Summary
Her presenterer vi en direkte intratekal injeksjon teknikken bruker 1% lidokain hydroklorid i en viral løsning å sikre effektiv adeno-assosiert virus levering til små dyr og etablere et poengsystem for å forutsi signaltransduksjon effektivitet i central nervesystemet etter forbigående svakhet av lidocaine.
Abstract
Intratekal IT injeksjon av adeno-assosiert virus (AAV) har trukket betydelig interesse i CNS genterapi i kraft av sin sikkerhet, noninvasiveness og utmerket signaltransduksjon effekt i CNS. Tidligere studier har vist den terapeutiske potens av AAV levert genterapi i nevrodegenerative lidelser av den administrasjon. Men er høy forekomst av uforutsigbare feil på grunn av tekniske begrensning av IT-administrasjon i små dyr rapportert. Her etablert vi et poengsystem for å angi suksess omfanget av lumbale punktering i små dyr ved å legge til 1% lidokain hydroklorid i injeksjon løsningen. Vi videre vise at omfanget av forbigående svakhet etter injeksjon kan forutsi signaltransduksjon effektiviteten av AAV. Derfor kan denne IT injeksjon metoden brukes til å optimalisere terapeutisk studier i musen modeller av CNS sykdommer som hjemsøker brede områder av CNS.
Introduction
AAV kan megle langvarig og utbredt genuttrykk i CNS signaltransduksjon noen bivirkninger, og derfor har blitt en av de mest lovende kjøretøyene for genterapi å behandle CNS sykdommer inkludert amyotrofisk lateral sklerose (ALS), Huntingtons sykdom (HD), Alzheimers sykdom (AD), lysosomale lagring sykdommer (LSD), Gaucher sykdom (GD) og neuronal ceroid lipofuscinosis (NCL)1. For tiden har mer enn 100 AAV serotyper vært isolert fra mennesker og dyr. Blant disse, minst 12 har blitt brukt i prekliniske og kliniske studier, inkludert de mest brukte genet vektorer som AAV1, 2, 4, 5, 6, 8, 9, rAAVrh.8 og rAAVrh.101,2,3,4, 5,6.
Ulike CNS sykdommer krever forskjellige AAV levering strategier på grunn av ulike berørte CNS regioner og celletyper. CNS regionene og celle som AAV kan transduce avhengig av serotype og leveringsmetode. For eksempel har rAAVrh10 blitt vist å transduce overveiende astrocyttene når levert av systemisk intravenøs injeksjon (IV), mens det transduced både neurons og glia når levert av intratekal injeksjon4,7. I tillegg resulterte parenchyma injeksjon i lokale signaltransduksjon til nærheten av injeksjonsstedet, mens injeksjon i spinalvæske (CSF) gjennom intraventricular eller intratekal injeksjon resulterte i omfattende CNS signaltransduksjon8 . Studier har også vist terapeutiske potens av AAV levert genterapi i nevrodegenerative lidelser av den administrasjon9,10,11. I sykdommer som påvirker brede områder av CNS som ALS, har intratekal injeksjon i CSF vist å dekke de fleste områder som er rammet av sykdommen med en lavere dose, sammenlignet med en systemisk levering metode4,10. Studier har også vist at lumbale punktering kan brukes til å injisere AAV musen modeller for ALS, som unngår potensielle skader forbundet med laminectomy og intratekal catheterization4.
Eksperimentell direkte lumbale punktering ble først brukt til å levere agenter særlig bedøvelse, til ryggmargen analgesi og anestesi i 188512,13. I denne rapporten viser vi den lumbale punktering IT injeksjon metode i voksen mus ved hjelp av 1% lidokain hydroklorid, en lokal amid-avledet bedøvelse, i injeksjon løsningen å evaluere og overvåke injeksjon kvalitet. Vellykket injeksjoner var preget av lidocaine-indusert midlertidig lammelse, mens mislykkede injeksjoner ikke viste dette problemet. Vi klassifisert nivået av forbigående svakhet som en av fem karakterer til å forutse Injeksjonseffektiviteten. Endelig viser vi at rAAVrh10 signaltransduksjon nivået kan bli spådd av karakteren lammelse. Dette intratekal AAV leveringsmåte kan derfor brukes til å forbedre AAV-mediert gen-levering for eksperimentell terapi CNS sykdommer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
FVB/NJ mus ble avlet i dyr anlegget av nøkkelen laboratorium av Hebei Nevrologi. Alle mus eksperimenter ble godkjent av den andre sykehus av Hebei medisinske universitet etikk og utført i henhold til regelverket laboratorium dyr Management kunngjort av departementet for vitenskap og teknologi av People's Republic of Kina.
