Summary
Здесь мы представляем протокол построить модель плеврального выпота в крыс на трахею инстилляции полиакрилат/nanosilica.
Abstract
Плеврит является распространенной клинической нахождения многих легочных заболеваний. Наличие полезных животных плевральный выпот модели очень важно изучить эти легочных заболеваний. Предыдущие модели плевральный выпот уделить больше внимания биологических факторов, а не наночастиц в окружающей среде. Здесь мы представляем модели сделать плеврального выпота в крыс на трахею инстилляции полиакрилат/nanosilica и метод изоляции наночастиц в плеврального выпота. В трахею инстилляции полиакрилат/nanosilica с концентрацией 3.125 и 6,25-12,5 мг/kg∙mL плеврального выпота в крыс, представленные на день 3, достиг пика на 7-10 дней в 6,25 и 12,5 мг/kg∙mL групп, затем медленно снизилась и исчез на 14 день. При увеличении концентрации полиакрилат/nanosilica плеврального выпота, производится больше и быстрее. Этот плевральной жидкости был обнаружен на УЗИ или грудь КТ сканирование и подтверждена рассечение крыс. Кремния наночастиц были замечены в крыс плеврит просвечивающий электронный микроскоп. Эти результаты показали, что воздействие полиакрилат/nanosilica приводит к индукции плеврального выпота, которая согласуется с нашего предыдущего доклада в организме человека. Кроме того эта модель является полезным для дальнейшего изучения нанотоксикология и заболеваний плеврального выпота.
Introduction
Плеврит является очень распространенным клинических проявлений заболевания легких с целым рядом причин. Наличие полезных животных плевральный выпот модели очень важно изучить эти заболевания легких, роли двух слоев плевральной мембраны, механизмов плеврального выпота и ее лечения. Однако некоторые сообщили, что плеврит модели в основном сосредоточены на злокачественного плеврального выпота или биологических факторов, а не наночастиц в среде1,2. Здесь мы представляем новую модель плеврального выпота, который является простым, безопасным и эффективным.
С развитие нанотехнологий и широкое использование Нанопродукты есть озабоченность по поводу потенциальной опасности наноматериалов для окружающей среды и здоровья человека3,4. Наноматериалы ввести факторов риска и потенциально привести к Роман опасностей на рабочем месте или через загрязнения окружающей среды. In vitro и in vivo исследования показывают, что наноматериалов может привести к повреждению мульти орган легкие, сердце, печени, почек, нервной системы, а также репродуктивной и иммунной системыs5,6. Кроме того некоторые исследования сообщили, что конкретные токсичности наноматериалов было обусловлено их уникальными физико-химическими свойствами3,4,7.
Мы сообщили, что группа работников с профессиональным воздействием наноматериалов клинически представлен с плевры и перикарда выпота, легочный фиброз и гранулемы8,9. Кремния наночастиц были изолированы в этих больных плевральный выпот9. Для того, чтобы воспроизвести и проверить плеврального выпота, вызванных ингаляционных наночастиц в человека, мы провели эксперимент, вселяя полиакрилат/nanosilica (ПА/национальный) через дыхательные пути в крыс, которые передразнил человеческого дыхания в реальном окружающей среды и обнаружил, что трахею инстилляции PA/Национальный может привести к плеврального выпота в крыс. Здесь мы представляем, как сделать плеврального выпота в крыс, трахею инстилляции PA/национальный и как изолировать наночастиц в плеврального выпота. Эта модель может быть полезным для дальнейшего изучения нанотоксикология и заболеваний плеврального выпота.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Исследование с руководящими капитала медицинского университета (Пекин, Китай P.R) для ухода и использования экспериментальных животных. Все процедуры были утверждены животное этического Комитета из столицы медицинского университета в Китае.
1. экспериментальные препараты
Примечание: Акклиматизироваться конкретного возбудителя бесплатно Wistar самок (Вес: 200 ± 10 g) в экспериментальной среде за неделю до администрации (условия окружающей среды: свет / темно: 12h / 12h, температура 22 ± 2 ° C, влажность 50% ± 10).
