Summary
Her presenterer vi en protokoll for å konstruere en pleural effusjon modell i rotter ved intratracheal instillasjon av polyacrylate/nanosilica.
Abstract
Pleural effusjon er en utbredt kliniske funn av mange lungesykdommer. Å ha en nyttig dyr pleural effusjon modell er svært viktig å studere disse lungesykdommer. Tidligere pleural effusjon modeller betalt mer oppmerksomhet til biologiske faktorer i stedet for nanopartikler i miljøet. Her introduserer vi en modell pleural effusjon i rotter ved intratracheal instillasjon av polyacrylate/nanosilica, og en metode for hydrogenion isolasjon i pleural effusjon. Ved intratracheal instillasjon av polyacrylate/nanosilica med konsentrasjoner av 3,125, 6,25 og 12,5 mg/kg∙mL, den pleural effusjon i rotter presentert på dag 3, nådde dager 7-10 i 6,25 og 12,5 mg/kg∙mL grupper, deretter langsomt redusert og forsvant på dag 14. Når konsentrasjonen av polyacrylate/nanosilica økt, er den pleural effusjon produsert mer og raskere. Denne pleural væsken ble oppdaget av ultralyd undersøkelse eller CT brystet skanning og bekreftet av Disseksjon av rotter. Silica nanopartikler ble observert i rottene pleural effusjon av transmission elektron mikroskop. Disse resultatene viste at eksponering polyacrylate/nanosilica fører til induksjon av pleural effusjon, som var i samsvar med vår forrige rapport hos mennesker. I tillegg, er denne modellen gunstig for videre studier av nanotoxicology og pleural effusjon sykdommer.
Introduction
Pleural effusjon er en svært vanlig klinisk manifestasjon av lunge sykdommer med en rekke årsaker. Å ha en nyttig dyr pleural effusjon modell er svært viktig å studere disse lungesykdommer, rollene som to pleural membran lagene, mekanismer for pleural effusjon og dens behandling. Men rapporterte noen pleural effusjon modeller hovedsakelig fokusere på den ondartet pleural effusjon eller biologiske faktorer i stedet for nanopartikler i miljøet1,2. Her introduserer vi en ny modell av pleural effusjon som er enkel, sikker og effektiv.
Med utviklingen av nanoteknologi og utstrakt bruk av nanoproducts er det en bekymring om potensielle farer av nanomaterialer på miljø og helse3,4. Nanomaterialer introdusere risikofaktorer og lede potensielt til romanen farer på arbeidsplassen eller via miljøforurensning. In vitro og in vivo studier viser at nanomaterialer kan resultere i flere organskade til lungene, hjertet, leveren, nyrene og nervesystemet, samt reproduksjons- og immunsystemets5,6. I tillegg rapportert noen studier at bestemte toksisitet av nanomaterialer var på grunn av sin unike mekanisk-egenskaper3,4,7.
Vi har rapportert at en gruppe arbeidere med yrkeseksponering for nanomaterialer klinisk presentert med pleural og perikard effusjon, lunge fibrosis og granulom8,9. Silica nanopartikler ble isolert i disse pasienter pleural effusjon9. For å reprodusere og kontrollere pleural effusjon indusert av inhalert nanopartikler i menneskelig, gjennomført vi eksperimentet av instilling polyacrylate/nanosilica (PA/NPSi) via luftveiene i rotter, som etterlignet menneskelige åndedrett i en ekte miljø, og fant at intratracheal instillasjon av PA/NPSi kan resultere i pleural effusjon i rotter. Her introduserer vi hvordan å gjøre pleural effusjon i rotter ved intratracheal instillasjon av PA/NPSi og hvordan å isolere nanopartikler i pleural effusjon. Denne modellen kan være nyttig for videre studier av nanotoxicology og pleural effusjon sykdommer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Studien fulgte retningslinjene i hovedstaden medisinske universitet (Beijing, PR Kina) og bruk av forsøksdyr. Alle prosedyrer ble godkjent av dyr etiske komité i hovedstaden medisinsk Universitetet i Kina.
1. eksperimentelle forberedelser
Merk: Acclimate kvinnelige bestemt patogen-fri Wistar rotter (vekt: 200 ± 10 g) til eksperimentelle miljøer for en uke før administrasjon (miljøforhold: lys / mørke: 12h / 12h, temperatur 22 ± 2 ° C, luftfuktighet 50 ± 10%).
