Summary
Qui, presentiamo un protocollo per costruire un modello di effusione pleurica in ratti mediante instillazione intratracheale di poliacrilato/nanosilice.
Abstract
L'effusione pleurica è un'individuazione clinica prevalente di molte malattie polmonari. Avere un modello utile animale effusione pleurica è molto importante per lo studio di queste malattie polmonari. Modelli precedenti di effusione pleurica pagato più attenzione a fattori biologici, piuttosto che le nanoparticelle nell'ambiente. Qui, presentiamo un modello per rendere l'effusione pleurica in ratti mediante instillazione intratracheale di poliacrilato/nanosilice e un metodo di isolamento di nanoparticelle nell'effusione pleurica. Mediante instillazione intratracheale di poliacrilato/nanosilice con concentrazioni di 3.125, 6.25 e 12,5 mg/kg∙mL, l'effusione pleurica in ratti ha presentato il giorno 3, ha raggiunto la posizione di giorni 7-10 a 6.25 e 12,5 mg/kg∙mL gruppi, poi lentamente diminuito e scomparso il giorno 14. Quando la concentrazione di poliacrilato/nanosilice aumentata, l'effusione pleurica è più prodotto e più veloce. Questo liquido pleurico è stato rilevato dall'ecografia o cassa CT scansione e confermato tramite la dissezione dei ratti. Nanoparticelle di silice sono state osservate nell'effusione pleurica dei ratti da microscopio elettronico a trasmissione. Questi risultati hanno mostrato che l'esposizione a poliacrilato/nanosilice conduce all'induzione di effusione pleurica, che era costante con la nostra precedente relazione in esseri umani. Inoltre, questo modello è utile per l'ulteriore studio di nanotossicologia e le malattie di effusione pleurica.
Introduction
L'effusione pleurica è una manifestazione clinica molto comune delle malattie polmonari con una varietà di cause. Avere un modello utile animale effusione pleurica è molto importante per studiare queste malattie polmonari, i ruoli di due strati di membrana pleurica, i meccanismi di effusione pleurica ed il relativo trattamento. Tuttavia, alcuni segnalati modelli di effusione pleurica si concentrano principalmente sull'effusione pleurica maligna o fattori biologici piuttosto che le nanoparticelle in ambiente1,2. Qui, presentiamo un nuovo modello di versamento pleurico che è semplice, sicuro ed efficace.
Con lo sviluppo delle nanotecnologie e l'uso estensivo di nanoprodotti, c'è una preoccupazione circa i rischi potenziali dei nanomateriali per l'ambiente e la salute umana3,4. Nanomateriali introducono fattori di rischio e potenzialmente portano a nuovi pericoli sul posto di lavoro o tramite contaminazione ambientale. Gli studi in vitro e in vivo indicano che i nanomateriali possono causare danni multiorgano a polmoni, cuore, fegato, rene e il sistema nervoso, nonché del sistema riproduttivo e sistema immunitarios5,6. Inoltre, alcuni studi ha riferito che la tossicità specifica dei nanomateriali è stato a causa di loro proprietà fisico-chimiche uniche3,4,7.
Abbiamo riferito che un gruppo di lavoratori con esposizione professionale ai nanomateriali ha presentato clinicamente con effusione pleurica e pericardica, fibrosi polmonare e granuloma8,9. Nanoparticelle di silice sono state isolate in questi patients' effusione pleurica9. Al fine di riprodurre e verificare l'effusione pleurica indotta da nanoparticelle inalate in essere umano, abbiamo condotto l'esperimento infondendo il poliacrilato/nanosilice (PA/NPSi) tramite le vie respiratorie nei ratti, che ha imitato la respirazione umana in un vero e proprio ambiente e abbiamo trovato quel intratracheale instillazione di PA/NPSi potrebbe comportare l'effusione pleurica in ratti. Qui, vi presentiamo come fare versamento pleurico in ratti mediante instillazione intratracheale di PA/NPSi e come isolare le nanoparticelle nell'effusione pleurica. Questo modello può essere utile per l'ulteriore studio di nanotossicologia e malattie di effusione pleurica.
