Her iki kodlama ve kodlamayan bağlayıcı proteinler tanımlamak için tıklatın Kimya destekli RNA-interactome yakalama (CARIC) strateji uygulamak için detaylı bir protokol RNA’ların sunulur.
RNA bağlanıcı proteinler (RBPs) kapsamlı bir tanımlaması hücrelerdeki posttranscriptional düzenleyici ağ anlama anahtarıdır. RBP yakalama için yaygın olarak kullanılan bir strateji non-poly(A) RNA’ların çoğu proteinler tanımlanamayan bırakarak ökaryotik olgun mRNA üzerinde çoğunlukla oluşan Poliadenilasyon [Poli(a)] hedef RNA’ların, patlatır. Burada bir son zamanlarda bildirilen yönteminin metabolik etiketlerine göre birleştirerek poli(a) ve non-poly(A) RBPs transcriptome çapında yakalama sağlayan tıklama Kimya destekli RNA-interactome yakalama (CARIC) olarak adlandırdığı ayrıntılı yordamlar açıklar RNA’ların, in vivo UV cross-linking ve bioorthogonal etiketleme.
İnsan genomu çeşitli mRNA’ların, rRNA’lar, tRNA da dahil olmak üzere kodlama ve kodlamayan RNA’ların (ncRNA’lar), küçük nükleer RNA’ların (snRNA), küçük genelde RNA’ların (snoRNAs) ve uzun kodlamayan RNA’ların (lncRNAs)1sentezlenir. Bu RNA’ların çoğunu RBPs giyim sahip ve Ribonükleoprotein parçacıklar (RNPs)2olarak işlev. Bu nedenle, RBPs kapsamlı bir tanımlaması çeşitli insan hastalıkları3,4,5‘ te karıştığı düzenleyici ağ arasında RNA’ların ve RBPs, anlamak için bir önkoşuldur.
Son birkaç yıldır insan7,8,9,10,11de dahil olmak üzere çeşitli ökaryotik sistemleri2,6‘ da keşfedilen RBPs büyük bir destek tanık olduk, fare12,13,14, Maya9,15,16, zebra balığı17, Drosophila melanogaster18,19 , Caenorhabditis elegans16, Arabidopsis thaliana20,21,22ve insan parazitleri23,24,25 . Bu gelişmeler tarafından Castello vd tarafından geliştirilen bir RBP yakalama stratejisi kolaylaştırdı 7 ve Baltz vd. vivo UV RNA ve onun etkileşen proteinler, poli(a) RNA’ların oligo(dT) yakalanması ve kütle spektrometresi (MS) cross-linking birleştiren 8 2012 yılında,-proteomik profil oluşturma dayalı. Ancak, bu poli(a) çoğunlukla sadece ~ %3 – %526ökaryotik transcriptome hesaba, olgun mRNA üzerinde bulunmaktadır gerçeği göz önüne alındığında bu yaygın olarak kullanılan strateji non-poly(A) RNA’ların çoğu ncRNA’lar de dahil olmak üzere, ile etkileşim RBPs esir alma yeteneğine sahip değildir ve pre-mRNA’ların.
Burada, son zamanlarda geliştirilen strateji poli(a) ve non-poly(A) RBPs27transcriptome çapında yakalanması için ayrıntılı yordamlar raporu. CARIC olarak adlandırılan, bu strateji vivo içinde UV cross-linking ve metabolik RNA’lar (tıklayın tepki olarak katılabilir bir bioorthogonal fonksiyonel grup içeren) photoactivatable ve “tıklanabilir” nükleozit analogları ile etiketleme birleştiren 4 – thiouridine (4SU) ve 5-ethynyluridine (AB). CARIC stratejisi ile ideal sonuçlar elde etmek için anahtar olan verimli metabolik etiketleme, UV cross-linking ve tıklayın tepki ve RNA bütünlük bakımından adımlardır. Tıklayın tepki katalizör olarak kullanılan Cu(I) RNA’ların parçalanma neden olabileceğinden, RNA parçalanma azaltabilir bir Cu(I) ligand esastır. Biz verimli tıklayın reaksiyonlar şiddetli RNA bozunması neden olmadan cep lysates gerçekleştirmek açıklar.