- Bruk en frisk 10 mL av PA/NPSi suspensjoner (nanosilica Ø:20 ± 5 nm ved i situ emulsjon polymerisering) fortynnet i vanlig saltvann i konsentrasjoner av 3.125 og 6.25 12.5 mg/mL, henholdsvis10. Sonicate av suspensjon i 20-30 minutter og vortex i 10 min før administrasjon, for å hindre nanopartikler aggregering.
- Like deler totalt 20 rotter i fire grupper: en gruppe for hver konsentrasjon av PA/NPSi (0, 3.125, 6.25 og 12,5 mg/mL).
- For å bedøve dem, plassere rotter i en lukket beholder med 1,5 mL Eter (99,5%) eller noen andre IACUC godkjent protokoller. Etter 60-90 s bedøvelse, sjekk for mangelen på respons pedal refleks. Kontroller at rottene puster.
- Sett bedøvet rotta på bordet og fikse sine foran tenner med en sterilisert linje av nylon i styret for.
- Åpne munnen og avsløre sin sprekken av glottis ved hjelp av en kirurgisk tang og frontal linse.
- Innpode rotter med 0,5 mL PA/NPSi suspensjon å hver rotte lunge totalt 1 mL med en fin rør med en stump sterilisert nål i den bilaterale bronchus.
- Plass rotter på en plast bord i en supine posisjon og la rotter gjenopprette sakte i 5-10 min.
2. ultralyd eksamen for pleural effusjon
- Bruke en ultralyd systemet med en lineær array svinger (frekvens: 8 MHz) å undersøke rotter på dager 1, 3, 7 og 1410.
- Gi anestesi (10% chloral hydrat, 0,35 mL/100 g, IP) til rotter og sjekk for mangel på pedalen reflekser.
- Fjerne håret fra rotter bryst og øvre magen med en elektrisk barbermaskin. Plass rotta på en monteringsplate i supine posisjon.
- Dekker huden med belagt gel, og plasser svingeren interkostalrom plass og sirkulerer område å oppdage pleural væsken.
Merk: For å oppdage effusjon nøyaktig, venstre og høyre laterale stillinger ble valgt til å utføre en ultralyd undersøkelse. - Putte rotta på en plast bord i supine posisjon etter ultralyd undersøkelse og la rotter gjenopprette sakte i 10 min.
3. brystet CT skanning for pleural effusjon
- På dager 7 og 14 etter administrasjon, bedøve rotter med 10% chloral hydrat (IP). Anser det tilstrekkelig dybde bedøvelse når rotta ikke reagerer pedal reflekser.
Merk: Dag 7 etter administrasjon er den mest passende tidspunktet å observere pleural effusjon av CT skanning. - Plasser rotta på en plast ark i en utsatt posisjon, og deretter skanne brystet for å undersøke pleural effusjon med en 64-kanals CT. Use følgende innstillinger: 64 x 0.625 mm detektor konfigurasjon, 120 kV (peak), og 350 mAs.
4. innhenting av pleural effusjon og isolering av nanopartikler i pleural effusjon
- Etter brystet CT skanning av rotter og under anestesi av chloral hydrat, sjekk det pedal refleks av rotter, barbere håret fra magen brystet, og deretter rense huden av jod.
- Få rotter til kirurgiske området.
- Under narkose, raskt kutte 1-1,5 cm av huden og magemusklene til xiphoid langs midtlinjen med intakt mellomgulvet.
- Nøye åpne brystet og inspisere bilaterale pleural hulrom ved hjelp av pinsett, spesielt de bilaterale kyst phrenic vinklene. Samle 1-2 mL lys gul pleural effusjon med en 2 mL steril sprøyte.
- Når gjort, ofre rotter med IACUC godkjent protokollen.
- Sentrifuge pleural effusjon i en 2 mL tube i 15 min på 300 x g for å isolere nanopartikler.
