Summary
وهنا يقدم تقنية حقن intrathecal مباشرة باستخدام 1% ليدوكائين هيدروكلوريد في حل فيروسية لضمان تسليم الفيروسات الكفاءة المرتبطة بالغدد للحيوانات الصغيرة، وإنشاء نظام لتسجيل النقاط للتنبؤ بكفاءة توصيل في وسط الجهاز العصبي وفقا لدرجة ضعف عابرة الناجمة عن ليدوكائين.
Abstract
حقن Intrathecal (IT) من الفيروسات المرتبطة بالغدة (إف) لفت اهتمام كبير في العلاج الجيني CNS حكم السلامة، نونينفاسيفينيس، وكفاءة توصيل ممتازة في الجهاز العصبي المركزي. أظهرت الدراسات السابقة فاعلية علاجية للعلاج الجيني تسليم إف في اضطرابات الأعصاب به الإدارة. ومع ذلك، سجلت معدلات عالية من الفشل لا يمكن التنبؤ بها بسبب التقادم التقني لإدارة تكنولوجيا المعلومات في الحيوانات الصغيرة. هنا، قمنا بإنشاء نظام لتسجيل النقاط للإشارة إلى مدى نجاح البزل القطني في الحيوانات الصغيرة عن طريق إضافة 1% ليدوكائين هيدروكلوريد في حقن المحلول. نعرض كذلك أنه يمكن التنبؤ بمدى ضعف عابرة بعد حقن كفاءة توصيل إف. وهكذا، يمكن استخدام هذا الأسلوب أنه حقن لتحسين التجارب العلاجية في نماذج الماوس من أمراض الجهاز العصبي المركزي التي تصيب مناطق واسعة من الجهاز العصبي المركزي.
Introduction
إف يمكن التوسط في التعبير الجيني طويلة الأجل وواسعة النطاق في توصيل الجهاز العصبي المركزي مع عدد قليل من الآثار الجانبية، ولذلك أصبحت واحدة من السيارات الأكثر تبشيرا بالنجاح للعلاج الجيني لعلاج أمراض الجهاز العصبي المركزي بما في ذلك التصلب العضلي الجانبي (المرض)، هنتنغتون المرض (HD) ومرض الزهايمر (AD)، وأمراض التخزين الليزوزومية (LSD)، المرض Gaucher (المدير العام)، والخلايا العصبية سيرويد ليبوفوسسينوسيس (نكل)1. حاليا، أكثر من 100 إف اللقاح تم عزلها من البشر والحيوانات. ومن بين هذه استخدمت على الأقل 12 في السريرية والتجارب السريرية، بما في ذلك الأكثر شيوعاً استخدام ناقلات الجينات مثل AAV1، 2، 4، 5، 6، 8، 9، rAAVrh.8، و rAAVrh.101،2،3،4، 5،6.
أمراض الجهاز العصبي المركزي مختلفة تتطلب استراتيجيات تسليم إف مختلفة نظراً لمختلف المناطق المتضررة في الجهاز العصبي المركزي وأنواع الخلايا. مناطق الجهاز العصبي المركزي وخلية الأنواع التي يمكن ترانسدوسي إف يختلف تبعاً للنمط المصلي المسيطر فضلا عن طريقة التسليم. على سبيل المثال، قد تبين rAAVrh10 ترانسدوسي الغالب astrocytes عندما ألقي بالحقن الوريدية الجهازية (الرابع)، في حين أنها ترانسدوسيد كل من الخلايا العصبية وإطلاق عندما ألقي بحقن intrathecal4،7. بالإضافة إلى ذلك، أدى حقن حمة توصيل المحلية للمناطق المحيطة بموقع الحقن، بينما أدى حقن في السائل الدماغي النخاعي (CSF) عن طريق داخل البطيني أو حقن intrathecal توصيل الجهاز العصبي المركزي على نطاق واسع8 . كما أظهرت الدراسات العلاجية فاعلية العلاج الجيني تسليم إف في اضطرابات الأعصاب بأنه الإدارة9،،من1011. في الأمراض التي تؤثر على مجالات واسعة للجهاز العصبي المركزي مثل المرض، أظهر حقن intrathecal في إطار الخدمات القطرية لتغطية معظم المناطق التي تعاني من المرض بجرعة أقل، مقارنة4،أسلوب تسليم الجهازية10. كما أظهرت الدراسات الأخيرة أن البزل القطني يمكن استخدامها لحقن إف في نماذج الماوس للمرض، الذي يتجنب الإصابات المحتملة المرتبطة بالصفيحة و intrathecal قسطرة4.