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Protocol
Lo studio ha seguito le linee guida di Capital Medical University (Beijing, Cina P.R.) per la cura e l'uso di animali da esperimento. Tutte le procedure sono state approvate dalla animale etico Comitato di capitale Medical University in Cina.
1. sperimentale preparazioni
Nota: Acclimatare il femminili ratti Wistar da organismi patogeni specifici (peso: 200 ± 10 g) agli ambienti sperimentali per una settimana prima della somministrazione (condizioni ambientali: luce / buio: 12h / 12h, temperatura 22 ± 2 ° C, umidità 50 ± 10%).
- Utilizzare un fresco 10 mL di PA/NPSi sospensioni (nanosilice Ø:20 ± 5 nm di polimerizzazione in emulsione in situ) diluito in soluzione salina normale alle concentrazioni di 3.125, 6.25 e 12,5 mg/mL, rispettivamente10. Prima della somministrazione, Sonicare le sospensioni per 20-30 min e vortexare per 10 min al fine di impedire l'aggregazione nanoparticelle.
- Ugualmente dividere un totale di 20 ratti in quattro gruppi: un gruppo per ogni concentrazione di PA/NPSi (0, 3.125, 6.25 e 12,5 mg/mL).
- Per anestetizzare li, posizionare i ratti in un contenitore chiuso con 1,5 mL di etere (99,5%) o altri protocolli IACUC approvato. Dopo 60-90 s di anestesia, controllare la mancanza di risposta al riflesso del pedale. Garantire che i ratti sono la respirazione.
- Mettere il ratto anestetizzato sul bordo e difficoltà i suoi denti anteriori con una linea sterilizzata di nylon sulla scheda troppo.
- Aprire la sua bocca ed esporre la sua fenditura della glottide con l'aiuto di un forcipe chirurgico e la lente frontale.
- Infondere i ratti con 0,5 mL di sospensione di PA/NPSi al polmone di ogni ratto per un totale di 1 mL utilizzando un sottile tubo con un ago sterilizzato nel Bronco bilaterale.
- Posizionare i ratti su un bordo di plastica in una posizione supina e lasciare che i ratti di recuperare lentamente in 5-10 min.
2. ecografia per effusione pleurica
- Utilizzare un sistema a ultrasuoni con un array lineare trasduttore (frequenza: 8MHz) per esaminare i ratti su giorni 1, 3, 7 e 1410.
- Dare l'anestesia (10% cloralio idrato, 0,35 mL/100 g, i.p.) ai ratti e verifica per la mancanza di riflessi pedale.
- Rimuovere i peli dall'addome torace e del tronco di ratti utilizzando un rasoio elettrico. Quindi posizionare il ratto su una piastra di montaggio in posizione supina.
- Coprire la pelle con il gel rivestito e quindi posizionare il trasduttore sulla zona sottocostale per rilevare il liquido pleurico e spazio intercostale.
Nota: Al fine di rilevare con precisione l'effusione, la posizioni laterale di destra e sinistra sono state selezionate per eseguire un esame di ultrasuono. - Mettere il topo su un bordo di plastica in una posizione supina dopo l'esame di ultrasuono e lasciare che i ratti di recuperare lentamente in 10 min.
3. cassa CT scansione per effusione pleurica
- Amministrazione post-giorni 7 e 14, anestetizzare i ratti con 10% cloralio idrato (i. p). Considerarlo sufficiente profondità dell'anestesia quando il topo non reagisce ai riflessi del pedale.
Nota: Dopo la somministrazione giorno 7 è il momento più opportuno per osservare l'effusione pleurica di esame di CT. - Posizionare il ratto su un foglio di plastica in posizione prona e poi la scansione del suo petto per indagare l'effusione pleurica utilizzando un Use di CT. 64 canali le seguenti impostazioni: configurazione del rivelatore di 64 x 0,625 mm, 120 kV (picco) e 350 mAs.