1. utarbeidelse av 20% lidokain hydroklorid lagerløsning
- Veie 2 g lidokain hydroklorid. Legge til 5-6 mL av sterilt vann og vortex forsiktig. Forhøye kvantum totalt 10 mL med sterilt vann.
- 1.2 filtrere lager løsningen via 0,2-mikron filter. Aliquot lager løsningen, 1 mL per 1,5 mL microcentrifuge rør, og forsegle den med en forsegling film. Butikken på 4 ° C.
2. direkte intratekal AAV levering i våken mus
- Tørk arbeidsområdet med 70% etanol sterilt gasbind og forberede de nødvendige forsyningene som nevnt i tabell 1.
- Forberede 100 µL av AAVrh.10/1% lidokain hydroklorid kompleks ved å legge til 95 µL rAAVrh10 lager løsning (5 x 1012 genomet Kopier/mL) inn i et sterilt 200 µL microcentrifuge rør, og legge til 5 µL av 20% lidokain hydroklorid lagerløsning. Bland godt av pipettering opp og ned. Oppbevar deretter det virus løsningen på is (4 ° C).
Merk: 8 µL per musen4 vil bli brukt. -
Forbereder sprøyten AAV løsning for injeksjon
- Sett sammen en 25 µL Hamilton sprøyte med en 27 G nål og justere skrå spissen av nålen med volumetriske målestokken på sprøyten.
- Tegne 8 µL med 4 x 1010 genomet kopier av det virus løsningen i sprøyten forsiktig. Husk å fjerne luftbobler.
-
Forbereder musen
Merk: mann eller kvinne FVB/NJ mus (30 – 70 dager gamle) ble brukt i denne studien. IT injeksjon ble drevet i panseret.- Sterilisere arbeidsområdet i hette med 70% etanol. Sette våken musen (mann eller kvinne, 30-70 dager gammel, 13 – 20 g vekt) på en bedpiece i en utsatt posisjon i panseret. Dekk overkroppen med sterilt gasbind musen og unngå tilværelse bitter.
- Fastsette dyret ved riktig og fast på sin bekken belte med en tommelen på én side og pekefingeren/midt finger på den andre siden. Hold huden mellom bilaterale bekken hofteholdere stram med tommelen og pekefingeren. Hold forsiktig på overkroppen av dyret med håndflaten.
- Barbere pelsen på ryggen mellom de bilaterale bekken hofteholdere, og sterilisere huden overflate med en iodide-baserte scrub og 70% etanol.
-
Intratekal injeksjon12
- Føler intervertebral plass langs midtlinjen mellom de bilaterale bekken hofteholdere med tommelen eller pekefingeren på den andre hånden og trykk et innrykk med en fingernegl å angi L5-L6 intervertebral plass (Finn injeksjonsstedet).
- Roter foten av halen litt og forsiktig å angi midtlinjen av ryggraden. Juster pinne skråkant mot hodet av dyret før injeksjon (nevnt i trinn 2.3.1).
- Kontroller at dyrene er løst fast og justere nålen langs midtlinjen av ryggraden.
- Sette inn nålen forsiktig og loddrett (eller Vipp litt 70-80°) i skjæringspunktet mellom innrykk og holde sprøyten i sentrale sagittal flyet. Redusere vinkelen til ca 30° sakte når benet, og deretter skli nålen i intervertebral plass.
Merk: En tydelig plutselig hale flick er et tegn på vellykket inntreden i intradural rommet. Når nålen inn intervertebral plass, vil pinne-spissen føle godt festet. 27 G nålen brukt i denne studien er egnet for IT levering i mus men ikke rotter. - Injisere vektor løsningen (nevnt i trinn 2.2). Starte tidtakeren og injisere 8 µL av vektor løsningen med en hastighet på 1 µL/4 s. Behold nålen ca 1 min etter levering. Trekke nålen med mild rotasjon å unngå lekkasje.