- Используйте свежие 10 мл PA/Национальный суспензий (nanosilica Ø:20 ± 5 Нм на месте эмульсионной полимеризации) разводят в нормальное saline при концентрациях 3.125, 6.25, и 12,5 мг/мл, соответственно10. Перед администрацией sonicate подвески для 20-30 мин и вихревые для 10 мин с целью предотвращения агрегации наночастиц.
- Столь же Разделите в общей сложности 20 крыс на четыре группы: одна группа для каждой концентрации PA/национальный (0, 3.125, 6,25 и 12,5 мг/мл).
- Чтобы анестезировать их, место крыс в закрытом контейнере с 1,5 мл эфира (99,5%) или любые другие протоколы IACUC утверждения. После 60-90 s анестезии проверьте отсутствие реакции на педаль рефлекс. Убедитесь, что крысы дыхание.
- Положите наркотизированных крыс на доске и исправить его передних зубов с стерилизованные линия нейлона на борту тоже.
- Открыть свой рот и подвергать ее щели глотки с помощью Щипцы хирургические и фронтальной линзы.
- Привить крыс с 0,5 мл PA/Национальный подвески для каждого крыса легких для в общей сложности 1 мл с помощью тонкой трубки стерилизованные тупой иглой в двусторонних бронха.
- Место крыс на пластиковой доски в лежачем положении и пусть крысы восстановить медленно в 5-10 мин.
2. Ультразвуковое исследование для плевральный выпот
- Используйте ультразвуковую систему с датчика линейного массива (частота: 8 МГц) для изучения крыс на10дней, 1, 3, 7 и 14.
- Дать наркоз (10% хлораль гидрат, 0,35 мл/100 г, и.п.) для крыс и проверьте отсутствие педали рефлексов.
- Удаление волос из крыс груди и верхней части живота с помощью электробритвы. Затем поместите крысы на монтажной в лежачем положении.
- Обложка кожа с покрытием гель, а затем поместите датчик на межреберное пространство и онкогорошину области, чтобы обнаружить плевральной жидкости.
Примечание: Для того, чтобы точно определить выпота, левой и правой боковой позиции были отобраны для выполнения УЗИ. - Положите крысы на пластиковой доски в лежачем положении после УЗИ и пусть крысы восстановить медленно в 10 мин.
3. грудь КТ для плевральный выпот
- На 7 и 14 дней после администрации анестезировать крыс с 10% хлораль гидрат (i.p). Считать достаточной глубины анестезии, когда крысы не реагирует на педаль рефлексов.
Примечание: После 7 день администрация является наиболее подходящее время для наблюдения за плеврального выпота, КТ сканирование. - Крыса на пластиковый лист в лежачем положении и затем проверять его грудь, чтобы исследовать плеврального выпота, используя 64-канальный CT. использовать следующие параметры: 64 x 0,625 мм детектор конфигурации, 120 кв (пик) и 350 мас.
4. сбор плеврального выпота и изоляции наночастиц в плевральный выпот
- После грудь КТ крыс и под наркозом хлораль гидрат, проверить педаль рефлекс крыс, брить волосы от живота к груди и затем продезинфицировать кожу йодом.
- Принесите крыс в области хирургического.
- Под наркозом быстро сократить 1-1,5 см кожи и мышц живота мечевидный вдоль средней линии с нетронутыми диафрагмы.
- Осторожно открыть сундук и осмотрите двусторонних плевральной полости с помощью пинцета, особенно двусторонних реберного диафрагмальный углов. Соберите с стерильный шприц 2 мл 1-2 мл светло желтая плеврального выпота.
- После этого, пожертвуйте крыс с IACUC утверждения протокола.
- Центрифуга плеврального выпота в 2-мл пробирку для 15 мин на 300 x g с целью изолировать наночастиц.