4. raccolta di effusione pleurica e l'isolamento delle nanoparticelle nell'effusione pleurica
- Dopo petto CT scansione dei ratti e sotto anestesia di cloralio idrato, controllare il pedale riflesso dei ratti, radersi i capelli dall'addome al petto e poi disinfettare la pelle da iodio.
- Portare i ratti per l'area chirurgica.
- Nell'ambito dell'anestesia, tagliare rapidamente 1-1,5 cm di pelle e muscoli addominali al xifoideo lungo la linea mediana con il diaframma intatto.
- Aprite la cassa e ispezionare le cavità pleuriche bilaterali con l'aiuto di pinzette, soprattutto gli angoli frenici costale bilaterale con cura. Raccogliere 1-2 mL di effusione pleurica giallo-chiaro con una siringa sterile da 2 mL.
- Una volta fatto, sacrificare i ratti con protocollo IACUC approvato.
- Centrifugare il versamento pleurico in una provetta da 2 mL per 15 min a 300 x g per isolare le nanoparticelle.
- Utilizzare una goccia di livello superiore che è il liquido brillante e osservare sotto un microscope(TEM,) elettronico di trasmissione a una tensione di accelerazione di 60-80 kV.
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Representative Results
Non usando un'ecografia toracica, abbiamo trovato nessun effusioni pleuriche il giorno 1 in tutti i gruppi. Tuttavia, il giorno 3, l'effusione pleurica è comparso nei gruppi 6.25 e 12,5 mg/kg∙mL. L'effusione era principalmente nell'angolo di destra costa frenico, mentre l'effusione pericardica presentato solo in 12,5 mg/kg∙mL gruppo. Inoltre, il giorno 7, effusione pleurica (Video 1) sia l'effusione pericardica (Video 2) sono stati rilevati nel gruppo di 6,25 mg/kg∙mL (Figura 1). Effusione pleurica aumentata lentamente nella massima misura possibile, nei giorni 7-10 e poi sono diminuito gradualmente. Il giorno 14, nessun versamento pleurico è stata trovata piu ' ma con il segno di adesione della pleura in tutti i gruppi. 10
Ai giorni 7 e 14, non ci erano segni dell'effusione pleurica 3.125 e 6,25 mg/kg∙mL gruppi di10. Tuttavia, nel gruppo di 12,5 mg/kg∙mL, la scansione TC del torace era anormale con l'angolo smussato costofrenico posteriore, che ha accennato a una piccola quantità di effusione pleurica (Figura 2a, b). Nessun segno del livello fluido fu osservato, che è stato spiegato a causa di una quantità insufficiente di acqua.
Sulla dissezione dei ratti, abbiamo osservato le effusioni di ambra o incolore in 6,25 mg/kg∙mL e gruppi di 12,5 mg/kg∙mL nei giorni 3 e 7. I volumi di effusione pleurica variano da 1-1.8 mL in ogni cavità pleurica in 6,25 mg/kg∙mL e gruppi di 12,5 mg/kg∙mL. Nel gruppo di 3.125 mg/kg∙mL, nessun liquido nella cavità pleurica è comparso nel processo completo sperimentale.
Con il TEM, il NPSi nanoparticelle presentate individualmente e cluster costituito nel liquido pleurico drenato. Il diametro medio (Ø: 20 ± 5 nm) e la morfologia nel liquido pleurico erano costanti con il NPSi nella sospensione preparata. Le nanoparticelle erano per lo più sferica e ben dispersi, e la dimensione media di una nanoparticella individuo era ~ 20 ± 5 nm (Figura 3a, b).