- Score forbigående svakhet av musen lemmer umiddelbart etter levering evaluere injeksjon kvalitet4.
Merk: Standarden er som følger4. Skala 0: ingen svakhet; score 1: mindre svakhet med bakbeina uten gangart abnormitet; scorer 2: moderat svakhet med bakbeina med åpenbare gangart abnormitet; score 3: fullføre lammelse av bakbeina; score 4: fullstendig lammelse av bakbeina, kortpustethet, og moderat svakhet av forgrunnen lemmer; og scorer 5: fullstendig lammelse av alle fire lemmer og åpenbart kortpustethet. - Flytt musen tilbake til buret for utvinning fra lammelse.
-
Opprydding
- Tømme sprøyten med 1 mL steril vann. Sortere laboratorium forsyninger og samle alle ikke-disponible materialer for autoklaveres sterilisering. Rengjør benken med 70% etanol.
3. vev forberedelse til Immunohistochemical flekker
-
Vev samling
- Bedøve mus på 21 dager etter injeksjon med 3% chloral hydrat (0,1 mL/10 g) dypt ved intraperitoneal injeksjon.
- Perfuse transcardially med 20 mL iskald 0,01 M PBS (NaCl 147 mM; NaH2PO4 1,9 mM; K2HPO4 8.1 mM, pH 7.4) først, deretter 4% iskalde paraformaldehyde (i 0.01 M PBS) med pumpe (10 mL/min for 1 min, deretter 5 mL/min for 9 min).
Forsiktig: Paraformaldehyde er kreftfremkallende og giftige. Behandle den bare i avtrekksvifte med hansker.
-
Disseksjon av ryggmargen og hjernen
- Fastsette lemmer og leder av hvert dyr i en utsatt posisjon på et skum boks dekke med sprøyte nåler, og fjerne og fjerne huden fra hodet til sacrum med saks.
- Klipp skallen mellom øynene, klippe sammen med midtre ruten skallen og vannrett linje på lillehjernen og åpne skallen på hver side.
- Løft nakkeknølen med pinsett og åpne spinal kanalen bilateralt med ophthalmica saks. Avskåret ribbeina på begge sider og fjerne den øvre halvdelen av ryggsøylen nøye.
- Løft hjernen med buet pinsett sever nerver av skull base, og analysere hele hjernen og ryggmarg nøye. Etter fikse vev på 4% paraformaldehyde 24 h.
-
Utarbeidelse av vev skiver
- Cryoprotect hjernen og lumbal ryggmargen i 30% sukrose løsning overnatting på 4 ° C. Embed vevet i optimal kutte temperatur (OCT) sammensatte og fryse raskt med flytende nitrogen.
- Klipp vevet 25 µm ved hjelp av en kryostaten og lagre de frosne snitt i 0.01 M PBS på 4 ° C for bruk.
4. Immunohistochemistry
- Pretreat frittflytende deler i 1% H2O2 for 10 min og deretter vaske i PBS for 10 min. Incubate i en sperring løsning som inneholder 5% serum og 0,3% ikke-ioniske vaskemiddel i PBS 1t.
- Inkuber skiver med tilsvarende primære antistoffer overnatting på 4 ° C. Vask avsnittene i PBST (0,2% mellom 20 i PBS) i 30 min (3 ganger i 10 min hver).
- Inkuber skiver med tilsvarende biotin-videregående antistoff ved romtemperatur for 1 h. vask i PBST i 30 min (3 ganger i 10 min hver).
- Inkuber avsnittene med affinitet biotin peroxidase komplisert for 40 min, og flekker med achromogenic agent. Montere delene på lysbilder og tørr riktig.
