JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Biochemistry

Fangst og identifikasjon av RNA-bindende proteiner ved hjelp av Klikk kjemi-assistert RNA-interactome Capture (CARIC) strategi

Published: October 19, 2018
doi:
10.3791/58580
, , ,
1College of Chemistry and Molecular Engineering,Peking University, 2Beijing National Laboratory for Molecular Sciences,Peking University, 3Peking-Tsinghua Center for Life Sciences,Peking University, 4Synthetic and Functional Biomolecules Center,Peking University, 5Key Laboratory of Bioorganic Chemistry and Molecular Engineering of Ministry of Education,Peking University

Summary

En detaljert protokoll for å bruke Klikk kjemi-assistert RNA-interactome capture (CARIC) strategi for å identifisere proteiner bindende til både koding og noncoding RNAs presenteres.

Abstract

En omfattende identifikasjon av RNA-bindende proteiner (RBPs) er nøkkelen til å forstå posttranscriptional regulatoriske nettverket i celler. En brukte strategi for RBP fange utnytter polyadenylation [poly(A)] av målet RNAs, som stort sett oppstår på eukaryote moden mRNAs, forlater de fleste bindende proteiner av non-poly(A) RNAs uidentifisert. Her beskriver vi detaljerte prosedyrer av en nylig rapportert metode kalt Klikk kjemi-assistert RNA-interactome capture (CARIC), som gjør transcriptome hele erobringen av både poly(A) og non-poly(A) RBPs ved å kombinere metabolske merkingen av RNAs, i vivo UV cross-linking og bioorthogonal merking.

Introduction

Det menneskelige genomet er transkribert til ulike typer koding og noncoding RNAs (ncRNAs), inkludert mRNAs, rRNAs, tRNAs, liten kjernefysiske RNAs (snRNAs), liten nucleolar RNAs (snoRNAs) og lenge ikke-koding RNAs (lncRNAs)1. De fleste av disse RNAs har klær av RBPs og fungerer som ribonucleoprotein partikler (RNPs)2. Derfor er en omfattende identifikasjon av RBPs en forutsetning for å forstå regulatoriske nettverket mellom RNAs og RBPs, som er involvert i ulike menneskelige sykdommer3,4,5.

De siste årene har sett en stor forbedring av RBPs i ulike eukaryote systemer2,6, inkludert menneskelige7,8,9,10,11, musen12,13,14, gjær9,15,16, sebrafisk17 Drosophila melanogaster18,19 , Caenorhabditis elegans16, Arabidopsis thaliana20,21,22og menneskelige parasitter23,24,25 . Disse fremskrittene har blitt lettere ved en RBP datafangst strategi utviklet av Castello et al. 7 og Baltz et al. 8 i 2012, som kombinerer i vivo UV cross-linking RNA og samspill proteiner, oligo(dT) fange av poly(A) RNAs og massespektrometri (MS)-basert proteomic profilering. Gitt det faktum at poly(A) hovedsakelig finnes på eldre mRNAs, som står for bare ~ 3-5% av eukaryote transcriptome26, er dette brukte strategi imidlertid ikke kan fange RBPs samspill med non-poly(A) RNAs, inkludert de fleste ncRNAs og pre-mRNAs.

Her rapporterer vi detaljerte prosedyrer på en nylig utviklet strategi for transcriptome hele tatt både poly(A) og non-poly(A) RBPs27. Kalt CARIC, denne strategien kombinerer i vivo UV cross-linking og metabolske merking av RNAs med analogs med photoactivatable og “klikkbare” nukleosid (som inneholder en bioorthogonal funksjonsgruppe som kan delta i Klikk reaksjon), 4 – thiouridine (4SU), og 5-ethynyluridine (EU). Fremgangsmåten for å få perfekte resultater med CARIC strategi er effektiv metabolske merking, UV cross-linking og klikk reaksjon og vedlikehold av RNA integritet. Fordi Cu(I) brukes som katalysator Klikk reaksjon kan forårsake fragmentering av RNAs, er en Cu(I) ligand som kan redusere RNA fragmentering viktig. Vi beskriver hvordan du utfører effektiv Klikk reaksjoner i celle lysates uten å forårsake alvorlige RNA nedbrytning.

