Summary
Burada %1 lidokain hidroklorür viral bir çözümde küçük hayvanlar için verimli adeno ilişkili virüs teslim edilmesini sağlamak ve iletim verimliliği merkezi tahmin etmek için bir skorlama sistemi kurmak için bir doğrudan intratekal enjeksiyon tekniği mevcut sinir sistemi geçici zayıflık lidokain tarafından indüklenen derecesine göre.
Abstract
İntratekal (BT) enjeksiyon adeno ilişkili virüs (AAV) içinde CNS CNS gen terapisi Emanet, noninvasiveness ve mükemmel iletim etkinliği sayesinde önemli ilgi çekmiş olmalı. Önceki çalışmalarda AAV teslim gen terapisi nörodejeneratif hastalıklarda tedavi potens tarafından yönetim gösterdi. Ancak, öngörülemeyen hatası BT yönetim küçük hayvanlarda teknik sınırlandırılması nedeniyle yüksek oranlarda bildirilmiştir. Burada, %1 lidokain hidroklorür enjeksiyonu çözüm içine ekleyerek lumbar ponksiyon küçük hayvanlarda başarı kapsamını belirtmek için bir skorlama sistemi kurduk. Biz daha fazla geçici zayıflık enjeksiyon takip ölçüde AAV iletim verimliliği tahmin edebilirsiniz göstereceğim. Böylece, BT ekleme Buyöntem fare modelleri MSS geniş bölgelerinde eziyet CNS hastalıkları tedavi edici çalışmalarda en iyi duruma getirmek için kullanılabilir.
Introduction
AAV CNS iletim birkaç yan etkisi ile uzun vadeli ve yaygın gen ifadesinde aracılık ve bu nedenle amyotrofik lateral skleroz (ALS), Huntington'ın da dahil olmak üzere CNS hastalıkları tedavi etmek gen tedavisi için en umut verici araçlar haline gelmiştir hastalığı (HD), Alzheimer hastalığı (Ah), lizozomal hastalıklar (LSD), Gaucher hastalığı (GD) ve nöronal ceroid lipofuscinosis (NCL)1. Halen, 100'den fazla AAV serotipleri insan ve hayvan izole edilmiştir. Bunlar arasında en az 12 içinde Preklinik kullanılmıştır ve en çok da dahil olmak üzere klinik çalışmalarda kullanılan gen vektörel çizimler gibi AAV1, 2, 4, 5, 6, 8, 9, rAAVrh.8 ve rAAVrh.101,2,3,4, 5,6.
Farklı CNS hastalıkları nedeniyle çeşitli etkilenen CNS bölgeler ve hücre tipleri farklı AAV teslim stratejileri gerektirir. CNS bölgeler ve hücre AAV transduce türleri değişir bağlı olarak serotip yanı sıra teslimat yöntemi. Örneğin, rAAVrh10 nöronlar ve ne zaman intratekal enjeksiyon4,7tarafından teslim glia transduced ise ağırlıklı olarak sistemik damar içi enjeksiyon (IV), tarafından teslim astrocytes transduce gösterilmiştir. İntraventriküler aracılığıyla beyin-omurilik sıvısı (BOS) içine enjeksiyon veya intratekal enjeksiyon yaygın CNS iletim8 sonuçlandı, ancak buna ek olarak, parankimi enjeksiyon enjeksiyon yeri çevresinde için yerel iletim sonuçlandı . Çalışmalar de AAV teslim gen tedavisi nörodejeneratif hastalıklarda tedavi edici etki gücü tarafından Yönetim9,10,11göstermiştir. CNS ALS gibi geniş alanlarda etkileyen hastalıklarda intratekal enjeksiyon bos içine bir sistemik teslim Yöntem4,10' a kıyasla daha düşük bir dozda hastalıkla tarafından tutulmuş çoğu alanları kapsayacak şekilde gösterilmiştir. Son yıllarda yapılan çalışmalarda da bu lomber ponksiyon laminektomi ve intratekal kateterizasyon4ile ilişkili olası yaralanmaları önler ALS için fare modellerinde AAV enjekte için kullanılan göstermiştir.
