Summary
ここでは、ポリアクリル酸/ナノシリカの気管内投与によるラットの胸水貯留モデルを構築するためのプロトコルを提案する.
Abstract
胸水は、多くの肺疾患の一般的な所見です。役に立つ動物胸水モデルは非常にこれらの肺の病気を研究することが重要です。以前の胸水貯留モデルは、環境のナノ粒子ではなく、生物学的要因にもっと注意を払った。ポリアクリル酸/ナノシリカの気管内投与によるラットの胸水と胸水中にナノ粒子分離法をするモデルを紹介します。3.125、6.25、12.5 mg/kg∙mL の濃度のポリアクリル酸/ナノシリカの気管内注入による、6.25 と 12.5 mg/kg∙mL グループの 7-10 日でピークに達し、3 日目に発表したラットにおける胸水ゆっくりと減少し、14 日目で姿を消した。ポリアクリル酸/ナノシリカの濃度の増加、胸水はより生産と高速です。この胸水は、超音波検査、胸部 CT スキャン、ラットの解剖による確認で検出されました。シリカナノ粒子を透過型電子顕微鏡によるラットの胸水認めた。これらの結果は、ポリアクリル酸/ナノシリカに露出が人間で、前のレポートに一貫した胸水の誘導につながることを示した。また、このモデルは乗り越えると胸水貯留疾患のさらなる研究のために有益です。
Introduction
胸水は、さまざまな原因と肺疾患の非常に一般的な臨床症状です。役に立つ動物胸水モデルは非常にこれらの肺の疾患、2 つの胸膜膜層、胸水貯留のメカニズムとその治療の役割を研究することが重要。ただし、いくつかは、環境1,2ナノ粒子ではなく、悪性胸水や生物学的要因を中心に胸水貯留モデル報告。シンプルで安全で効果的な胸水の新しいモデルを紹介します。
ナノテクノロジーの発展といたるの広範な使用は、環境と人間の健康3,4ナノ材料の潜在的な危険についての懸念があります。ナノ材料は、危険因子を紹介し、環境汚染、職場内で新規の危険をもたらす可能性が。In vitro および in vivo の研究を示すナノ材料させる肺、心臓、肝臓、腎臓、神経系、生殖および免疫組織のs5,6に多臓器損傷の可能性があります。また、いくつかの研究は、ナノ材料の特定の毒性は、そのユニークな物理化学的性質3,4,7が原因だったことを報告しました。
我々 はナノ物質に職業的に曝露される労働者のグループが臨床的に胸膜、心嚢液貯留、肺線維症、肉芽腫8,9の発表を報告しています。シリカは、これらの患者の胸水9で分離された.再現し、ひと吸入ナノ粒子による胸水の貯留を確認するために我々 はラットは、本当に人間の呼吸を真似た上気道を介してポリアクリル酸/ナノシリカ (PA/NPSi) を浸透させることにより実験を行った環境とその気管 PA/NPSi の注入がラットで胸水をされる可能性があります。PA/NPSi の気管内投与によるラットで胸水を作る方法および胸水中にナノ粒子を特定する方法をご紹介します。このモデルは、乗り越えると胸水貯留疾患のさらなる研究に役に立つかもしれません。
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Protocol
研究管理と実験動物の使用のための首都医科大学 (北京、中国) のガイドラインに従った。すべてのプロシージャは、動物倫理委員会の首都医科大学中国によって承認されました。
1. 実験準備
注: 順応女性特定病原体フリー wistar 系ラット (重量: 200 ± 10 g) 管理の前に週のための実験環境に (環境条件: 光/暗い: 12 h ・ 12 h、温度 22 ± 2 ° C、湿度 50 ± 10%)。
- 新鮮な 10 mL は 3.125、6.25、それぞれ1012.5 mg/mL の濃度で通常の生理食塩水で希釈した PA/NPSi 懸濁液 (その場で乳化重合によってナノシリカ Ø:20 ± 5 nm) を使用します。管理の前に 20-30 分のための懸濁液および 10 分の渦を超音波ナノ粒子凝集を予防するために。
- 20 ラットの合計で 4 つのグループに均等に分割: PA/NPSi の各濃度を 1 つのグループ (0、3.125、6.25、12.5 mg/mL)。