- Используйте капли верхнего слоя, который является яркой жидкостью и наблюдать под microscope(TEM,) электрона передачи на ускоряющего напряжения 60-80 кв.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
С помощью грудной УЗИ, мы нашли не плеврального излияния на 1 день во всех группах. Однако на третий день, плеврального выпота появился в 6,25 и 12,5 мг/kg∙mL групп. Выпота был главным образом право прибрежного диафрагмальный угол, а Экссудативный перикардит, представлены только в 12,5 мг/kg∙mL группы. Кроме того день 7, плевральный выпот (1 видео) и Экссудативный перикардит (2 видео) были обнаружены в 6,25 мг/kg∙mL группы (рис. 1). Плеврит увеличено медленно в максимальной степени на 7-10 дней и затем постепенно снижалась. На 14 день не плевральный выпот было обнаружено больше, но с знаком адгезии плевры во всех группах. 10
На 7 и 14 дней не было никаких признаков плеврального выпота в 3,125 и 6,25 мг/kg∙mL группы10. Однако в группе 12,5 мг/kg∙mL, грудь КТ сканирования был ненормальным с тупым задняя costophrenic угол, который намекнул на небольшое количество плевральный выпот (рис. 2а, b). Никаких признаков уровня жидкости были замечены, которые объяснили, из-за недостаточного количества воды.
После рассечения крыс мы наблюдали автожелтой или бесцветной излияния в 6,25 мг/kg∙mL и 12,5 мг/kg∙mL группы на 3 и 7 дни. Объемы плевральный выпот варьируются от 1-1.8 мл в каждом плевральной полости в 6,25 мг/kg∙mL и 12,5 мг/kg∙mL групп. В группе 3.125 mg/kg∙mL без жидкости в плевральной полости появилась в процессе полной экспериментальной.
С ТЕА Национальный наночастиц представил индивидуально и кластеры образована в осушенных плевральной жидкости. Средний диаметр (Ø: 20 ± 5 Нм) и морфология в плевральной жидкости согласуются с Национальный в подготовленных подвеска. Наночастицы были в основном сферической и хорошо дисперсных, и средний размер отдельных наночастиц было ~ 20 ± 5 Нм (рис. 3, б).
Рисунок 1 : Представитель изображения плеврит сонографические находки на день 7. (a, b) Сонографические изображения от крыс в группе 3.125 mg/kg∙mL с не жидкости в полости плевры и перикарда. (c, d) Сонографические изображения от крыс в группе 6,25 мг/kg∙mL с очевидной плеврального выпота и Экссудативный перикардит. (e, f) Сонографические изображения от крыс в группе 12,5 мг/kg∙mL с гораздо больше жидкости в полости плевры и перикарда. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 . Представитель изображения грудной CT в крысах. КТ изображения от крыс в группе 3.125 mg/kg∙mL без плевральный выпот () и КТ изображение из крыса в группе 12,5 мг/kg∙mL с отрицательным выводом свободной жидкости, но тупым задняя costophrenic угол в плевральной полости (b). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 . Кремния наночастиц в полиакрилат/nanosilica подвеска и плеврит крыса. () кремния наночастиц в нанокомпозитных полиакрилат/кремнезема. (b) кремния наночастиц в крыса плевральный выпот с кластерами или отдельные формы. Линейки: 200 Нм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Видео 1. Плеврального выпота в крысу в группе 6,25 мг/kg∙mL. Пожалуйста нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Правой кнопкой мыши для загрузки.)
Видео 2. Экссудативный перикардит крыс в группе 6,25 мг/kg∙mL. Пожалуйста нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Правой кнопкой мыши для загрузки.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
УЗИ является наиболее удобным инструментом для определения заболевания легких, из-за его превосходную чувствительность к свободной жидкости в плевральной полости11. Это потому, что УЗИ сразу можно обнаружить контраст в акустическое сопротивление воздуха и жидкости в легких12. Кроме того сонография является более гибким в маленькое животное модель, чем CT. Тем не менее воздух в легких отражение звуковой волны и препятствуют от наблюдения внутрилегочного изменений после инстилляции наночастиц. Таким образом мы объединили КТ грудной клетки и легких сонографии для расследования внутрилегочного изменения и плевральной жидкости.