Figura 1 : Immagini rappresentative di effusione pleurica di risultati ecografici il giorno 7. (a, b) Immagini ecografiche da un ratto nel gruppo 3.125 mg/kg∙mL con nessun liquido nella cavità pleurica e pericardica. (c, d) Immagini ecografiche da un ratto nel gruppo di 6,25 mg/kg∙mL con apparente versamento pleurico e pericardico. (e, f) Immagini ecografiche da un ratto nel gruppo di 12,5 mg/kg∙mL con molto più fluido nella cavità pleurica e pericardica. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 . Immagini rappresentative di immagini TAC toraciche in ratti. CT della battuta da un ratto nel gruppo 3.125 mg/kg∙mL senza effusione pleurica (un) con immagine di CT da un ratto nel gruppo 12,5 mg/kg∙mL con un accertamento negativo di liquido libero ma l'angolo smussato costofrenico posteriore nella cavità pleurica (b). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 . Nanoparticelle di silice in sospensione di poliacrilato/nanosilice e l'effusione pleurica di un ratto. (un) nanoparticelle di silice in poliacrilato/silice nanocompositi. (b) nanoparticelle di silice nell'effusione pleurica di un topo con i cluster o forma individuale. Barra della scala: 200 nm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Video 1. L'effusione pleurica in un ratto nel gruppo di 6,25 mg/kg∙mL. Per favore clicca qui per vedere questo video. (Tasto destro per scaricare.)
Video 2. L'effusione pericardica nel ratto nel gruppo di 6,25 mg/kg∙mL. Per favore clicca qui per vedere questo video. (Tasto destro per scaricare.)
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Discussion
L'ecografia è lo strumento più conveniente per la determinazione di malattie polmonari, dovuto la relativa sensibilità eccellente per il liquido libero nella cavità pleurica11. Ecco perché l'ecografia è in grado di rilevare immediatamente il contrasto di impedenza acustica dell'aria e fluidi nei polmoni12. Inoltre, l'ecografia è più flessibile nel modello di un piccolo animale CT. Tuttavia, l'aria nel polmone riflette l'onda sonora e impedito di osservare le modifiche intrapolmonare dopo instillazione di nanoparticelle. Di conseguenza, abbiamo combinato TC del torace e l'ecografia polmonare per indagare i cambiamenti intrapolmonari e liquido pleurico.
Dopo aver esplorato i dati di imaging, abbiamo trovato i risultati di formazione immagini notevole. In primo luogo, il nostro modello ha dimostrato che la PA/NPSi, infatti ha indotto la tossicità insolita, che si è manifestata come il pleurico e l'effusione pericardica nella fase iniziale nel modello del ratto. In secondo luogo, questo modello riprodotto con successo l'avvenimento e lo sviluppo delle effusioni polyserous umano; nel frattempo, questi processi sono stati osservati nei nostri pazienti, che ha presentato con effusione pleurica e pericardica, fibrosi polmonare e granuloma8,9. Così, questi fatti implicarono che la membrana sierosa come la membrana pleurica o la membrana pericardica è stato uno dei bersagli ferita di PA/NPSi, che era di natura simile a quella causata dall'amianto. Inoltre, la sequenza temporale delle effusioni polyserous era significativa come concluso dai nostri risultati.
Per quanto riguarda il design del nostro modello, l'instillazione intratracheale era la fase critica. Questo metodo ha assicurato che la tossicità delle nanoparticelle entrato nel corpo attraverso la trachea, che era differente dal precedente studio13. Tuttavia, gli aspetti negativi di questo metodo erano come segue: il PA/NPSi è stato instillato nel Bronco bilaterale da un sottile tubo, che ha richiesto competenze altamente sperimentale per impedire il danno meccanico per la trachea e la tosse dovuta a causa di sua irritazione. Così, il punto critico era la giusta profondità di instillazione intratracheale. Nel frattempo, mantenere l'anestesia adeguata è stata fondamentale per completare il passaggio di cui sopra.