- それらの麻酔、エーテル (99.5%) の 1.5 mL で密閉容器にラットを配置します。またはその他の承認された IACUC プロトコル。麻酔の 60-90 秒後反射をペダルに反応の欠如を確認します。ラットが呼吸していることを確認します。
- ボード上の麻酔下ラットを置くし、あまりにもボード上のナイロンの滅菌ラインとその前に歯を修正します。
- その口を開き、手術用鉗子と前面のレンズの助けを借りて、声門の割れ目を公開します。
- PA/NPSi 懸濁液 1 mL 滅菌鈍針両側気管支に細い管を使用しての合計は各ラットの肺の 0.5 mL でラットを植え付けます。
- ラットを仰臥させ、ラットを 5-10 分でゆっくりと回復でプラ板に配置します。
2. 超音波検査胸水を
- リニアアレイ探触子で超音波診断装置を使用 (周波数: 8 MHz) 1、3、7、14 日10のラットを調べる。
- 麻酔 (10% 抱水クロラール、0.35 mL/100 g、i. p.) をラットに与えるし、ペダルの反射の欠如を確認します。
- 電気シェーバーを使用してラットの胸部および上腹部から髪を削除します。次に仰臥位に取り付けプレートにラットを置きます。
- コーティングされたゲルで肌をカバーし、肋と胸水を検出する弓下領域に探触子を配置します。
注: 胸水を正確に検出するために左と右ラテラルの位置選択された超音波検査を行います。 - 超音波検査とラットを 10 分でゆっくりと回復後仰臥位のプラ板にラットを置きます。
胸水のスキャン CT 3。
- 7 および 14 日後の管理について 10% 抱水クロラール (i.p) とラットを麻酔します。ラットが反射をペダルに反応しないとき、それは十分な麻酔深度と考慮します。
注: 7 日後管理は ct で胸水を観察する最も適切な時期です。 - 腹臥位のプラスチック シートにラットを配置し、64 ch CT. 使用に次の設定を使用して胸水を調査するその胸をスキャン: 64 × 0.625 mm 検出器構成、120 kV (peak) と 350 Ma。
4. 胸水および胸水中のナノ粒子の分離のコレクション
- 後胸部 CT ラットの下、抱水クロラールの麻酔ラットのペダルの反射をチェック、腹部から胸に髪を剃るし、ヨウ素によって皮膚を消毒します。
- 外科領域にラットをもたらします。
- 麻酔下ですぐに皮膚や腹部の筋肉の 1 〜 1.5 cm をそのままダイアフラム正中線に沿って剣状にカットします。
- 慎重に胸を開き、ピンセット、特に二国間の肋横隔膜角の助けを借りて両側胸膜腔を検査します。2 mL 滅菌注射器と明るい黄色の胸水の 1-2 の mL を収集します。
- 一度完了したら、IACUC 承認プロトコルでラットを犠牲に。
- 300 × gで 15 分の 2 mL チューブに胸水をナノ粒子を分離するために遠心分離機します。
- 明るい液晶である上層のドロップを使用、60-80 kV の加速電圧での伝送電子 microscope(TEM,) の下で観察します。
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Representative Results
胸部超音波を使用して、我々 が見つかりません胸水のすべてのグループの 1 日。しかし、3 日目、胸水は 6.25 と 12.5 mg/kg∙mL グループで登場。胸水は、心嚢のみ 12.5 mg/kg∙mL グループで発表しながら、右肋骨横隔角で主にだった。さらに、7 日に胸水 (ビデオ 1) と心嚢 (動画 2) の両方が 6.25 mg/kg∙mL グループ (図 1) で検出されました。胸水は 7-10 日に最大限に徐々 に増加し、その後徐々 に減少しました。14 日に胸水が見つかりませんでした胸膜の癒着の記号が、もうすべてのグループ。10
7 と 14 日で 3.125 と 6.25 mg で胸水の兆候があった/kg∙mL グループ10。しかし、12.5 mg/kg∙mL グループでは、胸部 CT スキャンだった少量胸水 (図 2a b) を示唆した鈍い後部 costophrenic 角度の異常。流体レベルの兆候がみられない水の不十分な量のために説明されました。