- Bruk en dråpe øvre laget som er lyse væsken og observere under en overføring elektron microscope(TEM,) med en akselererende spenning på 60-80 kV.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bruker en bryst ultralyd, fant vi ingen pleural effusions på dag 1 i alle grupper. Men på dag 3, pleural effusjon dukket opp i 6,25 og 12,5 mg/kg∙mL grupper. Effusjon var hovedsakelig i høyre kyst phrenic vinkelen, mens den perikard effusjon bare presentert i 12.5 mg/kg∙mL-gruppen. Videre, på dagen 7, både pleural effusjon (Video 1) og perikard effusjon (Video 2) ble oppdaget i 6,25 mg/kg∙mL gruppe (figur 1). Pleural effusjon økt sakte i størst grad på 7-10 dager og deretter reduseres gradvis. På dag 14 fant ingen pleural effusjon lenger, men med tegnet av vedheft av pleura i alle grupper. 10
På dager 7 og 14, det var ingen tegn til den pleural effusjon i 3,125 og 6,25 mg/kg∙mL grupper10. Men i gruppen 12.5 mg/kg∙mL var brystet CT skanning unormale med sløv bakre costophrenic vinkel, som antydet en liten mengde pleural effusjon (figur 2a, b). Ingen tegn på væske nivå ble observert, som ble forklart på grunn av en tilstrekkelig mengde vann.
På Disseksjon av rotter observerte vi gult eller fargeløs effusions i 6,25 mg/kg∙mL og 12,5 mg/kg∙mL grupper på dager 3 og 7. Volum av pleural effusjon varierer fra 1-1.8 mL i hver pleural hulrom i 6,25 mg/kg∙mL og 12,5 mg/kg∙mL grupper. I gruppen av 3,125 mg/kg∙mL, ingen væske i pleural cavities dukket opp i full eksperimentelle prosessen.
Med TEM, NPSi nanopartikler presentert individuelt og klynger dannet i drenert pleural væske. Gjennomsnittlig diameter (Ø: 20 ± 5 nm) og morfologi i pleural væske var i samsvar med NPSi i forberedt suspensjon. Nanopartikler var mest sfærisk og godt spredt, og den gjennomsnittlige størrelsen på en individuell hydrogenion var ~ 20 ± 5 nm (Figur 3a, b).
Figur 1 : Representant bilder av pleural effusjon av sonographic funn på dag 7. (a, b) Sonographic bilder fra en rotte i gruppen 3,125 mg/kg∙mL med ingen væske i pleural og perikard hulrom. (c, d) Sonographic bilder fra en rotte i gruppen 6,25 mg/kg∙mL med tilsynelatende pleural effusjon og perikard effusjon. (e, f) Sonographic bilder fra en rotte i gruppen 12.5 mg/kg∙mL med mye mer væske i pleural og perikard hulrom. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 . Representant bilder av thorax CT-bildene i rotter. CT bilde fra en rotte i gruppen for 3,125 mg/kg∙mL uten pleural effusjon (en) og CT-bilde fra en rotte i gruppen for 12.5 mg/kg∙mL med et negativt funn gratis væske men sløv bakre costophrenic vinkelen i pleural hulrom (b). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 . Silica nanopartikler i polyacrylate/nanosilica suspensjon og pleural effusjon av rotte. (en) Silica nanopartikler i polyacrylate/silica nanocomposite. (b) Silica nanopartikler i en rottes pleural effusjon med klynger eller personlige form. Skala bar: 200 nm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Video 1. Den pleural effusjon i rotte i gruppen 6,25 mg/kg∙mL. Vennligst klikk her å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)
Video 2. Perikard effusjon i rotte i gruppen 6,25 mg/kg∙mL. Vennligst klikk her å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sonography er det mest praktiske verktøyet for å bestemme lungesykdommer, på grunn av sin utmerkede følsomhet til gratis væsken i pleural hulrom11. Det er fordi sonography kan umiddelbart oppdage kontrasten i akustisk impedans av luft og væske i lungene12. Dessuten er sonography mer fleksible i en liten dyr modell enn CT. Likevel luften i lungene reflektert lydbølge og forhindret fra å observere intrapulmonary endringer etter nanopartikler instillasjon. Derfor kombinert vi brystet CT og lunge sonography å undersøke intrapulmonary endringene og pleural væsken.