L'uso di nanoparticelle, le particelle fini di ricerca stanno raccogliendo sempre più attenzione. Più piccolo il diametro delle particelle fini, più impegnativo è per proteggerli. D'altra parte, la nano-silice con un diametro di 20 ± 5 nm infatti richiesto un metodo di preparazione di alta tecnologia per preparare per questo studio, ha causato un aumento in difficoltà con la diminuzione di diametro. Così, uno dei professionisti della nostra tecnica era il diametro del nano-silice, che era più piccola rispetto al precedente studio13,14. Un altro vantaggio di questo studio è stata che abbiamo indotto la nanoparticella via tracheale, piuttosto che di pelle o circolazione13,15,16. Ad esempio, l'esposizione endovenosa noi ostacolata nell'investigare l'organo bersaglio, che era difficile distinguere la lesione dell'organo bersaglio innescato dal danno primario o secondario. Quindi, a nostro parere, l'instillazione intratracheale deve essere il modo migliore per studiare la tossicità delle nanoparticelle dei polmoni nel prossimo futuro. Inoltre, il dosaggio di nanoparticella era inferiore rispetto il precedente studio13, che ha presentato un più alto rapporto di costo-efficacia.
Per quanto riguarda il pleurico e pericardico indotto da PA/NPSi, la reazione di infiammazione e la produzione del sistema reattive dell'ossigeno (ROS) sarebbe la causa di ciò. Abbiamo spiegato come segue: in primo luogo, la nanosilice aumentate concentrazioni di ROS, produzione infiammatoria indotta, ha causato la depolarizzazione mitocondriale e ridotto i livelli del glutatione sia in vivo che in vitro5,6. In secondo luogo, l'infiammazione e la produzione di ROS aumentato il liquido interstiziale nel polmone o permeabilità dei capillari pleurici, che ha promosso la formazione di effusione pleurica alla fine. Inoltre, il danno potenziale del drenaggio linfatico pleurico potrebbe essere coinvolti anche l'accumulo di liquido pleurico. Con più accumulo di liquido pleurico, era aumentato la pressione oncotica, che infine ha indotto la deposizione di PA/NPSi nella cavità pleurica. Questo risultato è stato coerenza con la nostra precedente sperimentazione animale e segnalati pazienti8,10.
Per l'effusione pleurica stessa, era prevalente nella clinica. Tuttavia, molte malattie respiratorie o sistemiche potrebbero causare l'effusione pleurica. Di conseguenza, costruendo un modello animale gioverebbe lo studio eziologico dell'effusione pleurica. Lo studio precedente ha riferito la tossicità polmonare di nanosilice13,17. Tuttavia, i precedenti modelli di effusione pleurica segnalati principalmente focalizzata sui fattori biologici piuttosto che le nanoparticelle18,19. Di conseguenza, il dosaggio di nanoparticella è rimasto un problema aperto. Il nostro modello ha dimostrato che l'effusione pleurica si è verificato il giorno 3 dopo una concentrazione di PA/NPSi di 6,25 mg/kg∙mL è stato somministrato mediante instillazione intratracheale e ha raggiunto nei giorni 7-10. Inoltre, con l'aumento delle concentrazioni di PA/NPSi, l'effusione pleurica più prodotto e più veloce. Inoltre, il nostro modello di effusione pleurica rispetto ai modelli biologici18,19, era efficace e ben controllabile. Per riassumere, il nostro modello sarebbe vantaggioso per gli studi futuri di malattie, effusione pleurica, nonché per quanto riguarda l'ulteriore studio di nanotoxicity in particolare.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Lo studio presente e la produzione di questo articolo sono stati finanziati dalla National Natural Science Foundation of China (Grant 81773373, 81172614 e 81441089 di Grant). Ringraziamo Dr. Jin Yan e Dr. Pan Yujie, del dipartimento di emergenza, Beijing Chaoyang Hospital e Dr. Qu Peng del dipartimento di medicina di ultrasuono, Beijing Chaoyang Hospital per aiutare con la produzione video.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acuson S2000 Color Doppler ultrasound system | Siemens Medical Solutions, Mountain View ,CA | ||
| Polyacrylate/nanosilica | Fudan University,Shanghai, China | made by order with nanosilica(20±5)nm | |
| 10% chloral hydrate | Beijing Chemical Works | 302-17-0 | |
| Light speed 16 spiral computed tomography | GE Healthcare, US | ||
| Specific pathogen-free Wistar | Animal Center of Lianhelihua (Beijing, China) | Wistar rats |
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