ラットの解剖、時に我々 は 3 と 7 の日に 6.25 mg/kg∙mL と 12.5 mg/kg∙mL グループで黄色または無色の胸水を観察しました。胸水の量は 6.25 mg/kg∙mL と 12.5 mg/kg∙mL グループの各の胸腔内に 1 1.8 mL に異なります。3.125 mg/kg∙mL のグループで胸膜腔内の流体が完全実験の過程で登場ないです。
TEM、個別に提示 NPSi ナノ粒子・ クラスター排水胸水で結成。平均粒径 (Ø: 20 ± 5 nm) と胸水の形態は準備された懸濁液 NPSi と一致しました。ナノ粒子ほとんど球形でよく分散した、個々 のナノ粒子の平均サイズは 20 〜 ± 5 nm (図 3a、b)。
図 1: 7 日目に超音波によって胸水の代表的なイメージです。(a、b)胸膜、心嚢腔のない流体で 3.125 mg/kg∙mL グループのラットからの超音波画像。(c, d)明白な胸水や心嚢液貯留と 6.25 mg/kg∙mL グループのラットからの超音波画像。(e, f)胸膜、心膜腔に多くの流体を 12.5 mg/kg∙mL グループのラットからの超音波画像。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2.ラットの胸部 CT 画像の代表的なイメージです。CT イメージ (、) 胸水と CT 画像無料流体の否定的な発見と 12.5 mg/kg∙mL グループのラットが胸腔内 (b) に鈍い後部 costophrenic 角度から 3.125 mg/kg∙mL グループのラットから。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3.ポリアクリル酸/ナノシリカ懸濁液およびラットの胸水シリカナノ粒子。(、) ポリアクリル酸/シリカナノコンポジットのシリカナノ粒子。(b) クラスターまたは個々 のフォームとラットの胸水のシリカナノ粒子。スケール バー: 200 nm。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
ビデオ 1。6.25 mg/kg∙mL グループのラットにおける胸水。してくださいここをクリックしてこのビデオを表示します。(右クリックしてダウンロード)
ビデオ 2。6.25 mg/kg∙mL グループのラットにおける心嚢。してくださいここをクリックしてこのビデオを表示します。(右クリックしてダウンロード)
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Discussion
超音波検査は呼吸器胸腔内11無料の流体に優れた感度を決定するための最も便利なツールです。超音波検査はすぐに空気や肺12で液体の音響インピー ダンスのコントラストを検出できるためであります。また、超音波検査は CT と比較小動物のモデルをより柔軟それにもかかわらず、肺内の空気は音の波を反映し、ナノ粒子注入後肺の変化を観察することから妨げ。そのため、胸部 CT スキャン ・肺胸水と肺の変化を調査するため超音波を組み合わせてください。
画像データを探索した後我々 は画像処理の結果を顕著な発見します。まず、我々 のモデルを示した PA/NPSi が確かに胸膜、心嚢モデルラットにおける初期の段階で、明らかにされた珍しい毒性を誘発しました。第二に、このモデルは正常に再現発生と人間 polyserous 胸水; 開発一方、これらのプロセスは、胸膜、心嚢液貯留、肺線維症、肉芽腫8,9提示私たちの患者で観察されました。したがって、これらの事実は、胸膜膜や心嚢膜などの漿膜は PA/NPSi のけがターゲットのいずれかでアスベストが原因の 1 つに本質的に類似したでことを示唆しました。また、polyserous 胸水のタイムラインだった私達の調査結果が締結の意味を持つ。
我々 のモデルのデザインは、気管内投与、重要なステップだった。このメソッドは、ナノ粒子の毒性が以前研究13とは異なる、気管を通して体内を入力されていることを確認しました。ただし、このメソッドの短所の通り: PA/NPSi は罰金のチューブは、気管とその刺激による咳に機械的損傷を防ぐために非常に実験的スキルが必要で両側気管支に教え込まれました。したがって、重要なポイントは、気管内投与の適切な深さだった。一方、適切な麻酔を維持することは、前述の手順を完了するのに重大だった。