Selv om RBP fange og identifisering i HeLa celler bare er beskrevet i denne protokollen, kan CARIC strategien brukes ulike celletyper og muligens levende organismer. Foruten RBP fange gir denne protokollen også strømlinjeformet trinnvise fremgangsmåter for MS utvalg forberedelse og protein identifikasjon og måling, som kan være nyttig for de som ikke er kjent med proteomic eksperimenter.

Protocol

FORSIKTIG: Eventuelt reagensene brukes bør kjøpes i form av RNase-fri, eller oppløst i RNase-fri, løsemidler (i de fleste tilfeller, i diethyl pyrocarbonate (DEPC)-behandlet vann). Ved håndtering av RNA prøver og RNase-fri reagenser, alltid bruke hansker og masker, og endre dem ofte for å unngå RNase forurensning. 1. forberedelse av Lysate av Metabolically merket og UV krysskoblet celler Metabolsk innlemmelse av EU og 4SU Kultur HeLa celler i Dulbe…

Representative Results

Representant resultatene av kvalitetskontroll trinnene presenteres. Resultatene omfatter tall i-gel fluorescens analysen beskrevet i trinn 2.3.2 (figur 1), western blot analysen beskrevet i trinn 4.1.3 (figur 2A) og sølv flekker analysen beskrevet i trinn 4.2.2 (figur 2B). Kvalitetskontroll trinnene er avgjørende for optimalisering av CARIC protokoller. Alltid inkludere kvalitetskontroll i utarbeid…

Discussion

Vedlikehold av rettferdig RNA integritet er en av nøklene til vellykket CARIC eksperimenter. Med riktig ligander av Cu(I) og forsiktig operasjon, kan RNA fornedrelse reduseres betydelig, selv om delvis fornedrelse ble observert. Substitusjon prosenter av EU og 4SU i eksperimentelle prøver er 1,18% og 0.46%, henholdsvis (data ikke vist). For intakt RNAs med en lengde på 2000 nt ~ 90% av RNAs inneholder minst én EU og en 4SU. For delvis dårligere RNAs med en lengde på 1000 nt ~ 70% av RNAs inneholder minst én EU og …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbeidet er støttet av den nasjonale Natural Science Foundation av Kina tilskudd 91753206, 21425204, og 21521003 og ved nasjonale nøkkelen forskning og utviklingsprosjektet 2016YFA0501500.