- Suge lysbildene i vannfri etanol i 5 min og xylen for 10 min, og forsegle lysbildene med en montering medium. Til slutt, bilde lysbildene med et mikroskop utstyrt med en kostnad - sammen enhet (CCD) på 100 x 200 x og 400 x forstørrelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mus viste ulike grader av forbigående svakhet rett etter det injeksjon av AAV løsning i 1% lidokain hydroklorid på grunn av ulike kvaliteten av intratekal injeksjon. Ifølge semi kvantitative 5 førsteklasses scoring system har vi etablert, vi testet signaltransduksjon mønstre av AAV i mus med forskjellige grader av lidocaine-indusert lem svakhet (skala 0, n = 2; score 1, n = 1; score 4, n = 4, scorer 5, n = 3). EGFP immunostaining av spinal snorer viste enten ingen eller liten signaltransduksjon i lumbal ryggmargen mus scoring 0, litt forbedret signaltransduksjon i mus scoring 1 og sterk og bred transductions i mus scoret 4 eller 5 (figur 1A). Vi kvantifisert GFP flekker intensiteten av de musene viser ulike grader av forbigående lem svakhet (figur 1B) og konkluderte med at alvorlighetsgraden av svakhet etter injeksjon korrelert tett med omfanget av ryggmargen signaltransduksjon.
Vi ytterligere utforsket detaljert signaltransduksjon profilen til rAAVrh10 i hele CNS, og la merke til at full lengde i ryggmargen og brede områder av hjernen var også transduced i godt injisert mus som scoret 4 eller 5. I hjernen, robust EGFP signaler ble oppdaget i Luktelappen (figur 2A), dorsolateral prefrontal cortex (figur 2B), dentate gyrus og CA3 sone av hippocampus (tall 2C og 2D), lillehjernen cortex (figur 2E) og marginale områder av hjernestammen inkludert ansikts kjernen (figur 2F), choroid plexus og ependymal epitelceller (figur 2G). Men ble færre EGFP-positive celler oppdaget i dype områder av hjernen. I ryggmargen og ventrale og dorsal horn var det ventrale avløpsvann motorisk axons og dorsal velstående sensoriske axons sterkt GFP-positive. Motor neurons i fremre hornene var sterkt transduced i ulike nivåer av ryggmargen (tall 2 H-2J). Videre er GFP-positive nerveceller i cortex inkludert pyramideformet celler ble oppdaget (tall 3A og 3B). Ulike glial celletyper, inkludert microglia, astrocyttene og oligodendrocytes, ble også funnet for å være EGFP-positive (tall 3 C-3E).
Figur 1 : Lidocaine-indusert svakhet grad spår signaltransduksjon effektivitet. AAV med 1% lidokain eller PBS (kontroll) ble injisert ved direkte IT injeksjon. Mus ble ofret og undersøkt for GFP uttrykk av immunhistokjemi 3 uker senere (skala 0, n = 2; score 1, n = 1; score 4, n = 4, scorer 5, n = 3). (A) GFP farging av cervical (CSC) og lumbar ryggmargen (Lexmarks Løsningssenter) deler vises. (B) GFP flekker intensiteten i Lexmarks Løsningssenter og CSC var direkte korrelert med graden av forbigående svakhet. Hvert merke representerer verdier (mener ± SD) fra ett museklikk. Dette tallet er tilpasset fra en tidligere publikasjon4. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Utbredt Albin på rAAVrh10 i hjernen og ryggmarg. (A) Luktelappen; (B) cortex; (C) dentate gyrus4; og (D) CA3 av hippocampus; (E) lillehjernen cortex; (F) ansikts kjernen; (G) lateral ventrikkel; (H) cervical fremre horn4; (jeg) thorax fremre horn4; og (J) lumbale fremre horn4. Skalere barer = 100 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Signaltransduksjon ulike celletyper i hjernen etter direkte intratekal rAAVrh10 injeksjon. (A) pyramideformet celler. (B) multipolar Nevron; (C) microglial celle. (D) astrocytter; og (E) oligodendrocyte. Skalere barer = 100 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Teknisk, det er flere viktige trinn under IT injeksjon i våken mus. Først, riktig gest og fast kontroll av musene gjennom hele operasjonen er en forutsetning for vellykket leveranse. Andre er det vanskeligste punktet følelsen intervertebral plass med pinne-spissen som ikke må sette inn for dypt uten motstand eller sette makt under sterk motstand i skadet dyrene eller bøye pinne-spissen. Tredje, selv om midlertidig lammelser på grunn av lidocaine gir en objektiv indikator for injeksjon kvalitet, mer trening er nødvendig for å oppnå konsekvent og gode resultater.