كان أول من استخدم البزل القطني المباشرة التجريبية لتسليم الوكلاء، لا سيما من المسكنات، إلى الحبل الشوكي للتسكين والتخدير في عام 188512،13. في هذا التقرير، نحن توضيح الثقب القطني هو حقن الأسلوب في الفئران الكبار مع المعونة من 1% ليدوكائين هيدروكلوريد، مخدر المستمدة من أميد محلية، في الحل الحقن لتقييم ورصد جودة الحقن. الحقن ناجحة اتسمت بالشلل عابر المستحثة ليدوكائين، بينما فشل الحقن لم تظهر هذا السلوك. نحن تصنيف مستوى ضعف عابرة كواحدة من خمس درجات للمساعدة في التنبؤ بكفاءة الحقن. وأخيراً، نحن إظهار أنه قد يمكن التنبؤ بمستوى توصيل rAAVrh10 بدرجة الشلل. ولذلك، يمكن استخدام هذا الأسلوب تسليم إف إينتراثيكال لتعزيز إيصال الجين إف بوساطة للعلاج التجريبي من أمراض الجهاز العصبي المركزي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
كانت ولدت الفئران ففب/نيو جيرسي في منشأة الحيوان من "المختبرات الرئيسية للأعصاب خبي". جميع الماوس التجارب كانت وافقت "المستشفى من خبي الطبية جامعة أخلاقيات اللجنة الثانية" ونفذت وفقا للوائح إدارة الحيوانات المختبرية أصدرت وزارة العلوم والتكنولوجيا في الجمهورية الشعبية الصين.
1-إعداد 20% ليدوكائين هيدروكلوريد الأسهم الحل
- وزن 2 غ ليدوكائين هيدروكلوريد. إضافة 5 – 6 مل من الماء المعقم ودوامه بلطف. زيادة مستوى الصوت إلى ما مجموعة 10 مل بالماء المعقم.
- 1.2 تصفية الحل الأسهم من خلال مرشحات 0.2 ميكرون. قاسمة الحل الأسهم، 1 مل كل 1.5 مل ميكروسينتريفوجي الأنبوبة، وختم ذلك بفيلم ختم. مخزن في 4 درجات مئوية.
2-إف Intrathecal التسليم المباشر في الفئران مستيقظا
- مسح مساحة العمل باستخدام شاش معقم مع الإيثانول 70% وإعداد اللوازم المطلوبة كما ورد في الجدول 1.
- إعداد 100 ميليلتر AAVrh.10/1% ليدوكائين هيدروكلوريد المعقدة عن طريق إضافة ميليلتر 95 حل الأسهم rAAVrh10 (5 × 1012 الجينوم نسخ/mL) في أنبوب ميكروسينتريفوجي ميليلتر 200 عقيمة، وإضافة 5 ميليلتر من 20% ليدوكائين هيدروكلوريد الأسهم الحل. مزيج جيد من قبل بيبيتينج صعودا وهبوطاً. ثم تخزين الفيروسات الحل على الجليد (4 درجات مئوية).
ملاحظة: سيتم استخدام ميليلتر 8 كل الماوس4 . -
إعداد المحاقن مع الحل إف لحقن
- تجميع من 25 ميليلتر هاملتون المحاقن بإبرة ز 27 ومحاذاة طرف مشطوف الإبرة مع حجم الحجمي في المحاقن.
