Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para construir um modelo de derrame pleural em ratos por instilação intratraqueal de poliacrilato/nanosilica.
Abstract
Derrame pleural é um achado clínico predominante de muitas doenças pulmonares. Ter um modelo útil animal derrame pleural é muito importante para estudar estas doenças pulmonares. Modelos anteriores do derrame pleural prestado mais atenção a fatores biológicos, ao invés de nanopartículas no ambiente. Aqui, apresentamos um modelo para fazer derrame pleural em ratos por instilação intratraqueal de poliacrilato/nanosilica e um método de isolamento de nanopartículas em derrame pleural. Por instilação endotraqueal de poliacrilato/nanosilica com concentrações de 3,125, 6,25 e 12,5 mg/kg∙mL, o derrame pleural em ratos apresentada no dia 3, atingiu um pico de dias 7-10 6,25 e 12,5 mg/kg∙mL grupos, então lentamente diminuiu e desapareceu no dia 14. Quando a concentração de poliacrilato/nanosilica aumentada, o derrame pleural é produzido o mais e mais rápido. Este fluido pleural foi detectado pelo exame de ultra-som ou peito CT varredura e confirmado pela dissecação dos ratos. Nanopartículas de sílica foram observadas em derrame pleural dos ratos por microscópio eletrônico de transmissão. Estes resultados mostraram que a exposição ao poliacrilato/nanosilica leva à indução de derrame pleural, que era consistente com nosso relatório anterior em seres humanos. Além disso, este modelo é benéfico para o um estudo mais aprofundado de nanotoxicology e as doenças de derrame pleural.
Introduction
Derrame pleural é uma manifestação clínica muito comum de doenças pulmonares com uma variedade de causas. Ter um modelo útil animal derrame pleural é muito importante para estudar estas doenças pulmonares, as funções de seu tratamento, os mecanismos de derrame pleural e as duas camadas de membrana pleural. No entanto, alguns relataram que modelos de efusão pleural principalmente focar o derrame pleural maligno ou fatores biológicos, ao invés das nanopartículas no meio ambiente1,2. Aqui, apresentamos um novo modelo de derrame pleural que é simples, seguro e eficaz.
Com o desenvolvimento das nanotecnologias e o uso extensivo de nanoprodutos, há uma preocupação sobre os riscos potenciais de nanomateriais para o ambiente e a saúde humana3,4. Nanomateriais introduzir factores de risco e potencialmente causar danos romance dentro do local de trabalho ou por meio de contaminação ambiental. Estudos in vitro e in vivo mostram que os nanomateriais podem resultar em danos em vários órgãos para os pulmões, o coração, o fígado, o rim e o sistema nervoso, bem como a reprodução e sistema imunológicos5,6. Além disso, alguns estudos relataram que a toxicidade específica dos nanomateriais foi devido a suas propriedades físico-químicas únicas3,4,7.
Informamos que um grupo de trabalhadores com exposição ocupacional aos nanomateriais clinicamente apresentada com efusão pleural e pericárdica, fibrose pulmonar e granuloma8,9. Nanopartículas de sílica foram isoladas em derrame pleural9 estes pacientes. Para reproduzir e verifique se o derrame pleural induzido pelas nanopartículas inaladas em humanos, foi realizado o experimento instilando o poliacrilato/nanosilica (PA/NPSi) através do trato respiratório em ratos, que imitava a respiração humana em um real ambiente e encontrei esse intratraqueal instilação de PA/NPSi poderia resultar em derrame pleural em ratos. Aqui, apresentamos como fazer derrame pleural em ratos por instilação intratraqueal de PA/NPSi e como isolar nanopartículas em derrame pleural. Este modelo pode ser útil para o estudo de mais de nanotoxicology e doenças de derrame pleural.
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Protocol
O estudo seguiu as diretrizes da Universidade de medicina de Capital (Beijing, PR China) para o cuidado e o uso de animais experimentais. Todos os procedimentos foram aprovados pela Animal ético Comité de Capital Medical University na China.
1. experimentais preparações
Nota: Se aclimatar os feminino específico isentos de organismos patogénicos ratos Wistar (peso: 200 ± 10 g) aos ambientes experimentais para uma semana antes da administração (condições ambientais: luz / escuro: 12h / 12h, temperatura de 22 ± 2 ° C, umidade de 50 ± 10%).
- Use um fresco 10ml de suspensões de PA/NPSi (nanosilica Ø:20 ± 5 nm por polimerização in situ emulsão) diluído em solução salina normal em concentrações de 3.125, 6.25 e 12,5 mg/mL, respectivamente,10. Antes da administração, proceda à sonicação as suspensões para 20-30 min e vortex durante 10 minutos para evitar a agregação de nanopartículas.