Etter utforsking bildebehandling data, fant vi tenkelig resultatene bemerkelsesverdig. Først viste vår modell at PA/NPSi, faktisk indusert uvanlig toksisitet, som ble åpenbart i pleural og perikard effusjon på et tidlig stadium i rotte modell. For det andre, denne modellen er gjengitt forekomsten og utvikling av menneskelige polyserous effusions; i mellomtiden ble disse prosessene observert i våre pasienter, som presenterte med pleural og perikard effusjon, lunge fibrosis og granulom8,9. Dermed underforstått disse fakta at serous membranen som pleural membranen eller perikard membranen var en av skade mål for PA/NPSi, som var lik den som forårsaket av asbest i naturen. Også var tidslinjen i polyserous effusions meningsfylt som avsluttet av våre funn.
Som for utformingen av vår modell var intratracheal instillasjon kritisk trinn. Denne metoden sikrer at giftigheten av hydrogenion inn i kroppen gjennom det tracheal, som var forskjellig fra den tidligere studie13. Men ulempene med denne metoden var som følger: PA/NPSi ble innpodet i bilaterale bronchus av fine røret, som krevde svært eksperimentelle ferdigheter for å unngå mekaniske skader luftrøret og hoste skyldes dens irritasjon. Dermed var det kritiske punktet intratracheal instillasjon riktig dybde. Samtidig opprettholde riktig anestesi var avgjørende for å fullføre de nevnte trinnet.
Bruk av nanopartikler, fine partikler for å forskning er å plukke opp mer og mer oppmerksomhet. Mindre diameteren på de fine partiklene, mer utfordrende det er å beskytte seg. På den annen side, nødvendig nano-silica med en diameter på 20 ± 5 nm faktisk en høyteknologisk forberedelse metode for å forberede denne studien forårsaket en økning i problemer med nedgangen i diameter. Dermed var en av proffene våre teknikk diameteren på nano-silika, som var mindre enn den tidligere studie13,14. En annen fordel med denne studien var at vi indusert hydrogenion via tracheal ikke hud eller sirkulasjon13,15,16. For eksempel hindret intravenøs eksponering oss i gransker målet organ, som var vanskelig å skille skaden av målet orgelet utløst av primær eller sekundær skadene. Dermed, etter vår mening intratracheal instillasjon skal være den beste måten å undersøke hydrogenion toksisitet av lungene i kommende fremtid. Dessuten var dosering av hydrogenion lavere enn tidligere studie13, som presenterte en høyere kostnadseffektivitet ratio.
Den pleural og perikard effusjon indusert av PA/NPSi, ville betennelse reaksjon og produksjon av reaktive oksygen system (ROS) være årsaken til at. Vi forklarte det slik: først nanosilica økt ROS konsentrasjoner, indusert inflammatorisk produksjon, forårsaket mitokondrie depolarization og redusert glutation nivåer både i vivo og in vitro5,6. Dernest økt betennelse og produksjon av ROS interstitiell væske i lungene eller permeabilitet av pleural kapillærene, som fremmet dannelsen av pleural effusjon på slutten. Dessuten, den potensielle svekkelse av pleural lymfedrenasje kan også være involvert i akkumulering av pleural væsken. Med flere opphopning av pleural væske, hadde oncotic trykket økt, som bestemt avsetning av PA/NPSi i pleural hulrom. Dette resultatet var i samsvar med våre tidligere dyreforsøk og rapportert pasienter8,10.
Den pleural effusjon selv var det utbredt i klinikken. Likevel, mange luftveiene eller systemiske sykdommer kan forårsake pleural effusjon. Derfor ha lage en dyremodell nytte paranoid studiet av pleural effusjon. Den tidligere studien rapporterte lunge toksisitet nanosilica13,17. Men tidligere rapporterte pleural effusjon modeller hovedsakelig fokusert på biologiske faktorer i stedet for nanopartikler18,19. Derfor forble dosering av hydrogenion et uløst problem. Vår modell viste at pleural effusjon oppstod på dag 3 etter en PA/NPSi konsentrasjon av 6,25 mg/kg∙mL ble administrert av intratracheal instillasjon og nådde på 7-10 dager. Videre med økende konsentrasjoner av PA/NPSi, den pleural effusjon produsert mer og raskere. Videre var sammenlignet med biologiske modeller18,19, vår modell av pleural effusjon godt kontrollerbare og effektiv. For å oppsummere, ville vår modell være gunstig for framtidige studier av pleural effusjon sykdommer, samt for videre studier av nanotoxicity spesielt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Denne studien og produksjon denne artikkelen ble finansiert av National Natural Science Foundation of China (Grant 81773373, 81172614 og Grant 81441089). Vi takker Dr. Jin Yan og Dr. Pan Yujie, avdeling av unntakstilstand, Beijing Chaoyang Hospital, og Dr. Qu Peng av avdeling av ultralyd medisin, Beijing Chaoyang sykehus for å hjelpe med video produksjon.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acuson S2000 Color Doppler ultrasound system | Siemens Medical Solutions, Mountain View ,CA | ||
| Polyacrylate/nanosilica | Fudan University,Shanghai, China | made by order with nanosilica(20±5)nm | |
| 10% chloral hydrate | Beijing Chemical Works | 302-17-0 | |
| Light speed 16 spiral computed tomography | GE Healthcare, US | ||
| Specific pathogen-free Wistar | Animal Center of Lianhelihua (Beijing, China) | Wistar rats |
References
- Stathopoulos, G. T., et al. Nuclear factor-kappaB affects tumor progression in a mouse model of malignant pleural effusion. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 34 (2), 142-150 (2006).