- رسم ميليلتر 8 4 × 1010 الجينوم نسخاً من الفيروسات الحل في المحاقن بلطف. تأكد من إزالة فقاعات الهواء.
-
إعداد الماوس
ملاحظة: الذكور أو الإناث من الفئران ففب/نيو جيرسي (30 – 70 يوما) واستخدمت في هذه الدراسة. تم تشغيل تكنولوجيا الحقن في غطاء محرك السيارة.- تعقيم منطقة العمل في غطاء مع الإيثانول 70%. وضع الماوس مستيقظا (ذكرا كان أو أنثى، 30 – 70 يوما القديمة، 13 – 20 غ الوزن) في بيدبيسي في موقف معرضة في غطاء محرك السيارة. تغطية الجزء العلوي من الجسم مع شاش معقم لتهدئة الماوس وتجنب الملدوغ.
- إصلاح الحيوان التي تجتاح على نحو ملائم وراسخا على بحزام الحوض مع إبهام على إصبع السبابة الأوسط والجانب واحد على الجانب الآخر. الحفاظ على الجلد بين الثنائية الحزام الحوضي مشدود مع الإبهام والسبابة. اضغط برفق على الجزء العلوي من الجسم للحيوان مع النخيل.
- يحلق الفراء على ظهرها بين الحزام الحوضي الثنائية، ثم تعقيم سطح الجلد مع إيثانول فرك و 70% على أساس يوديد.
-
حقن Intrathecal12
- يشعر المسافة الفقرية على طول الخط الأوسط بين الحزام الحوضي الثنائية مع الإبهام أو السبابة في اليد الأخرى واضغط المسافة بادئة مع ظفر للإشارة إلى المسافة L5-L6 الفقرية (تحديد موقع الحقن).
- تدوير قاعدة الذيل قليلاً لطف للإشارة إلى خط الوسط للعمود الفقري. ضبط الإبرة المجسم مشطوف الحواف نحو رأس الحيوان قبل الحقن (المذكور في الخطوة 2.3.1).
- تأكد من أن الحيوانات ثابتة بثبات ومحاذاة الإبرة على طول خط الوسط للعمود الفقري.
- أدخل الإبرة برفق وعمودياً (أو إمالة قليلاً من 70-80 درجة مئوية) في تقاطع المسافة البادئة وإبقاء المحاقن في طائرة السهمي مركزية. تقليل الزاوية إلى حوالي 30 درجة ببطء عند اتصاله العظام، ثم تنزلق الإبرة إلى الفضاء الفقرية.
ملاحظة: نفض الغبار ذيل مفاجئ واضحا علامة النجاح في دخول الفضاء إينترادورال. بمجرد دخول الإبرة مساحة الفقرية، سوف يشعر نصيحة إبرة فرضت بشدة. ز 27 الإبرة المستخدمة في هذه الدراسة هي مناسبة لإيصال تكنولوجيا المعلومات في الفئران ولكن لا الفئران. - حقن الحل مكافحة ناقلات (المذكورة في الخطوة 2، 2). بدء تشغيل جهاز ضبط الوقت وحقن ميليلتر 8 الحل ناقل بسرعة 1 ميليلتر/4 س الاحتفاظ إبرة تقريبا 1 دقيقة بعد الانتهاء من تسليم. سحب الإبرة مع تناوب لطيف لتجنب تسرب.
- نقاط ضعف عابرة للفأرة أطرافه فورا بعد الولادة لتقييم نوعية الحقن4.