- Divida igualmente um total de 20 ratos em quatro grupos: um grupo para cada concentração de PA/NPSi (0, 3.125, 6.25 e 12,5 mg/mL).
- Para anestesia, coloque os ratos em um recipiente fechado com 1,5 mL de éter (99,5%) ou quaisquer outros protocolos IACUC aprovado. Depois de 60-90 s de anestesia, verificar a falta de resposta ao reflexo de pedal. Certifique-se de que os ratos estão respirando.
- Colocar o rato anestesiado no quadro e consertar seus dentes da frente com uma linha esterilizada de nylon na placa também.
- Abra sua boca e expor sua fissura da glote, com a ajuda de uma pinça cirúrgica e lente frontal.
- Incutir os ratos com 0,5 mL de suspensão de PA/NPSi para pulmão de cada rato para um total de 1 mL, usando um tubo fino com uma agulha esterilizada para o brônquio bilateral.
- Coloque os ratos em uma placa de plástico em uma posição supina e deixar que os ratos recuperar lentamente em 5-10 min.
2. derrame pleural exame ultra-som
- Usar um sistema de ultra-som com um transdutor linear (frequência: 8 MHz) para examinar os ratos em dias 1, 3, 7 e 1410.
- Verificar a falta de reflexos pedais e dar anestesia (hidrato de cloral 10%, 0,35 mL/100 g, i.p.) para os ratos.
- Remova o cabelo do abdômen, peito e superior dos ratos usando um barbeador elétrico. Em seguida, coloque o rato sobre uma placa de montagem na posição supina.
- Cubra a pele com o gel revestido e em seguida, coloque o transdutor no espaço intercostal e subcostal área para detectar o fluido pleural.
Nota: A fim de detectar a efusão com precisão, a esquerda e as posições de laterais direita foram selecionadas para realizar um exame de ultra-som. - Coloque o rato em uma placa de plástico em uma posição supina após exame ultra-sonográfico e deixar que os ratos recuperar lentamente em 10 min.
3. peito CT varredura para derrame pleural
- Na pós-administração dias 7 e 14, anestesia os ratos com hidrato de cloral 10% (IP). Quando o rato não reage a pedalar reflexos considere suficiente profundidade da anestesia.
Nota: A pós-administração dia 7 é o momento mais adequado para observar o derrame pleural por tomografia. - Coloque o rato sobre uma folha de plástico em posição e depois digitalizar no peito para investigar derrame pleural usando um 64 canais CT. Use as seguintes configurações: configuração de detector de 64 x 0,625 mm, 120 kV (pico) e 350 mAs.
4. coleção de derrame pleural e isolamento de nanopartículas em derrame pleural
- Depois peito CT varredura de ratos e sob anestesia de hidrato de cloral, verificar o reflexo pedal dos ratos, raspar o cabelo do abdômen, peito e então desinfectar a pele por iodo.
- Trazer os ratos para a área cirúrgica.
- Sob anestesia, rapidamente corte 1 a 1,5 cm da pele e músculos abdominais para xifoide ao longo da linha mediana com o diafragma intacta.
- Cuidadosamente Abra o baú e inspecionar as cavidades pleurais bilaterais, com a ajuda de uma pinça, especialmente os ângulos frênico costais bilaterais. Colete 1 a 2 mL de derrame pleural luz-amarelo com uma seringa estéril de 2 mL.
- Uma vez feito, sacrifica os ratos com protocolo IACUC aprovado.
- Centrifugue o derrame pleural em um tubo de 2 mL por 15 min a 300 x g a fim de isolar as nanopartículas.
- Use uma gota de camada superior, que é o líquido brilhante e observar sob uma microscope(TEM,) de elétron de transmissão em uma tensão de aceleração de 60-80 kV.
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Representative Results
Não usando um ultra-som torácico, encontramos nenhum derrame pleural no dia 1 em todos os grupos. No entanto, no dia 3, o derrame pleural apareceu nos grupos 6,25 e 12,5 mg/kg∙mL. O derrame foi principalmente no ângulo frênico costal direito, enquanto o derrame pericárdico apenas apresentado em 12,5 mg/kg∙mL grupo. Além disso, no dia 7, tanto o derrame pleural (Video 1) e derrame pericárdico (vídeo 2) foram detectados em 6,25 mg/kg∙mL grupo (Figura 1). Derrame pleural aumentado lentamente na maior medida nos dias 7-10 e então diminuiu gradualmente. No dia 14, sem derrame pleural foi encontrado mais, mas com o sinal da adesão da pleura em todos os grupos. 10
Nos dias 7 e 14, não havia sinais de derrame pleural em 3,125 e 6,25 mg/kg∙mL grupos de10. No entanto, no grupo de 12,5 mg/kg∙mL, a varredura de CT de tórax foi anormal com o ângulo de costophrenic posterior romba, que deu a entender em uma pequena quantidade de derrame pleural (Figura 2a, b). Observaram-se sem sinais do nível do líquido, que foi explicado devido a uma quantidade insuficiente de água.
