伤目标相似。另外, 正如我们的发现所得出的结论所得出的那样, 多丝性积液的时间线也是有意义的。
至于我们模型的设计, 气管内灌注是关键的一步。该方法确保了纳米颗粒的毒性通过气管进入人体, 这与前一研究13不同。然而, 这种方法的缺点是: pasenpsi 被细管注入双侧支气管, 这需要高度的实验技能, 以防止由于其刺激而引起的气管机械损伤和咳嗽。因此, 关键的一点是气管内灌注的适当深度。同时, 保持适当的麻醉是完成上述步骤的关键。
纳米粒子的使用, 对微粒的研究越来越受到人们的重视。细颗粒的直径越小, 保护它们的挑战性就越大。另一方面, 直径为20±5纳米的纳米二氧化硅确实需要一种高科技的制备方法来准备本研究, 随着直径的减小, 难度增加。因此, 我们的技术的优点之一是纳米二氧化硅的直径, 它比以前的研究13,14小。这项研究的另一个优点是, 我们通过气管而不是皮肤或循环诱导纳米颗粒 13、15、16.例如, 静脉照射阻碍了我们对目标器官的调查, 很难区分原发或继发损害引发的目标器官的损伤。因此, 我们认为, 气管内灌注将是未来调查肺纳米颗粒毒性的最佳方法。此外, 纳米颗粒的用量低于以往的研究13, 具有较高的成本效益比。
对于 papisi 引起的胸膜和心包积液, 其炎症反应和活性氧系统 (ROS) 的产生将是其原因。我们对此的解释如下: 首先, 纳米二氧化硅增加了 ros 浓度, 诱导了炎症产生, 导致线粒体去极化和降低谷胱甘肽水平在体内和体外 5,6.其次, ROS 的炎症和产生增加了肺间质液或胸膜毛细血管通透性, 促进了胸腔积液的最终形成。此外, 胸膜淋巴引流的潜在损伤也可能与胸膜积液有关。随着胸膜液的积累, 真菌压力增大, 最终诱导了 pap模普西在胸膜腔中的沉积。这个结果与我们之前的动物实验一致, 报告的病人是 8,1 0.
对于胸腔积液本身, 在临床上很普遍。然而, 许多呼吸道或全身性疾病可能会导致胸腔积液。因此, 建立动物模型有利于胸腔积液的病因研究。以前的研究报告了纳米二氧化硅13,17的肺毒性。然而, 以前报告的胸腔积液模型主要集中在生物因素上, 而不是纳米颗粒18、19。因此, 纳米颗粒的用量仍是一个悬而未决的问题。我们的模型表明胸腔积液发生在第3天, 后 papamnsi 浓度 6.25 Mg/kg * mL 通过气管内灌注进行, 并在7-10 天达到高峰。此外, 随着 panopsi 浓度的增加, 胸腔积液产生的浓度越来越快。此外, 与生物模型18、19 相比, 我们的胸腔积液模型具有良好的可控性和有效性。总之, 我们的模型将有利于今后对胸腔积液疾病的研究, 特别是对纳米毒性的进一步研究。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
本报告的研究和制作由国家自然科学基金资助 (赠款817373、81773373和赠款 81773373)。我们感谢北京朝阳医院急诊科金燕博士和潘玉杰医生以及北京朝阳医院超声科的曲鹏医生对视频制作的帮助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acuson S2000 Color Doppler ultrasound system | Siemens Medical Solutions, Mountain View ,CA | ||
| Polyacrylate/nanosilica | Fudan University,Shanghai, China | made by order with nanosilica(20±5)nm | |
| 10% chloral hydrate | Beijing Chemical Works | 302-17-0 | |
| Light speed 16 spiral computed tomography | GE Healthcare, US | ||
| Specific pathogen-free Wistar | Animal Center of Lianhelihua (Beijing, China) | Wistar rats |
References
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