Materials

HeLa ATCC
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) Thermo Fisher Scientific 11995065
FBS (Fetal Bovine Serum) Thermo Fisher Scientific 10099141
Penicillin & Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122
EU (5-ethynyl uridine) Wuhu Huaren Co. CAS:69075-42-9
4SU (4-thiouridine) Sigma Aldrich T4509
10×PBS (Phosphate-Buffered Saline) Thermo Fisher Scientific AM9625
UV cross-linker UVP CL-1000 Equiped with 365-nm UV lamp
DEPC (Diethyl pyrocarbonate) Sigma Aldrich D5758 To treat water. Highly toxic!
Tris·HCl, pH 7.5 Thermo Fisher Scientific 15567027
LiCl Sigma Aldrich 62476
Nonidet P-40 Biodee 74385
EDTA-free protease inhibitor cocktail Thermo Fisher Scientific 88265 One tablet for 50 mL lysis buffer.
LDS (Lithium dodecyl sulfate) Sigma Aldrich L9781
15-mL ultrafiltration tube (10 kDa cutoff) Millipore UFC901024
0.5-mL ultrafiltration tube (10 kDa cutoff) Millipore UFC501096
Streptavidin magnetic beads Thermo Fisher Scientific 88816
DMSO (Dimethyl sulfoxide) Sigma Aldrich 41639
Azide-biotin Click Chemistry Tools AZ104
Copper(II) sulfate Sigma Aldrich C1297
THPTA [Tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl)amine] Sigma Aldrich 762342
Sodium ascorbate Sigma Aldrich 11140
Azide-Cy5 Click Chemistry Tools AZ118
LDS sample buffer (4×) Thermo Fisher Scientific NP0008
10% bis-Tris gel Thermo Fisher Scientific NP0301BOX
EDTA Thermo Fisher Scientific AM9260G
RNase A Sigma Aldrich R6513
SDS (Sodium dodecyl sulfate) Thermo Fisher Scientific 15525017
NaCl Sigma Aldrich S3014
Brij-97 [Polyoxyethylene (20) oleyl ether] J&K 315442
Triethanolamine Sigma Aldrich V900257
Streptavidin agarose Thermo Fisher Scientific 20353
Urea Sigma Aldrich U5378
Sarkosyl (N-Lauroylsarcosine sodium salt) Sigma Aldrich 61743
Biotin Sigma Aldrich B4501
Sodium deoxycholate Sigma Aldrich 30970
MaxQuant Version: 1.5.5.1
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Djebali, S., et al. Landscape of transcription in human cells. Nature. 489 (7414), 101-108 (2012).
  2. Gerstberger, S., Hafner, M., Tuschl, T. A census of human RNA-binding proteins. Nature Reviews Genetics. 15 (12), 829-845 (2014).
  3. Castello, A., Fischer, B., Hentze, M. W., Preiss, T. RNA-binding proteins in Mendelian disease. Trends in Genetics. 29 (5), 318-327 (2013).
  4. Nussbacher, J. K., Batra, R., Lagier-Tourenne, C., Yeo, G. W. RNA-binding proteins in neurodegeneration: Seq and you shall receive. Trends in Neuroscience. 38 (4), 226-236 (2015).
  5. Jazurek, M., Ciesiolka, A., Starega-Roslan, J., Bilinska, K., Krzyzosiak, W. J. Identifying proteins that bind to specific RNAs – focus on simple repeat expansion diseases. Nucleic Acids Research. 44 (19), 9050-9070 (2016).
  6. Hentze, M. W., Castello, A., Schwarzl, T., Preiss, T. A brave new world of RNA-binding proteins. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (5), 327-341 (2018).
  7. Castello, A., et al. Insights into RNA biology from an atlas of mammalian mRNA-binding proteins. Cell. 149 (6), 1393-1406 (2012).
  8. Baltz, A. G., et al. The mRNA-bound proteome and its global occupancy profile on protein-coding transcripts. Molecular Cell. 46 (5), 674-690 (2012).
  9. Beckmann, B. M., et al. The RNA-binding proteomes from yeast to man harbour conserved enigmRBPs. Nature Communications. 6, 10127-10135 (2015).
  10. Conrad, T., et al. Serial interactome capture of the human cell nucleus. Nature Communications. 7, 11212-11222 (2016).
  11. Castello, A., et al. Comprehensive identification of RNA-binding domains in human cells. Molecular Cell. 63 (4), 696-710 (2016).
  12. Kwon, S. C., et al. The RNA-binding protein repertoire of embryonic stem cells. Nature Structural & Molecular Biology. 20 (9), 1122-1130 (2013).
  13. Liepelt, A., et al. Identification of RNA-binding proteins in macrophages by interactome capture. Molecular & Cellular Proteomics. 15 (8), 2699-2714 (2016).
  14. Liao, Y., et al. The cardiomyocyte RNA-binding proteome: Links to intermediary metabolism and heart disease. Cell Reports. 16 (5), 1456-1469 (2016).