Após dissecação dos ratos, observamos efusões âmbar ou incolores na 6,25 mg/kg∙mL e grupos de 12,5 mg/kg∙mL nos dias 3 e 7. Os volumes de derrame pleural variam de 1-1.8 mL em cada cavidade pleural no 6,25 mg/kg∙mL e grupos de 12,5 mg/kg∙mL. No grupo de 3,125 mg/kg∙mL, nenhum fluido nas cavidades pleurais apareceu no processo experimental completo.
Com a temperatura, as nanopartículas NPSi apresentadas individualmente e clusters formaram no fluido pleural drenado. O diâmetro médio (Ø: 20 ± 5 nm) e a morfologia no fluido pleural foram consistentes com o NPSi na suspensão preparada. As nanopartículas foram principalmente esférico e bem dispersos, e o tamanho médio de uma nanopartícula individual foi ~ 20 ± 5 nm (Figura 3a, b).
Figura 1 : Imagens representativas do derrame pleural por sonográfico descobertas no dia 7. (a, b) Sonográfico imagens de um rato no grupo de 3,125 mg/kg∙mL com nenhum fluido nas cavidades pleurais e pericárdicas. (c, d) Sonográfico imagens de um rato no grupo de 6,25 mg/kg∙mL com aparente derrame pleural e derrame pericárdico. (e, f) Sonográfico imagens de um rato no grupo de 12,5 mg/kg∙mL com muito mais fluido nas cavidades pleurais e pericárdicas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 . Imagens representativas de imagens de CT torácicas em ratos. CT da imagem de um rato no grupo de 3,125 mg/kg∙mL sem derrame pleural (um) e a imagem de CT de um rato no grupo de 12,5 mg/kg∙mL com uma conclusão negativa de fluido livre mas o ângulo de costophrenic posterior romba na cavidade pleural (b). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 . Nanopartículas de sílica em suspensão de poliacrilato/nanosilica e o derrame pleural de um rato. (um) nanopartículas de sílica em nanocompósitos de poliacrilato/sílica. (b) nanopartículas de sílica em derrame pleural de ratos com clusters ou de forma individual. Barra de escala: 200 nm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Vídeo de 1. O derrame pleural em um rato no grupo de 6,25 mg/kg∙mL. Por favor clique aqui para ver este vídeo. (Botão direito do mouse para fazer o download.)
Vídeo 2. O derrame pericárdico em ratos no grupo de 6,25 mg/kg∙mL. Por favor clique aqui para ver este vídeo. (Botão direito do mouse para fazer o download.)
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Discussion
Sonografia é a ferramenta mais conveniente para a determinação de doenças pulmonares, devido a sua excelente sensibilidade para o líquido livre na cavidade pleural11. Isso é porque a ecografia pode detectar imediatamente o contraste de impedância acústica de ar e fluidos no pulmão12. Além disso, a ecografia é mais flexível no modelo de um pequeno animal que CT. No entanto, o ar no pulmão refletiu a onda sonora e impedidos de observar as mudanças intrapulmonares após a instilação de nanopartículas. Portanto, nós combinamos TAC torácica e ecografia de pulmão para investigar as alterações intrapulmonares e o fluido pleural.
Depois de explorar os dados de imagem, encontramos os resultados de imagem notável. Em primeiro lugar, o nosso modelo demonstrou que o PA/NPSi, certamente induzido a toxicidade incomum, que se manifestou como o pleural e o derrame pericárdico em fase inicial no modelo do rato. Em segundo lugar, este modelo reproduzido com sucesso a ocorrência e o desenvolvimento de efusões de polyserous humana; Entretanto, estes processos foram observados em nossos pacientes, que apresentaram com efusão pleural e pericárdica, fibrose pulmonar e granuloma8,9. Assim, estes factos implícito que a membrana seroso, tais como a membrana pleural ou a membrana pericárdica era um dos alvos de PA/NPSi, lesão que foi similar em natureza a causada pelo amianto. Também, o cronograma de efusões de polyserous foi significativo como concluído por nossos resultados.