Deneysel doğrudan lumbar ponksiyon ilk ajanlar, özellikle anestezi, spinal kord analjezi ve anestezi 188512,13için teslim etmek için kullanılmıştır. Bu raporda, lomber ponksiyon BT enjeksiyon yöntemi %1 lidokain hidroklorür, bir yerel Amid kaynaklı anestezi, değerlendirmek ve enjeksiyon kalite izlemek için enjeksiyon çözümde yardımı ile yetişkin farelerde göstermektedir. Başarısız olan iğneleri bu davranışı belli etmedi, ancak başarılı enjeksiyonları lidokain kaynaklı geçici felç tarafından işaretlenen. Enjeksiyon verimliliği tahmin yardımcı olmak için beş sınıflarda biri olarak geçici zayıflık düzeyini gizli. Son olarak, biz rAAVrh10 iletim düzeyi felç sınıf tarafından tahmin edilebilir gösterir. Bu nedenle, bu kulaklıklar AAV teslim yöntemi AAV aracılı gen-teslimat için deneysel tedavi CNS hastalıkları geliştirmek için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
FVB/NJ fareler anahtar laboratuvar Hebei Nöroloji hayvan tesiste bred. Tüm fare deneyleri ikinci hastane, Hebei Tıp Üniversitesi Etik Komitesi tarafından onaylanmış ve laboratuvar hayvan yönetimi, Çin Halk Cumhuriyeti'nin teknoloji ve Bilim Bakanlığı tarafından yürürlüğe düzenlemelere göre yürütülen Çin.
1. %20 lidokain hidroklorür stok çözelti hazırlanması
- Lidokain hidroklorür 2 g ağırlığında. 5-6 mL steril su ve girdap yavaşça ekleyin. 10 mL steril su ile toplam hacmi artar.
- 1.2 0.2 mikronluk filtrelerden hisse senedi çözüm filtre. Aliquot hisse senedi çözüm, 1.5 mL microcentrifuge başına 1 mL tüp ve sızdırmazlık bir film ile kapatın. 4 ° C'de mağaza
2. doğrudan intratekal AAV teslim uyanık farelerde
- Tablo 1' de belirtildiği gibi gerekli malzemeleri hazırlamak ve çalışma alanının % 70 etanol ile steril gazlı bez kullanarak silin.
- RAAVrh10 hisse senedi çözüm (5 x 1012 genom kopya/mL) 95 µL bir steril 200 µL microcentrifuge tüp ekleyerek AAVrh.10/1% lidokain hidroklorür karmaşık 100 µL hazırlamak ve 5 µL % 20 lidokain hidroklorür hisse senedi çözüm ekleyin. Mix de yukarı ve aşağı pipetting. Sonra virüs çözümü buz (4 ° C) depolar.
Not: fare4 başına 8 µL kullanılacaktır. -
AAV çözüm şırınga enjeksiyon için hazırlanıyor
- Bir 25 µL Hamilton şırınga ile 27 G iğne ve şırınga eğimli hacimsel ölçek iğneyle ucunda hizalamak bir araya getirin.
- 4 x 1010 genom kopyaları virüs çözümü ile 8 µL şırınga hafifçe çizin. Hava kabarcıkları kaldırdığınızdan emin olun.
-
Fare hazırlanıyor
Not: erkek veya kadın FVB/NJ fareler (30-70 gün eski) Bu çalışmada kullanılmıştır. BT enjeksiyon mahallede ameliyat.- KukuIeta % 70 etanol ile çalışma alanında sterilize. Yüzükoyun başlıklı bir bedpiece uyanık fare (erkek veya kadın, 30-70 günlükken, 13-20 gr ağırlığında) koyun. Fare sakin ve ısırılan önlemek için steril gazlı bez ile üst vücut kapak.
- Hayvan onun pelvik korse ile diğer tarafta bir yan ve işaret parmağı/orta parmağına bir başparmak üzerinde uygun şekilde ve sıkıca sürükleyici tarafından tamir. Cilt arasında ikili pelvik korse başparmak ve işaret parmağı ile gergin tutmak. Yavaşça hayvan üst vücut üzerinde hurma ile tutun.