ملاحظة: المعيار كما يلي4. نقاط 0: لا ضعف؛ نقاط 1: قاصر ضعف أطرافه هند دون شذوذ مشيه؛ نقاط 2: معتدلة ضعف أطرافه هند مع شذوذ مشيه واضحة؛ نقاط 3: استكمال شلل أطرافه هند؛ 4 نقاط: الانتهاء من شلل أطرافه هند، وضيق في التنفس، وضعف معتدل من أطرافه الصدارة؛ ونقاط 5: إتمام الشلل في جميع أطرافه الأربعة، ويتضح ضيق في التنفس. - حرك الماوس مرة أخرى إلى القفص للشفاء من الشلل.
-
تنظيف
- مسح المحاقن مع 1 مل من الماء المعقم. فرز اللوازم المختبرية وجمع جميع المواد غير المتاح للتعقيم يعقم. تنظيف مقاعد البدلاء مع الإيثانول 70%.
3-الأنسجة التحضير لتلطيخ المناعي
-
جمع الأنسجة
- تخدير الفئران في حقن بعد 21 يوما مع 3% كلورال هيدرات (0.1 مل/10 غرام) عميق بالحقن داخل.
- نتخلل ترانسكارديالي مع 20 مل من المثلج 0.01 متر PBS (كلوريد الصوديوم 147 مم؛ نة2بو4 1.9 مم؛ ك2هبو4 8.1 ملم، ودرجة الحموضة 7.4) أولاً، ثم 4% المثلج بارافورمالدهيد (في برنامج تلفزيوني 0.01 M) مع مضخة (10 مل/دقيقة لمدة 1 دقيقة، ثم 5 مل/دقيقة بدقيقة 9).
تنبيه: بارافورمالدهيد السرطنة، والسمية. التعامل معها إلا في غطاء الدخان أثناء ارتداء القفازات.
-
تشريح المخ والحبل الشوكي
- إصلاح على أطرافه ورأسه كل حيوان في موضع عرضه على غطاء مربع رغوة مع إبر المحاقن، ثم تجريد وإزالة الجلد من الرأس إلى عجز مع المقص.
- مقطع الجمجمة بين العينين، وقطع جنبا إلى جنب مع الطريق الأوسط من الجمجمة وخط أفقي عند المخيخ، ثم فتح الجمجمة لكل جانب.
- رفع عظم قذالي مع ملاقط وفتح القناة الفقرية ثنائيا مع مقص العيون. قطع الأضلاع على الجانبين وإزالة النصف العلوي من فقرات بعناية.
- رفع الدماغ مع منحنى ملاقط وقطع أعصاب قاعدة الجمجمة، ثم تشريح كامل الدماغ والحبل الشوكي بعناية. بعد إصلاح الأنسجة في بارافورمالدهيد 4% عن 24 ساعة.
-
إعداد شرائح الأنسجة
- كريوبروتيكت المخ والحبل الشوكي العنقي والقطني في محلول السكروز 30% بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. تضمين الأنسجة في قطع الأمثل درجة الحرارة (OCT) مركب وتجميد سريع مع النتروجين السائل.
- قطع الأنسجة في 25 ميكرومتر كريوستات استخدام وتخزين المقاطع المجمدة في برنامج تلفزيوني 0.01 متر في 4 درجات مئوية للاستخدام.
4-إيمونوهيستوتشيميستري
- بريتريت أبواب التعويم الحر في % 1 ح2س2 لمدة 10 دقائق، ثم غسل في برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقيقة إينكوباتي في حل حظر المحتوية على مصل 5% والمنظفات غير الأيونية 0.3% في برنامج تلفزيوني عن ح 1.
- احتضان الشرائح مع الأجسام المضادة الأولية المقابلة بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. أغسل المقاطع في ببست (0.2% 20 توين في برنامج تلفزيوني) لمدة 30 دقيقة (3 مرات لكل 10 دقائق).
- احتضان الشرائح مع جسم البيوتين-الثانوية المقابلة في درجة حرارة الغرفة ل 1 حاء – المياه والصرف الصحي في ببست مدة 30 دقيقة (3 مرات لكل 10 دقائق).