I denne rapporten, har vi utviklet en direkte intratekal injeksjon metode i våken mus for levering av AAV, der lidocaine fungerer som en indikator for omfanget av IT injeksjon suksess og som en prediktor for effektiviteten av genterapi. Eksperimentell direkte lumbale punktering ble først brukt til å levere agenter særlig bedøvelse, til ryggmargen analgesi og anestesi, og det har vært sterkt anbefalt i genterapi for CNS sykdommer. Gitt vanskeligheten av IT injeksjon i mindre dyr som mus, vi kombinert to programmer direkte lumbale punktering og valgte lokale anesthetics (lidocaine, som har vært brukt i klinikker mye som en objektiv indikator på injeksjon kvalitet ved å evaluere forbigående og gjenopprettes lammelse). I tillegg vi definert en standard for å forutsi levering effektiviteten av AAV gjennom lammelse nivåer og bekreftet dette ved immunostaining. Vi har vist at godt injisert dyrene hadde høyere nivåer av rAAVrh10-EGFP signaltransduksjon i CNS i voksen mus.
Sammenlignet med forrige intratekal leveringsmåte som involverer dyp anestesi av dyr og intratekal catheterization med laminectomy14,15, har vår nåværende metoden flere fordeler. Først kan enkel lumbale punktering prosedyren fullføres innen få minutter for hvert dyr, mens den forrige prosedyren tar ~ 1 t per dyr. Andre, det aktuelle metoden ansette ikke anestesi og kirurgi, og dermed reduserer risikoen for skade4. Tredje etter tillegg av 1% lidokain hydroklorid AAV løsningen, vi etablert poengberegningssystem fem poeng å rangere midlertidig lammelse etter injeksjon og viste at graden av svakhet av lidocaine kan brukes til å forutsi omfanget av CNS signaltransduksjon ved hver injeksjon. Våre data viste at godt injisert dyrene har høye nivåer av rAAVrh10-EGFP signaltransduksjon i CNS voksen mus. Signaltransduksjon er også utbredt i tilsvarende grad av tidligere metoden involverer laminectomy og intratekal catheterization. Sammenlignet med eksisterende det punktering metoder i våken mus, vi gir en objektiv indikator for injeksjon kvalitet ved hjelp av lidocaine og unngå blindhet mislykkede injeksjon og påfølgende innblanding i terapeutisk effekt.
Samlet gjeldende intratekal levering som inneholder 1% er lidokain en lovende metode i eksperimentell terapi for CNS sykdommer ved å levere gener eller narkotika i mus. Videre er det en praktisk tilnærming til praksis det injeksjon i små dyr som mus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble finansiert av en bevilgning fra HEBEI provinsielle avdeling av menneskelige ressurser og Social Security (CY201605) og et stipend fra Natural Science Foundation i Hebei provinsen (H2017206101), og vi er veldig takknemlig til Dr. for Guangping Gao, som leverte AAV for Denne studien.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FVB/NJ mice | Charles River Laboratories China | ||
| Lidocaine hydrochloride monohydrate | HEOWNS | 73-78-9 | |
| AAV | Viral Vector Core of the Gene Therapy Center at University of Massachusetts Medical School | ||
| 25 µL Hamilton syringe/27-30 G needle | GASTIGHT | 1702 | |
| O.C.T compond | SAKURA | 4583 | |
| H 2O 2 | SHUI HUAN PAI | 170401 | |
| Goat serum | Solarbio | S9070 | |
| Triton X-100 | LIFE SCIENCES | T8200 | |
| Rabbit anti-GFP | Life tech | G10362 | 1:333 dilution |
| The second antibody (goat-anti rabbit) | Jackson Immuno Research | 111-005-144 | 1:1,000 dilution |
| VECTASTAIN ABC REAGENT | Vector Lab | PK-6100 | |
| ImmPACT DAB Peroxidase Substrate Kit | Vector Lab | SK-4105 | |
| Mounting medium for fluorescence with DAPI | Vectorshield | H-1200 | |
| NaCl | Yong Da Chemical | ||
| NaH2PO4·2H2O | Yong Da Chemical | ||
| Na2HPO4·12H2O | Yong Da Chemical | ||
| Paraformaldehyde | Yong Da Chemical | 307699 | |
| Adhesion Microscope Slides | CITOGLAS | 17083 | 25 mm x 75 mm |
| SUPER-SLIP MICRO-GLAS | Electro Microscopy Siences | 72236-60 | 24 mm x 60 mm |
| 15 mL Centrifuge tube | CORNING | 430790 | |
| 96 well cell culture cluster | Coster | 3599 | |
| 24 well cell culture cluster | Coster | 3524 | |
| 70% Ethanol | WEN ZHI | ||
| Gauze | Wei AN | 05171112 | 8 cm x 10 cm x 12 cm |
| 1 mL syringe | Hong Da | ||
| Microtubes | Plasmed | ||
| Micropipet | eppendorf | ||
| Peppet tips | Rainin | ||
| Centirifuge | eppendorf | 5427R | |
| Regerator | Haier | BCD-539WT | |
| Filter | MILLEX GP | R4PA42342 | |
| Pump | LongerPump | BT-100-2J/YZ1515X | |
| Microscope | Olympus | BX53 | |
| Freezing-microtome | Leica | CM1520 |
References
- Murlidharan, G., Samulski, R. J., Asokan, A. Biology of adeno-associated viral vectors in the central nervous system. Frontiers in Molecular Neuroscience. 7, 76 (2014).