- Kürk arasında ikili pelvik korse sırtında tıraş sonra cilt yüzeyinde bir iyodür tabanlı fırçalayın ve % 70 etanol ile sterilize.
-
İntratekal enjeksiyon12
- İntervertebral alanı arasında ikili pelvik korse bir başparmak veya diğer elin işaret parmağı ile orta çizgi boyunca hissediyorum ve L5-L6 intervertebral alanı belirtmek için bir tırnak ile bir girinti tuşuna basın (enjeksiyon yeri bulmak).
- Kuyruk Bankası biraz ve yavaşça döndürün omurganın orta hat belirtmek için. Hayvan önce enjeksiyon (2.3.1 adımda belirtilen) Başkanı doğru iğne eğim ayarlayın.
- Hayvanlar sıkıca sabitlenir ve omurga orta çizgi boyunca iğne hizalamak emin olun.
- İğneyi yavaşça ve dikey olarak yerleştirin (veya biraz 70 – 80 ° eğim) girinti ve tutmak belgili tanımlık tenkıye bir merkez sagittal düzlemde kesiştiği. Kemik bağlandığında yaklaşık 30 ° açı yavaş yavaş azaltmak sonra iğne intervertebral uzaya kayma.
Not: Bir belirgin ani kuyruk flick intradural alan başarılı bir giriş bir ibret vardır. Bir kez iğne intervertebral alanı girer, iğne ucu sıkıca klempe hissedeceksiniz. Bu çalışmada kullanılan 27 G iğne BT teslim fareler ama değil fareler için uygundur. - (2.2 adımda belirtilen) vektör çözüm enjekte. Sayacı başlatmak ve vektör çözüm 1 µL/4 s. koru iğne yaklaşık 1 dk hızında 8 µL bitirdikten sonra enjekte teslim. İğne sızıntı önlemek için nazik döndürme ile geri alıyorum.
- Fare geçici zayıflık bacaklarda hemen doğumdan sonra enjeksiyon kalite4değerlendirmek için puan.
Not: Standart4gibidir. 0 puan edinildi: zayıflık; 1 puan edinildi: küçük zayıflık hind bacaklarda olmadan yürüyüş anormallik; 2 puan edinildi: orta arka bacaklarda zayıflık belirgin yürüyüş anormallik ile; 3 puan edinildi: komple felç hind ekstremitelerin; 4 puan edinildi: tamamlamak hind bacaklarda felç, nefes darlığı ve ılımlı zayıflık ön bacaklarda; ve 5 puan: tüm dört bacaklarda felç ve belirgin darlığı tamamlandı. - Fare kurtarma felç için kafes geri taşıyın.
-
Temizlik
- Şırınga 1 mL steril su ile yıkayın. Laboratuvar malzemeleri sıralamak ve autoclaved sterilizasyon için tüm olmayan tek malzemeleri toplamak. Kürsüye % 70 etanol ile temizleyin.
3. doku hazırlık immunohistokimyasal boyama için
-
Doku koleksiyonu
- Fare ile % 3 kloral hidrat (0.1 mL/10 g) 21 gün sonrası enjeksiyon, derin mayi enjeksiyonu ile anestezi.
- Transcardially ile buz gibi 0.01 M PBS (NaCl 147 mM; 20 mL sıvı NaH2PO4 1.9 mM; K2HPO4 8.1 mM, pH 7,4) ilk olarak, o zaman % 4 buz gibi paraformaldehyde (içinde 0.01 M PBS) pompası (10 mL/dk'ya 1 dk, sonra 5 mL/dk'ya 9 dk.) ile.
Uyarı: Paraformaldehyde kanserojen ve zehirli. Sadece duman mahallede eldiven giyerken başa.
-
Omurilik ve beyin diseksiyon
- Bacaklarda ve her hayvan Başkanı yüzükoyun bir köpük kutusunun kapağında şırınga iğneleri ile fix sonra şerit ve cilt başından sakrum için makas ile kaldırın.