  15. Mitchell, S. F., Jain, S., She, M. P., Parker, R. Global analysis of yeast mRNPs. Nature Structural & Molecular Biology. 20 (1), 127-133 (2013).
  16. Matia-González, A. M., Laing, E. E., Gerber, A. P. Conserved mRNA-binding proteomes in eukaryotic organisms. Nature Structural & Molecular Biology. 22 (12), 1027-1033 (2015).
  17. Despic, V., et al. Dynamic RNA-protein interactions underlie the zebrafish maternal-to-zygotic transition. Genome Research. 27 (7), 1184-1194 (2017).
  18. Wessels, H. H., et al. The mRNA-bound proteome of the early fly embryo. Genome Research. 26 (7), 1000-1009 (2016).
  19. Sysoev, V. O., et al. Global changes of the RNA-bound proteome during the maternal-to-zygotic transition in Drosophila. Nature Communications. 7, 12128 (2016).
  20. Reichel, M., et al. In planta determination of the mRNA-binding proteome of Arabidopsis etiolated seedlings. Plant Cell. 28 (10), 2435-2452 (2016).
  21. Marondedze, C., Thomas, L., Serrano, N. L., Lilley, K. S., Gehring, C. The RNA-binding protein repertoire of Arabidopsis thaliana. Scientific Reports. 6, 29766-29778 (2016).
  22. Zhang, Z., et al. UV crosslinked mRNA-binding proteins captured from leaf mesophyll protoplasts. Plant Methods. 12, 42-53 (2016).
  23. Bunnik, E. M., et al. The mRNA-bound proteome of the human malaria parasite Plasmodium falciparum. Genome Biology. 17, 147-164 (2016).
  24. Lueong, S., Merce, C., Fischer, B., Hoheisel, J. D., Erben, E. D. Gene expression regulatory networks in Trypanosoma brucei: insights into the role of the mRNA-binding proteome. Molecular Microbiology. 100 (3), 457-471 (2016).
  25. Nandan, D., et al. Comprehensive identification of mRNA-binding proteins of Leishmania donovani by interactome capture. PLoS ONE. 12 (1), e0170068 (2017).
  26. Jankowsky, E., Harris, M. E. Specificity and nonspecificity in RNA-protein interactions. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (9), 533-544 (2015).
  27. Huang, R., Han, M., Meng, L., Chen, X. Transcriptome-wide discovery of coding and noncoding RNA-binding proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (17), E3879-E3887 (2018).
  28. Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nature Protocols. 1 (6), 2856-2860 (2006).
  29. Boersema, P. J., Raijmakers, R., Lemeer, S., Mohammed, S., Heck, A. J. R. Multiplex peptide stable isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics. Nature Protocols. 4 (4), 484-494 (2009).
  30. Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips. Nature Protocols. 2 (8), 1896-1906 (2007).
  31. Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).
  32. Ritchie, M. E., et al. limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies. Nucleic Acids Research. 43 (7), e47 (2015).
  33. Grammel, M., Hang, H., Conrad, N. K. Chemical reporters for monitoring RNA synthesis and poly(A) tail dynamics. ChemBioChem. 13 (8), 1112-1115 (2012).
  34. Curanovic, D., et al. Global profiling of stimulus-induced polyadenylation in cells using a poly(A) trap. Nature Chemical Biology. 9 (11), 671-673 (2013).
  35. Zheng, Y. X., Beal, P. A. Synthesis and evaluation of an alkyne-modified ATP analog for enzymatic incorporation into RNA. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 26 (7), 1799-1802 (2016).
  36. Nainar, S., et al. Metabolic incorporation of azide functionality into cellular RNA. ChemBioChem. 17 (22), 2149-2152 (2016).
  37. Bao, X., et al. Capturing the interactome of newly transcribed RNA. Nature Methods. 15 (3), 213-220 (2018).
  38. Holmqvist, E., Vogel, J. RNA-binding proteins in bacteria. Nature Reviews Microbiology. , (2018).

Tags

RNA-binding ProteinsCARICClick ChemistryRNA-interactome CapturePost-transcriptional Gene RegulationMRNANon-coding RNAHeLa CellsEU4SUUV Cross-linkingCell LysisRNA-protein Interaction

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Huang, R., Han, M., Meng, L., Chen, X. Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) Strategy. J. Vis. Exp. (140), e58580, doi:10.3791/58580 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image