Quanto para ao projeto do nosso modelo, a instilação endotraqueal foi o passo crítico. Esse método assegurado que a toxicidade de nanopartículas entrou no corpo através da traqueia, que foi diferente do estudo anterior13. No entanto, as desvantagens desse método são as seguintes: a PA/NPSi foi inculcado em brônquio bilateral pelo tubo fino, que exigia habilidades altamente experimentais para impedir o dano mecânico para a traqueia e a tosse causada devido a sua irritação. Assim, o ponto crítico foi a profundidade apropriada da instilação endotraqueal. Enquanto isso, manter adequada anestesia foi fundamental para completar a etapa acima mencionada.
O uso de nanopartículas, as partículas finas para os fins de pesquisa estão captando mais e mais atenção. Quanto menor o diâmetro das partículas finas, quanto mais desafiador é para protegê-los. Por outro lado, o nano-sílica com um diâmetro de 20 nm ± 5 realmente necessário um método de preparação de alta tecnologia para se preparar para este estudo, causado um aumento na dificuldade com a diminuição de diâmetro. Assim, um dos profissionais de nossa técnica foi o diâmetro de nano-sílica, que era menor do que o anterior estudo13,14. Outra vantagem deste estudo foi que induzimos a nanopartículas via traqueal, em vez de pele ou circulação13,15,16. Por exemplo, a exposição por via venosa nos dificultado em investigar o órgão-alvo, que era difícil distinguir a lesão de órgão alvo, desencadeada pelo dano primário ou secundário. Daí, em nossa opinião, a instilação endotraqueal deve ser a melhor maneira de investigar a toxicidade de nanopartículas dos pulmões no futuro próximo. Além disso, a dosagem de nanopartículas foi menor que o anterior estudo13, que apresentou uma maior relação de custo-eficácia.
Quanto a pleural e o derrame pericárdico induzida pelo PA/NPSi, a reação de inflamação e produção de sistema reativas de oxigênio (ROS) seria a causa disso. Explicamos isso da seguinte forma: em primeiro lugar, o nanosilica aumentou as concentrações de ROS, induzido produção inflamatória, causada despolarização mitocondrial e reduziu os níveis de glutationa ambos in vivo e in vitro5,6. Em segundo lugar, a inflamação e produção de ROS aumentaram o líquido intersticial do pulmão ou permeabilidade dos capilares pleurais, que promoveu a formação de derrame pleural no final. Além disso, o comprometimento potencial da drenagem linfática pleural também pode estar envolvido na acumulação do fluido pleural. Com mais acúmulo de líquido pleural, tinha aumentado a pressão oncótica, que finalmente induzido a deposição de PA/NPSi nas cavidades pleurais. Este resultado foi consistente com nossas experiências anteriores do animais e relatou pacientes8,10.
Para o derrame pleural em si, foi prevalente na clínica. No entanto, muitas doenças respiratórias ou sistêmicas podem causar derrame pleural. Portanto, construir um modelo animal beneficiaria o estudo etiológico do derrame pleural. O estudo anterior relatou a toxicidade pulmonar da nanosilica13,17. No entanto, os modelos anteriores de derrame pleural relatados principalmente focada em fatores biológicos, ao invés de nanopartículas18,19. Portanto, a dosagem de nanopartículas permaneceu um problema aberto. Nosso modelo demonstrou que o derrame pleural ocorreu no dia 3, depois de uma concentração de PA/NPSi de 6,25 mg/kg∙mL foi administrado por instilação endotraqueal e atingiu um pico nos dias 7-10. Além disso, com concentrações crescentes de PA/NPSi, o derrame pleural produzido mais e mais rápido. Além disso, em comparação com modelos biológicos18,19, nosso modelo de efusão pleural foi bem controláveis e eficaz. Para resumir, nosso modelo seria benéfico para os futuros estudos de doenças de derrame pleural, bem como quanto o um estudo mais aprofundado de nanotoxicity em particular.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
O presente estudo e produção para este artigo foram financiados pela Fundação Nacional de ciências naturais da China (Grant 81773373, 81172614 e Grant 81441089). Agradecemos o Dr. Jin Yan e Dr. Pan Yujie, do departamento de emergência, Hospital de Chaoyang Beijing e Dr. Qu Peng do departamento de ultrasom medicina, Hospital de Chaoyang Beijing para ajudar com a produção de vídeo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acuson S2000 Color Doppler ultrasound system | Siemens Medical Solutions, Mountain View ,CA | ||
| Polyacrylate/nanosilica | Fudan University,Shanghai, China | made by order with nanosilica(20±5)nm | |
| 10% chloral hydrate | Beijing Chemical Works | 302-17-0 | |
| Light speed 16 spiral computed tomography | GE Healthcare, US | ||
| Specific pathogen-free Wistar | Animal Center of Lianhelihua (Beijing, China) | Wistar rats |
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