- Kafatası gözler arasında küçük, kafatası ve beyincik üzerine yatay çizgi orta rotası yanında kesmek sonra kafatasının her iki tarafı için açın.
- Oksipital kemiğin cımbız ile Asansör ve spinal kanal bilateral oftalmik makasla açın. Her iki tarafta kaburga kesti ve vertebra üst yarısı dikkatli bir şekilde çıkarın.
- Beyin eğri cımbız ile kaldırın ve kafatası tabanı sinirleri sever, sonra tüm beyin ve omurilik dikkatle incelemek. Dokular %4 paraformaldehyde için 24 saat sonrası düzeltin.
-
Dokusu dilimlerin hazırlanması
- Cryoprotect beyin ve servikal ve lomber spinal kord % 30 sükroz çözüm 4 ° C'de gecede Doku optimum kesim sıcaklığında (OCT) bileşik katıştırmak ve hızlı sıvı azot ile dondurma.
- Doku bir cryostat kullanarak 25 µm kesme ve donmuş bölümleri 0.01 M PBS kullanmak için 4 ° C'de depolayın.
4. immünhistokimya
- %1 H2O2 10 min için serbest yüzer bölümlerde pretreat sonra 10 dk. Incubate %5 serum ve %0,3 1 h için PBS içinde non-iyonik deterjan içeren bir engelleme çözüm için PBS içinde yıkayın.
- Gecede 4 ° C'de karşılık gelen birincil antikorlar dilimlerle kuluçkaya PBST bölümlerde yıkayın (% 0,2 ara 20 dakika sonra PBS) 30 dk (3 kez için 10 dk) için.
- Karşılık gelen biotin-ikincil antikor 1 h. PBST makinaya 30 dk (3 kez için 10 dk) için oda sıcaklığında dilimlerle kuluçkaya.
- Benzeşme biotin peroksidaz 40 min için karmaşık bölümlerle kuluçkaya ve achromogenic Ajan ile leke. Düzgün, Kuru ve bölümler slaytlar üzerine monte.
- 5 min için susuz etanol ve Ksilen 10 min için slaytları emmek, o zaman bir montaj orta slaytlarla mühür. Son olarak, slaytları bir şarj kuplajlı cihaz ile (CCD) donatılmış bir mikroskop ile 100 x 200 x ve 400 x büyütme görüntü.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fareler farklı derecelerde geçici zayıflık değil peşini enjeksiyon AAV çözüm %1 lidokain hidroklorür nedeniyle çeşitli intratekal enjeksiyon kalitesini gösterdi. Biz kurduk yarı kantitatif 5 dereceli Puanlama sistemine göre AAV iletim şekillerinin farelerde lidokain kaynaklı uzuv zayıflık farklı derecelerde ile test ettik (0, n puan edinildi = 2; 1, n puan edinildi = 1; 4, n puan edinildi = 4; puan edinildi 5, n = 3). EGFP immunostaining spinal iplerden gösterdi ya hiç veya çok az 0 Puanlama farelerin lomber spinal kord iletim, biraz gelişmiş iletim 1 Puanlama farelerde ve güçlü ve yaygın transductions fareler 4 ya da 5 (Şekil 1A) Puanlama. Biz yakından ilişkili spinal kord ölçüde ile enjeksiyon sonra zayıflık şiddeti geçici uzuv zayıflık (Şekil 1B) değişik derecelerde görüntüleme bu fareler yoğunluğunu boyama ve sonucuna GFP sayılabilir hedefidirler.