После осмотра визуализации данных, мы нашли визуализации результаты замечательные. Во-первых наша модель продемонстрировала, что PA/национальный, действительно индуцированной необычные токсичности, который проявляется как плевральной и Экссудативный перикардит на раннем этапе в мышиной модели. Во-вторых эта модель успешно воспроизведен возникновение и развитие человеческого polyserous излияния; между тем эти процессы наблюдались в наших пациентов, которым вручены плевры и перикарда выпота, легочный фиброз и гранулемы8,9. Таким образом эти факты подразумевает, что Серозная пленка как плевральной мембраны или перикарда мембраны является одной из целей травмы PA/национальный, который был аналогичен по своему характеру вызванных асбестом. Кроме того график polyserous излияния был значимым, как заключение наши выводы.
Что касается дизайна нашей модели трахею инстилляции был критический шаг. Этот метод обеспечивает, что токсичность наночастиц вошел в тело через трахеи, который отличался от предыдущих исследования13. Однако, минусы этого метода были следующие: PA/Национальный было воплощено в двусторонних бронха тонкой трубки, которая требует высоко экспериментальный навыки для предотвращения механических повреждений трахеи и кашель, вызванные ее раздражение. Таким образом критическая точка был надлежащую глубину трахею инстилляции. Тем временем поддержание надлежащего анестезия имеет решающее значение для завершения вышеупомянутого шага.
Использование наночастиц, мелкие частицы для исследовательских целей встают все больше и больше внимания. Чем меньше диаметр мелких частиц, тем более сложным это, чтобы защитить их. С другой стороны нано кремния диаметром 20 Нм ± 5 действительно требуется метод хай тек подготовки для подготовки этого исследования, привело к увеличению сложности с уменьшением диаметра. Таким образом одним из плюсов нашей техники был диаметр нано кремнезема, который был меньше, чем предыдущие исследования13,14. Еще одно преимущество этого исследования было, что мы индуцированной наночастиц через трахеи, а не кожи или тираж13,,1516. К примеру внутривенного облучения мешает нам в расследовании органа-мишени, который было трудно отличить повреждения вызваны первичного или вторичного повреждения органа-мишени. Таким образом по нашему мнению, трахею инстилляции должна быть лучшим способом для изучения токсичности наночастиц легких в будущем. Кроме того дозировка наночастиц был ниже, чем предыдущего исследования13, который представил более высокий коэффициент эффективности затрат.
Что касается плевры и Экссудативный перикардит, вызванных PA/Национальный реакция воспаления и производство системы активных форм кислорода (ROS) бы причиной этого. Мы объяснить его следующим образом: во-первых, nanosilica увеличение концентрации рос, индуцированной воспалительных производства, вызвало митохондриальной деполяризации и снижение уровня глутатиона оба в vivo и in vitro в5,6. Во-вторых воспаление и производства рос увеличению межклеточной жидкости в легких или проницаемость капилляров плевры, способствовавшие формированию плеврального выпота в конце. Кроме того потенциального обесценения плевральной лимфатический дренаж может быть также участвует в накопление плевральной жидкости. С более накопление плевральной жидкости oncotic давление увеличилось, который наконец индуцированной осаждения PA/Национальный в плевральной полости. Этот результат согласуется с наших предыдущих экспериментов на животных и сообщил пациентов8,10.
Для плеврального выпота, сама была распространена в клинике. Тем не менее многие дыхания или системных заболеваний может привести к плеврального выпота. Таким образом строительство животной модели выиграют этиологические исследование плеврального выпота. Предыдущие исследования сообщили легких токсичность nanosilica13,17. Однако предыдущие модели сообщил плевральный выпот главным образом на биологические факторы, а не наночастиц18,19. Таким образом дозировка наночастиц остается открытым вопросом. Наша модель продемонстрировала, что плеврит произошли на 3 день после ПА/Национальный концентрации 6,25 мг/kg∙mL был в ведении инстилляции трахею и достиг пика на 7-10 дней. Кроме того с увеличением концентрации PA/национальный, плевральный выпот, производится больше и быстрее. Кроме того по сравнению с биологической модели18,19, наша модель плевральный выпот был хорошо управляемой и эффективной. Короче говоря, наша модель будет полезным для будущих исследований заболеваний плеврального выпота, а также для дальнейшего изучения nanotoxicity в частности.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Настоящее исследование и производство этой статьи были финансируется Фонд национального естественных наук Китая (Грант 81773373, 81172614 и Грант 81441089). Мы благодарим д-р Ян Jin и доктор Пан Юйцзе, Департамент чрезвычайных ситуаций, Пекин Chaoyang больницы и доктор Qu Пэн Департамента УЗИ медицины, Пекин Chaoyang больницы для оказания помощи с видео-продукции.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acuson S2000 Color Doppler ultrasound system | Siemens Medical Solutions, Mountain View ,CA | ||
| Polyacrylate/nanosilica | Fudan University,Shanghai, China | made by order with nanosilica(20±5)nm | |
| 10% chloral hydrate | Beijing Chemical Works | 302-17-0 | |
| Light speed 16 spiral computed tomography | GE Healthcare, US | ||
| Specific pathogen-free Wistar | Animal Center of Lianhelihua (Beijing, China) | Wistar rats |
References
- Stathopoulos, G. T., et al. Nuclear factor-kappaB affects tumor progression in a mouse model of malignant pleural effusion. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 34 (2), 142-150 (2006).