- احتضان الفروع مع تقارب البيوتين البيروكسيديز معقدة لمدة 40 دقيقة، ووصمة عار مع وكيل أتشروموجينيك. تحميل المقاطع على الشرائح وجاف بشكل صحيح.
- نقع الشرائح في الإيثانول اللامائى لمدة 5 دقائق وزيلين نفط لمدة 10 دقائق، ثم ختم الشرائح مع وسيلة متزايدة. وأخيراً، صورة الشرائح مع مجهر مزودة جهاز اقتران (اتفاقية مكافحة التصحر) في 100 x و 200 x و 400 x تكبير.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وأظهرت الفئران درجات مختلفة من الضعف عابر الحق بعد ذلك حقن إف الحل في 1% ليدوكائين هيدروكلوريد نظراً لنوعية مختلفة من حقن intrathecal. وفقا لشبه كمي نظام التهديف الصف 5 وقد أنشأنا، اختبرنا أنماط توصيل إف في الفئران بدرجات مختلفة من الضعف الناجم عن ليدوكائين أطرافهم (نقاط 0، ن = 2؛ ونقاط 1، n = 1؛ ونقاط 4، ن = 4؛ ونقاط 5، n = 3). أظهرت immunostaining اجفب من الحبال الشوكي أما لا يوجد أو قليل توصيل في الحبل الشوكي القطني من الفئران التهديف 0 وتوصيل زيادة طفيفة في الفئران التهديف 1 وترانسدوكشنز قوية وواسعة النطاق في الفئران التهديف 4 أو 5 (الشكل 1أ). نحن كمياً التجارة والنقل تلطيخ كثافة الفئران تلك عرض درجات مختلفة من الضعف أطرافهم عابرة (الشكل 1ب) وخلصت إلى أن شدة الضعف بعد حقن يرتبط ارتباطاً وثيقا بمدى الحبل الشوكي توصيل.
ونحن كذلك استكشاف الشخصية توصيل مفصلة من rAAVrh10 في الجهاز العصبي المركزي كاملة، ولاحظت أن كامل طول الحبل الشوكي ومناطق واسعة من الدماغ كان جيدا ترانسدوسيد جيدا حقن الفئران التي سجلت 4 أو 5. في الدماغ، وتم اكتشاف إشارات اجفب قوية في شمي لمبة (الشكل 2أ) وقشرة dorsolateral prefrontal (الشكل 2ب)، المغزلي المسنن ومنطقة CA3 الحصين (الأرقام 2 و 2D)، الدماغ قشرة (الشكل 2ه)، والمناطق الهامشية للدماغ بما في ذلك نواة الوجه (الشكل 2و) والضفيرة شرويد ependymal الخلايا الظهارية (الشكل 2ز). ومع ذلك، تم الكشف عن خلايا اجفب إيجابية أقل في المناطق العميقة من الدماغ. في الحبل الشوكي والأبواق البطني والظهريه، كانت محاور عصبية المحرك النفايات السائلة البطني ومحاور عصبية حسية ثراء الظهرية بشدة الحاملات للتجارة والنقل. وقد ترانسدوسيد الخلايا العصبية الحركية في القرون الأمامية بشدة في مستويات مختلفة من النخاع الشوكي (الأرقام ح 2-2J). وعلاوة على ذلك، تم الكشف عن بروتينات فلورية خضراء-إيجابية الخلايا العصبية في القشرة بما في ذلك الخلايا الهرمية (الأرقام 3A و 3 باء). كما عثر على مختلف أنواع الخلايا الدبقية بما في ذلك ميكروجليا، أستروسيتيس، وأوليجوديندروسيتيس، اجفب نقص المناعة (أرقام ج 3-3E).