Daha fazla rAAVrh10 bütün CNS içinde detaylı iletim profil araştırdı ve o tam uzunlukta omurilik fark ve geniş alanlarda beynin de 4 ya da 5 attı iyi enjekte farelerde transduced. Beyinde, sağlam EGFP sinyalleri olfaktör ampul (Şekil 2A), dorsolateral prefrontal korteks (Şekil 2B), dentat gyrus ve hipokampus (rakamlar 2C ve 2D), bölgenin CA3 algılanan serebellar korteks (Şekil 2E) ve beyin sapı yüz çekirdek (Şekil 2F), choroid plexus ve ependymal epitel hücreleri (Şekil 2G) gibi marjinal alanları. Ancak, daha az EGFP pozitif hücreleri beynin derin bölgelerinde tespit edildi. Spinal kord ve tahliyeleri ve dorsal boynuz, ventral atık motor aksonlar ve dorsal varlıklı duyusal aksonlar şiddetle GFP pozitif. Motor nöronlar ön boynuzları şiddetle omurilik (rakamlar 2 H-2J) farklı düzeylerde transduced. Ayrıca, piramit hücreleri de dahil olmak üzere korteks nöronlarda GFP pozitif tespit edildi (Şekil 3A ve 3B). Microglia, astrocytes ve oligodendrocytes, dahil olmak üzere çeşitli gliyal hücre tiplerinin de EGFP pozitif (rakamlar 3 C-3E) bulunmuştur.
Resim 1 : Lidokain kaynaklı zayıflık ölçüde iletim verimliliği öngörür. AAV %1 lidokain ile veya PBS (kontrol) doğrudan BT enjeksiyonu ile enjekte ettiler. Fare kurban ve GFP ifade için immünhistokimya tarafından 3 hafta sonra muayene (0, n puan edinildi = 2; 1, n puan edinildi = 1; 4, n puan edinildi = 4; 5, n puan edinildi = 3). (A) GFP (CSC) servikal ve lomber spinal kord (LSC) bölümleri boyama gösterilir. (B) GFP LSC ve CSC şiddeti boyama doğrudan geçici zayıflık derecesi ile ilişkili. Her işareti bir fare (± SD demek) değerlerini temsil eder. Bu rakam bir önceki yayın4den adapte edilmiş. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 : Beyin ve spinal kord rAAVrh10 yaygın hedefidirler. (A)olfaktör ampul; (B) korteks; (C) dentat gyrus4; ve hipokampus (D) CA3; (E) serebellar korteksin; (F) yüz çekirdeği; (G) lateral ventrikül; (H) servikal ön boynuz4; (Ben) göğüs ön boynuz4; ve (J) bel ön boynuz4. Ölçek çubukları 100 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 : Doğrudan intratekal rAAVrh10 enjeksiyon sonra beyinde çeşitli hücre tiplerinin hedefidirler. (A)piramit hücreleri; (B) multipolar nöron; (C) mikroglial hücre; (D) astrocyte; ve (E) oligodendrocyte. Ölçek çubukları 100 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Teknik olarak, uyanık farelerde BT enjeksiyon sırasında birkaç önemli adımlar vardır. İlk, uygun jest ve firma denetimi tüm operasyon boyunca farelerin başarılı teslimat için bir ön koşul olduğunu. İkinci olarak, değil çok fazla direniş olmadan eklemek veya zorla hayvanlar yaralanmasına veya iğne ucunu bükme durumunda güçlü direnç altında eklemek için gerekli olduğu gibi en zor nokta intervertebral alanı iğne ucu ile hissediyor. Üçüncü olarak, lidokain nedeniyle geçici felç objektif bir gösterge için enjeksiyon kalite sağlasa da, tutarlı ve başarılı sonuçlar elde etmek için daha fazla uygulama gereklidir.
Bu raporda, lidokain BT enjeksiyon başarı ölçüde gösterge ve verimlilik gen tedavisi için bir tahmin olarak hizmet vermektedir AAV, teslim etmek için uyanık farelerde doğrudan intratekal enjeksiyon yöntemi geliştirdik. Deneysel doğrudan lumbar ponksiyon ilk ajanlar, özellikle anestezi, spinal kord analjezi ve anestezi için teslim etmek için kullanılan ve son derece gen terapisi CNS hastalıkları için tavsiye edilmiştir. BT enjeksiyon fare gibi daha küçük hayvanlarda zorluk, verilen doğrudan lumbar ponksiyon iki uygulamadan kombine ve Yerel anestezi (lidokain, klinikler yaygın enjeksiyon kaliteli objektif bir göstergesi olarak değerlendirerek kullanılmıştır açmadı felç) geçici ve restorable. Ayrıca, biz AAV teslim verimliliğini felç seviyeleri ile tahmin etmek için bir standart tanımlı ve bu immunostaining tarafından onaylandı. Biz iyi enjekte hayvanlar yetişkin farelerde MSS rAAVrh10-EGFP iletim düzeyi daha yüksek olduğunu gösterdi.