RBP yakalamak ve kimlik HeLa hücreleri içinde sadece bu protokol için açıklanan, ancak çeşitli hücre tiplerinin ve muhtemelen canlı organizmalar CARIC strateji uygulanabilir. RBP yakalama yanı sıra, bu protokolü de MS numune hazırlama ve protein tanımlama ve o kim proteomik deneyler ile aşina olmayan için yararlı olabilir miktar için aerodinamik adım adım yordamlar sağlar.
Adil RNA bütünlük bakımından başarılı CARIC deneyler anahtarlarına biridir. Kısmi düşme gözlendi rağmen ile uygun ligandlar Cu(I) ve dikkatli kullanım özellikleri ile RNA bozulması önemli ölçüde, azalır. AB ve deneysel örneklerinde 4SU değiştirme oranları ve % 1,18 %0,46, sırasıyla vardır (veri gösterilmez). 2.000 uzunluğu ile bozulmamış RNA’ların için nt, RNA’ların ~ %90 içeren en az bir AB ve bir 4SU. 1.000 uzunluğu ile kısmen bozulmuş RNA’ların için nt, RNA’ların ~ %70 içere…
The authors have nothing to disclose.
Bu eser Ulusal Doğal Bilim Vakfı, Çin hibe 91753206, 21425204 ve 21521003 ve ulusal anahtar araştırma ve geliştirme projesi 2016YFA0501500 tarafından desteklenmektedir.
HeLa | ATCC | ||
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Thermo Fisher Scientific | 11995065 | |
FBS (Fetal Bovine Serum) | Thermo Fisher Scientific | 10099141 | |
Penicillin & Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
EU (5-ethynyl uridine) | Wuhu Huaren Co. | CAS:69075-42-9 | |
4SU (4-thiouridine) | Sigma Aldrich | T4509 | |
10×PBS (Phosphate-Buffered Saline) | Thermo Fisher Scientific | AM9625 | |
UV cross-linker | UVP | CL-1000 | Equiped with 365-nm UV lamp |
DEPC (Diethyl pyrocarbonate) | Sigma Aldrich | D5758 | To treat water. Highly toxic! |
Tris·HCl, pH 7.5 | Thermo Fisher Scientific | 15567027 | |
LiCl | Sigma Aldrich | 62476 | |
Nonidet P-40 | Biodee | 74385 | |
EDTA-free protease inhibitor cocktail | Thermo Fisher Scientific | 88265 | One tablet for 50 mL lysis buffer. |
LDS (Lithium dodecyl sulfate) | Sigma Aldrich | L9781 | |
15-mL ultrafiltration tube (10 kDa cutoff) | Millipore | UFC901024 | |
0.5-mL ultrafiltration tube (10 kDa cutoff) | Millipore | UFC501096 | |
Streptavidin magnetic beads | Thermo Fisher Scientific | 88816 | |
DMSO (Dimethyl sulfoxide) | Sigma Aldrich | 41639 | |
Azide-biotin | Click Chemistry Tools | AZ104 | |
Copper(II) sulfate | Sigma Aldrich | C1297 | |
THPTA [Tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl)amine] | Sigma Aldrich | 762342 | |
Sodium ascorbate | Sigma Aldrich | 11140 | |
Azide-Cy5 | Click Chemistry Tools | AZ118 | |
LDS sample buffer (4×) | Thermo Fisher Scientific | NP0008 | |
10% bis-Tris gel | Thermo Fisher Scientific | NP0301BOX | |
EDTA | Thermo Fisher Scientific | AM9260G | |
RNase A | Sigma Aldrich | R6513 | |
SDS (Sodium dodecyl sulfate) | Thermo Fisher Scientific | 15525017 | |
NaCl | Sigma Aldrich | S3014 | |
Brij-97 [Polyoxyethylene (20) oleyl ether] | J&K | 315442 | |
Triethanolamine | Sigma Aldrich | V900257 | |
Streptavidin agarose | Thermo Fisher Scientific | 20353 | |
Urea | Sigma Aldrich | U5378 | |
Sarkosyl (N-Lauroylsarcosine sodium salt) | Sigma Aldrich | 61743 | |
Biotin | Sigma Aldrich | B4501 | |
Sodium deoxycholate | Sigma Aldrich | 30970 | |
MaxQuant | Version: 1.5.5.1 |