الشكل 1 : مدى الضعف الناجم عن ليدوكائين يتنبأ كفاءة توصيل. تم حقن إف مع يدوكائين 1% أو برنامج تلفزيوني (تحكم) بالحقن المباشر لتكنولوجيا المعلومات. الفئران كانت التضحية ونظرت لتعبير بروتينات فلورية خضراء إيمونوهيستوتشيميستري بعد 3 أسابيع (نقاط 0, n = 2؛ ونقاط 1، n = 1؛ ونقاط 4، ن = 4؛ ونقاط 5، ن = 3). (A) بروتينات فلورية خضراء تلطيخ أقسام النخاع الشوكي القطني (المهارات) وسرطان عنق الرحم (CSC) ويرد. (ب) بروتينات فلورية خضراء تلطيخ كثافة في المهارات وديوان الخدمة المدنية على حد سواء كانت مرتبطة ارتباطاً مباشرا مع درجة ضعف عابرة. وتمثل كل علامة القيم (يعني ± التنمية المستدامة) من ماوس واحدة. وهذا الرقم تم تكييف من منشور سابق4. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : توصيل واسع النطاق من rAAVrh10 في المخ والحبل الشوكي. لمبة شمي (A)؛ قشرة (ب)؛ (ج) المغزلي المسنن4؛ و CA3 (د) الحصين؛ قشرة الدماغ (ه)؛ (و) نواة الوجه؛ (ز) البطين الجانبي؛ (ح) عنق الرحم القرن الأمامي4؛ (أنا) القرن الأمامي والصدر4؛ و (ي) القرن الأمامي القطنية4. تغيير حجم أشرطة = 100 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 : توصيل مختلف أنواع الخلايا في الدماغ بعد حقن intrathecal المباشر rAAVrh10- (أ) الخلايا الهرمية؛ (ب) متعدد الأقطاب العصبية؛ (ج) خلايا microglial؛ (د) أستروسيتي؛ وأوليجوديندروسيتي (E). تغيير حجم أشرطة = 100 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
من الناحية الفنية، هناك العديد من الخطوات الحاسمة خلال تكنولوجيا الحقن في الفئران مستيقظا. أولاً، سليم لفتة وشركة مراقبة الفئران طوال العملية برمتها شرط مسبق للنجاح في إيصال. ثانيا، النقطة الأكثر صعوبة هو شعور المسافة الفقرية بطرف الإبرة، أنه من الضروري عدم إدراج عميقا جداً دون مقاومة أو إدراج عنوة تحت مقاومة قوية في حالة إصابة الحيوانات أو ثني طرف الإبرة. ثالثا، رغم الشلل عابر بسبب ليدوكائين يوفر مؤشر موضوعي لأنها نوعية الحقن، مطلوب مزيد من الممارسة لتحقيق نتائج متسقة وناجحة.
وفي هذا التقرير، قمنا بتطوير أسلوب حقن intrathecal مباشر في الفئران مستيقظا لتسليم إف، الذي يخدم ليدوكائين كمؤشر لمدى نجاح حقن تكنولوجيا المعلومات ومؤشرا لفعالية العلاج الجيني. كان أول من استخدم البزل القطني المباشرة التجريبية لتسليم الوكلاء، لا سيما من المسكنات، إلى الحبل الشوكي للتسكين والتخدير، وأوصى بشدة في العلاج الجيني لأمراض الجهاز العصبي المركزي. ونظرا لصعوبة تقنية الحقن في الحيوانات الصغيرة مثل الفئران، الجمع بين اثنين من التطبيقات من البزل القطني مباشرة واختيار الموضعية (ليدوكائين، التي كانت تستخدم في العيادات على نطاق واسع كمؤشر موضوعي لنوعية الحقن بتقييم شلل عابر والاستعادة). بالإضافة إلى ذلك، نحن المعرفة معياراً للتنبؤ بكفاءة تسليم إف من خلال مستويات الشلل وأكدت هذا إيمونوستينينج. أظهرنا أن جيدا حقن الحيوانات لديها مستويات أعلى من توصيل rAAVrh10-اجفب في الجهاز العصبي المركزي في الفئران الكبار.