- Shen, J., et al. The dosage-toxicity-efficacy relationship of kansui and licorice in malignant pleural effusion rats based on factor analysis. Journal of Ethnopharmacology. 186, 251-256 (2016).
- Nel, A., Xia, T., Mädler, L., Li, N. Toxic potential of materials at the nanolevel. Science. 311 (5761), 622-627 (2006).
- Maynard, A. D., et al.
- Duan, J., et al. Toxic effects of silica nanoparticles on zebrafish embryos and larvae. PLoS One. 8 (9), 74606 (2013).
- Skuland, T., Ovrevik, J., Låg, M., Schwarze, P., Refsnes, M. Silica nanoparticles induce cytokine responses in lung epithelial cells through activation of a p38/TACE/TGF-α/EGFR-pathway and NF-κΒ signaling. Toxicology and Applied Pharmacology. 279 (1), 76-86 (2014).
- Oberdörster, G., Oberdörster, E., Oberdörster, J. Nanotoxicology: an emerging discipline evolving from studies of ultrafine particles. Environmental Health Perspectives. 113 (7), 823-839 (2005).
- Song, Y., Li, X., Du, X. Exposure to nanoparticles is related to pleural effusion, pulmonary fibrosis and granuloma. European Respiratory Journal. 34 (3), 559-567 (2009).
- Song, Y., et al. Nanomaterials in humans: identification, characteristics, and potential damage. Toxicologic Pathology. 39 (5), 841-849 (2011).
- Zhu, X., et al. Polyacrylate/nanosilica causes pleural and pericardial effusion, and pulmonary fibrosis and granuloma in rats similar to those observed in exposed workers. International Journal of Nanomedicine. 11, 1593-1605 (2016).
- Havelock, T., et al. Pleural procedures and thoracic ultrasound: British Thoracic Society Pleural Disease Guideline 2010. Thorax. 65, Suppl 2 61-76 (2010).
- Jha, A., Ullah, E., Gupta, P., Gupta, G., Saud, M. Sonography of multifocal hydatidosis involving lung and liver in a female child. Journal of Medical Ultrasound. 40 (4), 471-474 (2013).
- Hikaru, N., et al. Histological analysis of 70-nm silica particles-induced chronic toxicity in rats. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 72, 626-629 (2009).
- Sun, L., et al. Cytotoxicity and mitochondrial damage caused by silica nanoparticles. Toxicology in Vitro. 25, 1619-1629 (2011).
- Hikaru, N., et al.
- Liu, T. I., et al. Single and repeated dose toxicity of mesoporous hollow silica nanoparticles in intravenously exposed mice. Biomaterials. 32, 1657-1668 (2011).
- Ding, M., et al. Diseases caused by silica: Mechanisms of injury and disease development. International Immunopharmacology. 2, 173-182 (2002).
- Shen, J., et al. The dosage-toxicity-efficacy relationship of kansui and licorice in malignant pleural effusion rats based on factor analysis. Journal of Ethnopharmacology. 186, 251-256 (2016).
- Ji, J. H., et al. Twenty-eight-day inhalation toxicity study of silver nanoparticles in Sprague-Dawley rats. Inhalation Toxicology. 19 (10), 857-871 (2007).