- Lentz, T. B., Gray, S. J., Samulski, R. J. Viral vectors for gene delivery to the central nervous system. Neurobiology Disease. 48 (2), 179-188 (2012).
- Yang, B., et al. Global CNS transduction of adult mice by intravenously delivered rAAVrh.8 and rAAVrh.10 and nonhuman primates by rAAVrh.10. Molecular Therapy. 22 (7), 1299-1309 (2014).
- Guo, Y., et al. A Single Injection of Recombinant Adeno-Associated Virus into the Lumbar Cistern Delivers Transgene Expression Throughout the Whole Spinal Cord. Molecular Neurobiology. 53 (5), 3235-3248 (2016).
- Hastie, E., Samulski, R. J. Adeno-associated virus at 50: a golden anniversary of discovery, research, and gene therapy success--a personal perspective. Human Gene Therapy. 26 (5), 257-265 (2015).
- Hocquemiller, M., Giersch, L., Audrain, M., Parker, S., Cartier, N. Adeno-Associated Virus-Based Gene Therapy for CNS Diseases. Human Gene Therapy. 27 (7), 478-496 (2016).
- Tanguy, Y., et al. Systemic AAVrh10 provides higher transgene expression than AAV9 in the brain and the spinal cord of neonatal mice. Frontiers in Molecular Neuroscience. 8, 36 (2015).
- Federic, T., et al. Robust spinal motor neuron transduction following intrathecal delivery of AAV9 in pigs. Gene Therapy. 19, 852-859 (2012).
- Ayers, J. I., et al. Widespread and efficient transduction of spinal cord and brain following neonatal AAV injection and potential disease modifying effect in ALS mice. Molecular Therapy. 23 (1), 53-62 (2015).
- Li, D., et al. Slow Intrathecal Injection of rAAVrh10 Enhances its Transduction of Spinal Cord and Therapeutic Efficacy in a Mutant SOD1 Model of ALS. Neuroscience. 365, 192-205 (2017).
- Borel, F., et al. Therapeutic rAAVrh10 Mediated SOD1 Silencing in Adult SOD1(G93A) Mice and Nonhuman Primates. Human Gene Therapy. 27 (1), 19-31 (2016).
- Fairbanks, C. A. Spinal delivery of analgesics in experimental models of pain and analgesia. Advanced Drug Delivery Reviews. 55 (8), 1007-1041 (2003).
- Hylden, J. L., Wilcox, G. L. Intrathecal morphine in mice: a new technique. European Journal of Pharmacology. 67, 313-316 (1980).
- Wang, H., et al. Widespread spinal cord transduction by intrathecal injection of rAAV delivers efficacious RNAi therapy for amyotrophic lateral sclerosis. Human Molecular Genetics. 23 (3), 668-681 (2014).
- Wang, Y., et al. scAAV9-VEGF prolongs the survival of transgenic ALS mice by promoting activation of M2 microglia and PI3K/Akt pathway. Brain Research. 1648, Pt A 1-10 (2016).