- Shen, J., et al. The dosage-toxicity-efficacy relationship of kansui and licorice in malignant pleural effusion rats based on factor analysis. Journal of Ethnopharmacology. 186, 251-256 (2016).
- Nel, A., Xia, T., Mädler, L., Li, N. Toxic potential of materials at the nanolevel. Science. 311 (5761), 622-627 (2006).
- Maynard, A. D., et al.
- Duan, J., et al. Toxic effects of silica nanoparticles on zebrafish embryos and larvae. PLoS One. 8 (9), 74606 (2013).
- Skuland, T., Ovrevik, J., Låg, M., Schwarze, P., Refsnes, M. Silica nanoparticles induce cytokine responses in lung epithelial cells through activation of a p38/TACE/TGF-α/EGFR-pathway and NF-κΒ signaling. Toxicology and Applied Pharmacology. 279 (1), 76-86 (2014).
- Oberdörster, G., Oberdörster, E., Oberdörster, J. Nanotoxicology: an emerging discipline evolving from studies of ultrafine particles. Environmental Health Perspectives. 113 (7), 823-839 (2005).
- Song, Y., Li, X., Du, X. Exposure to nanoparticles is related to pleural effusion, pulmonary fibrosis and granuloma. European Respiratory Journal. 34 (3), 559-567 (2009).
- Song, Y., et al. Nanomaterials in humans: identification, characteristics, and potential damage. Toxicologic Pathology. 39 (5), 841-849 (2011).
- Zhu, X., et al. Polyacrylate/nanosilica causes pleural and pericardial effusion, and pulmonary fibrosis and granuloma in rats similar to those observed in exposed workers. International Journal of Nanomedicine. 11, 1593-1605 (2016).
- Havelock, T., et al. Pleural procedures and thoracic ultrasound: British Thoracic Society Pleural Disease Guideline 2010. Thorax. 65, Suppl 2 61-76 (2010).
- Jha, A., Ullah, E., Gupta, P., Gupta, G., Saud, M. Sonography of multifocal hydatidosis involving lung and liver in a female child. Journal of Medical Ultrasound. 40 (4), 471-474 (2013).
- Hikaru, N., et al. Histological analysis of 70-nm silica particles-induced chronic toxicity in rats. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 72, 626-629 (2009).
- Sun, L., et al. Cytotoxicity and mitochondrial damage caused by silica nanoparticles. Toxicology in Vitro. 25, 1619-1629 (2011).
- Hikaru, N., et al.
- Liu, T. I., et al. Single and repeated dose toxicity of mesoporous hollow silica nanoparticles in intravenously exposed mice. Biomaterials. 32, 1657-1668 (2011).
- Ding, M., et al. Diseases caused by silica: Mechanisms of injury and disease development. International Immunopharmacology. 2, 173-182 (2002).
- Shen, J., et al. The dosage-toxicity-efficacy relationship of kansui and licorice in malignant pleural effusion rats based on factor analysis. Journal of Ethnopharmacology. 186, 251-256 (2016).
- Ji, J. H., et al. Twenty-eight-day inhalation toxicity study of silver nanoparticles in Sprague-Dawley rats. Inhalation Toxicology. 19 (10), 857-871 (2007).