Laminektomi14,15ile hayvan ve intratekal kateterizasyon derin anestezi içeren önceki intratekal teslim yöntemi ile karşılaştırıldığında, bizim Şu anki yöntemi birçok avantajı vardır. İlk olarak, önceki yordamı ~ 1 h hayvan başına alır, ancak basit lumbar ponksiyon yordamı her hayvan için bir kaç dakika içinde tamamlanabilir. İkinci olarak, geçerli yöntem anestezi ve cerrahi istihdam değil ve bu nedenle yaralanma4riskini azaltır. Üçüncü olarak, %1 lidokain hidroklorür AAV çözüm için eklenmesi, biz beş maddelik skor sistemi enjeksiyon takip rütbe geçici felç için kurulan ve zayıflık lidokain tarafından indüklenen derecesini CNS ölçüde tahmin etmek için kullanılabilir olduğunu kanıtladı Her enjeksiyonla hedefidirler. Bizim veri iyi enjekte hayvanlar yetişkin fareler MSS içinde rAAVrh10-EGFP iletim yüksek düzeyde göstermiştir. İletim laminektomi ve intratekal kateterizasyon içeren önceki yöntem benzer bir ölçüde de yaygındır. İle karşılaştırıldığında ponksiyon yöntemlerinin uyanık farelerde mevcut, biz lidokain kullanarak enjeksiyon kaliteli objektif bir gösterge sağlar ve başarısız enjeksiyon ve terapötik etkinlik sonraki müdahale için körlüğü önlemek.
Birlikte, % 1'i içeren geçerli intratekal teslim alınmış lidokain bir umut verici deneysel tedaviler için CNS hastalıkları genleri veya uyuşturucu farelerde sunarak yöntemidir. Ayrıca, fareler gibi küçük hayvanlarda enjeksiyon uygulama için pratik ve uygun bir yaklaşım olduğunu.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu eser HEBEI İl Müdürlüğü insan kaynakları ve sosyal güvenlik (CY201605) hibe ve Hebei Eyaleti, Doğa Bilimleri Vakfı (H2017206101) bir hibe tarafından finanse edildi, ve biz AAV için sağlanan Guangping Gao için Dr için çok minnettarız Bu çalışmada.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FVB/NJ mice | Charles River Laboratories China | ||
| Lidocaine hydrochloride monohydrate | HEOWNS | 73-78-9 | |
| AAV | Viral Vector Core of the Gene Therapy Center at University of Massachusetts Medical School | ||
| 25 µL Hamilton syringe/27-30 G needle | GASTIGHT | 1702 | |
| O.C.T compond | SAKURA | 4583 | |
| H 2O 2 | SHUI HUAN PAI | 170401 | |
| Goat serum | Solarbio | S9070 | |
| Triton X-100 | LIFE SCIENCES | T8200 | |
| Rabbit anti-GFP | Life tech | G10362 | 1:333 dilution |
| The second antibody (goat-anti rabbit) | Jackson Immuno Research | 111-005-144 | 1:1,000 dilution |
| VECTASTAIN ABC REAGENT | Vector Lab | PK-6100 | |
| ImmPACT DAB Peroxidase Substrate Kit | Vector Lab | SK-4105 | |
| Mounting medium for fluorescence with DAPI | Vectorshield | H-1200 | |
| NaCl | Yong Da Chemical | ||
| NaH2PO4·2H2O | Yong Da Chemical | ||
| Na2HPO4·12H2O | Yong Da Chemical | ||
| Paraformaldehyde | Yong Da Chemical | 307699 | |
| Adhesion Microscope Slides | CITOGLAS | 17083 | 25 mm x 75 mm |
| SUPER-SLIP MICRO-GLAS | Electro Microscopy Siences | 72236-60 | 24 mm x 60 mm |
| 15 mL Centrifuge tube | CORNING | 430790 | |
| 96 well cell culture cluster | Coster | 3599 | |
| 24 well cell culture cluster | Coster | 3524 | |
| 70% Ethanol | WEN ZHI | ||
| Gauze | Wei AN | 05171112 | 8 cm x 10 cm x 12 cm |
| 1 mL syringe | Hong Da | ||
| Microtubes | Plasmed | ||
| Micropipet | eppendorf | ||
| Peppet tips | Rainin | ||
| Centirifuge | eppendorf | 5427R | |
| Regerator | Haier | BCD-539WT | |
| Filter | MILLEX GP | R4PA42342 | |
| Pump | LongerPump | BT-100-2J/YZ1515X | |
| Microscope | Olympus | BX53 | |
| Freezing-microtome | Leica | CM1520 |
References
- Murlidharan, G., Samulski, R. J., Asokan, A. Biology of adeno-associated viral vectors in the central nervous system. Frontiers in Molecular Neuroscience. 7, 76 (2014).