بالمقارنة مع أسلوب التسليم intrathecal السابقة التي تشمل التخدير العميق قسطرة الحيوان وإينتراثيكال مع الصفيحة14،15، أسلوبنا الحالي له العديد من المزايا. أولاً، إجراء البزل القطني بسيطة يمكن أن تكتمل في غضون دقائق قليلة لكل الحيوانات، بينما يأخذ الإجراء السابق ~ 1 ح للحيوان الواحد. ثانيا، الأسلوب الحالي لا تستخدم التخدير والجراحة، وبالتالي يقلل من خطر إصابة4. ثالثا، بإضافة 1% ليدوكائين هيدروكلوريد في حل إف، نحن أنشأت نظاما التهديف خمس نقاط إلى شلل عابر رتبة بعد الحقن وأثبت أنه درجة الضعف الناجم عن ليدوكائين يمكن استخدامها للتنبؤ بمدى الجهاز العصبي المركزي توصيل كل الحقن. أثبتت البيانات المتوفرة لدينا أن جيدا حقن الحيوانات مستويات عالية من توصيل rAAVrh10-اجفب في الجهاز العصبي المركزي الفئران الكبار. توصيل أيضا على نطاق واسع إلى حد مماثل من الطريقة السابقة تشمل قسطرة الصفيحة وإينتراثيكال. بالمقارنة مع القائمة من أساليب ثقب في الفئران مستيقظا، توفير مؤشر موضوعي لنوعية الحقن باستخدام ليدوكائين وتجنب العمى لحقن الفاشلة والتدخل اللاحق في الفعالية العلاجية.
أخذت معا، تسليم intrathecal الحالية التي تحتوي على 1% ليدوكائين طريقة واعدة في علاجات تجريبية لأمراض الجهاز العصبي المركزي بإيصال الجينات أو المخدرات في الفئران. وعلاوة على ذلك، نهج عملي ومناسب لممارسة ذلك الحقن في الحيوانات الصغيرة مثل الفئران.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
تم تمويل هذا العمل بمنحه مقدمة من إدارة مقاطعة خبي من الموارد البشرية والضمان الاجتماعي (CY201605)، ومنحة من "مؤسسة العلوم الطبيعية لمقاطعة خبي" (H2017206101)، ونحن ممتنون جداً للدكتور قاو شوانغبينغ، الذين قدموا إف هذه الدراسة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FVB/NJ mice | Charles River Laboratories China | ||
| Lidocaine hydrochloride monohydrate | HEOWNS | 73-78-9 | |
| AAV | Viral Vector Core of the Gene Therapy Center at University of Massachusetts Medical School | ||
| 25 µL Hamilton syringe/27-30 G needle | GASTIGHT | 1702 | |
| O.C.T compond | SAKURA | 4583 | |
| H 2O 2 | SHUI HUAN PAI | 170401 | |
| Goat serum | Solarbio | S9070 | |
| Triton X-100 | LIFE SCIENCES | T8200 | |
| Rabbit anti-GFP | Life tech | G10362 | 1:333 dilution |
| The second antibody (goat-anti rabbit) | Jackson Immuno Research | 111-005-144 | 1:1,000 dilution |
| VECTASTAIN ABC REAGENT | Vector Lab | PK-6100 | |
| ImmPACT DAB Peroxidase Substrate Kit | Vector Lab | SK-4105 | |
| Mounting medium for fluorescence with DAPI | Vectorshield | H-1200 | |
| NaCl | Yong Da Chemical | ||
| NaH2PO4·2H2O | Yong Da Chemical | ||
| Na2HPO4·12H2O | Yong Da Chemical | ||
| Paraformaldehyde | Yong Da Chemical | 307699 | |
| Adhesion Microscope Slides | CITOGLAS | 17083 | 25 mm x 75 mm |
| SUPER-SLIP MICRO-GLAS | Electro Microscopy Siences | 72236-60 | 24 mm x 60 mm |
| 15 mL Centrifuge tube | CORNING | 430790 | |
| 96 well cell culture cluster | Coster | 3599 | |
| 24 well cell culture cluster | Coster | 3524 | |
| 70% Ethanol | WEN ZHI | ||
| Gauze | Wei AN | 05171112 | 8 cm x 10 cm x 12 cm |
| 1 mL syringe | Hong Da | ||
| Microtubes | Plasmed | ||
| Micropipet | eppendorf | ||
| Peppet tips | Rainin | ||
| Centirifuge | eppendorf | 5427R | |
| Regerator | Haier | BCD-539WT | |
| Filter | MILLEX GP | R4PA42342 | |
| Pump | LongerPump | BT-100-2J/YZ1515X | |
| Microscope | Olympus | BX53 | |
| Freezing-microtome | Leica | CM1520 |
References
- Murlidharan, G., Samulski, R. J., Asokan, A. Biology of adeno-associated viral vectors in the central nervous system. Frontiers in Molecular Neuroscience. 7, 76 (2014).