ナノ粒子の使用は、研究目的のための微粒子より多くの注目を拾っています。細かい粒子の小径、それらを保護するためより挑戦的な。その一方で、20 ± 5 nm の直径を持つシリカは確かに直径の減少の難しさの増加を引き起こし、この研究の準備にハイテク調製法を必要です。したがって、本手法の長所の 1 つは前の研究13,14よりも小さい直径数ナノメートルのシリカ、だった。本研究のもう一つの利点は、皮膚ではなく気管ではナノ粒子または循環13,15,16導出だった。たとえば、静脈内の露出はプライマリまたはセカンダリの損傷によって引き起こされるターゲット器官の損傷を区別するために困難であったターゲット器官の調査に私たちを妨げられます。したがって、我々 の意見で気管内投与は今後の肺のナノ粒子の毒性を調査するための最良の方法になりません。また、ナノ粒子量は以前研究13、高い費用対効果比を提示より低かった。
胸膜・ PA/NPSi による心嚢液は、炎症反応と活性酸素システム (ROS) の生産はそれの原因になります。我々 はそれを次のように説明した: まず、ナノシリカ活性酸素濃度の増加、炎症性生産誘発効果、ミトコンドリア脱分極の原因、両方の生体内および生体外で5,6グルタチオンのレベルを減少します。第二に、炎症、活性酸素の生産は、肺や胸水、端の形成を推進胸膜の毛細血管の透過性の間質液を増加しました。その上、胸膜のリンパ排液の潜在的な障害は、胸水の蓄積に関与する可能性があります。胸水の多くの蓄積、これは最終的に誘起 PA/NPSi 胸膜腔内の堆積膠質浸透圧は増加していた。この結果は、これまでの動物実験に一貫していた、患者8,10を報告します。
胸水自体、クリニックで流行だった。それにもかかわらず、多くの呼吸または全身性疾患胸水の原因。したがって、動物モデルの構築と、胸水の病因研究が利益となります。以前、ナノシリカ13,17の肺毒性の報告。ただし、以前の報告された胸水モデルは主にナノ粒子18,19ではなく、生物学的要因に焦点を当てた。したがって、ナノ粒子量には、未解決の問題が残った。私たちのモデルは、6.25 mg の PA/NPSi 濃度後 3 日目に胸水貯留が発生しました/kg∙mL 気管内投与による投与、7-10 日にピークに達したことを示した。さらに、PA/NPSi、胸水より生産と高速の濃度とともに。よく制御可能な効果的な生物学的モデル18,19に比べ、胸水の私達のモデルはまた、だった。要するに、我々 のモデルは特に nanotoxicity の勉強はさらに胸水貯留疾患の将来の研究のために有益でしょう。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
本研究とこの記事の制作は、中国の国家自然科学基金 (グラント 81773373、81172614 とグラント 81441089) によって賄われました。博士ジン ヤンとの北京朝陽病院、救急部の博士鍋タマと博士ク鵬北京朝陽病院ビデオ制作を助けるため超音波医学部に感謝します
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acuson S2000 Color Doppler ultrasound system | Siemens Medical Solutions, Mountain View ,CA | ||
| Polyacrylate/nanosilica | Fudan University,Shanghai, China | made by order with nanosilica(20±5)nm | |
| 10% chloral hydrate | Beijing Chemical Works | 302-17-0 | |
| Light speed 16 spiral computed tomography | GE Healthcare, US | ||
| Specific pathogen-free Wistar | Animal Center of Lianhelihua (Beijing, China) | Wistar rats |
References
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