- Lentz, T. B., Gray, S. J., Samulski, R. J. Viral vectors for gene delivery to the central nervous system. Neurobiology Disease. 48 (2), 179-188 (2012).
- Yang, B., et al. Global CNS transduction of adult mice by intravenously delivered rAAVrh.8 and rAAVrh.10 and nonhuman primates by rAAVrh.10. Molecular Therapy. 22 (7), 1299-1309 (2014).
- Guo, Y., et al. A Single Injection of Recombinant Adeno-Associated Virus into the Lumbar Cistern Delivers Transgene Expression Throughout the Whole Spinal Cord. Molecular Neurobiology. 53 (5), 3235-3248 (2016).
- Hastie, E., Samulski, R. J. Adeno-associated virus at 50: a golden anniversary of discovery, research, and gene therapy success--a personal perspective. Human Gene Therapy. 26 (5), 257-265 (2015).
- Hocquemiller, M., Giersch, L., Audrain, M., Parker, S., Cartier, N. Adeno-Associated Virus-Based Gene Therapy for CNS Diseases. Human Gene Therapy. 27 (7), 478-496 (2016).
- Tanguy, Y., et al. Systemic AAVrh10 provides higher transgene expression than AAV9 in the brain and the spinal cord of neonatal mice. Frontiers in Molecular Neuroscience. 8, 36 (2015).
- Federic, T., et al. Robust spinal motor neuron transduction following intrathecal delivery of AAV9 in pigs. Gene Therapy. 19, 852-859 (2012).
- Ayers, J. I., et al. Widespread and efficient transduction of spinal cord and brain following neonatal AAV injection and potential disease modifying effect in ALS mice. Molecular Therapy. 23 (1), 53-62 (2015).
- Li, D., et al. Slow Intrathecal Injection of rAAVrh10 Enhances its Transduction of Spinal Cord and Therapeutic Efficacy in a Mutant SOD1 Model of ALS. Neuroscience. 365, 192-205 (2017).
- Borel, F., et al. Therapeutic rAAVrh10 Mediated SOD1 Silencing in Adult SOD1(G93A) Mice and Nonhuman Primates. Human Gene Therapy. 27 (1), 19-31 (2016).
- Fairbanks, C. A. Spinal delivery of analgesics in experimental models of pain and analgesia. Advanced Drug Delivery Reviews. 55 (8), 1007-1041 (2003).
- Hylden, J. L., Wilcox, G. L. Intrathecal morphine in mice: a new technique. European Journal of Pharmacology. 67, 313-316 (1980).
- Wang, H., et al. Widespread spinal cord transduction by intrathecal injection of rAAV delivers efficacious RNAi therapy for amyotrophic lateral sclerosis. Human Molecular Genetics. 23 (3), 668-681 (2014).
- Wang, Y., et al. scAAV9-VEGF prolongs the survival of transgenic ALS mice by promoting activation of M2 microglia and PI3K/Akt pathway. Brain Research. 1648, Pt A 1-10 (2016).