- Lentz, T. B., Gray, S. J., Samulski, R. J. Viral vectors for gene delivery to the central nervous system. Neurobiology Disease. 48 (2), 179-188 (2012).
- Yang, B., et al. Global CNS transduction of adult mice by intravenously delivered rAAVrh.8 and rAAVrh.10 and nonhuman primates by rAAVrh.10. Molecular Therapy. 22 (7), 1299-1309 (2014).
- Guo, Y., et al. A Single Injection of Recombinant Adeno-Associated Virus into the Lumbar Cistern Delivers Transgene Expression Throughout the Whole Spinal Cord. Molecular Neurobiology. 53 (5), 3235-3248 (2016).
- Hastie, E., Samulski, R. J. Adeno-associated virus at 50: a golden anniversary of discovery, research, and gene therapy success--a personal perspective. Human Gene Therapy. 26 (5), 257-265 (2015).
- Hocquemiller, M., Giersch, L., Audrain, M., Parker, S., Cartier, N. Adeno-Associated Virus-Based Gene Therapy for CNS Diseases. Human Gene Therapy. 27 (7), 478-496 (2016).
- Tanguy, Y., et al. Systemic AAVrh10 provides higher transgene expression than AAV9 in the brain and the spinal cord of neonatal mice. Frontiers in Molecular Neuroscience. 8, 36 (2015).
- Federic, T., et al. Robust spinal motor neuron transduction following intrathecal delivery of AAV9 in pigs. Gene Therapy. 19, 852-859 (2012).
- Ayers, J. I., et al. Widespread and efficient transduction of spinal cord and brain following neonatal AAV injection and potential disease modifying effect in ALS mice. Molecular Therapy. 23 (1), 53-62 (2015).
- Li, D., et al. Slow Intrathecal Injection of rAAVrh10 Enhances its Transduction of Spinal Cord and Therapeutic Efficacy in a Mutant SOD1 Model of ALS. Neuroscience. 365, 192-205 (2017).
- Borel, F., et al. Therapeutic rAAVrh10 Mediated SOD1 Silencing in Adult SOD1(G93A) Mice and Nonhuman Primates. Human Gene Therapy. 27 (1), 19-31 (2016).
- Fairbanks, C. A. Spinal delivery of analgesics in experimental models of pain and analgesia. Advanced Drug Delivery Reviews. 55 (8), 1007-1041 (2003).
- Hylden, J. L., Wilcox, G. L. Intrathecal morphine in mice: a new technique. European Journal of Pharmacology. 67, 313-316 (1980).
- Wang, H., et al. Widespread spinal cord transduction by intrathecal injection of rAAV delivers efficacious RNAi therapy for amyotrophic lateral sclerosis. Human Molecular Genetics. 23 (3), 668-681 (2014).
- Wang, Y., et al. scAAV9-VEGF prolongs the survival of transgenic ALS mice by promoting activation of M2 microglia and PI3K/Akt pathway. Brain Research. 1648, Pt A 1-10 (2016).
