JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Biochemistry

Opsamling og identifikation af RNA-bindende proteiner ved hjælp af klik kemi-assisteret RNA-interactome Capture (CARIC) strategi

Published: October 19, 2018
doi:
10.3791/58580
, , ,
1College of Chemistry and Molecular Engineering,Peking University, 2Beijing National Laboratory for Molecular Sciences,Peking University, 3Peking-Tsinghua Center for Life Sciences,Peking University, 4Synthetic and Functional Biomolecules Center,Peking University, 5Key Laboratory of Bioorganic Chemistry and Molecular Engineering of Ministry of Education,Peking University

Summary

En detaljeret protokol for at anvende den Klik kemi-assisteret RNA-interactome capture (CARIC) strategi for at identificere proteiner bindende til begge kodning og noncoding RNA’er præsenteres.

Abstract

En omfattende identifikation af RNA-bindende proteiner (RBPs) er nøglen til at forstå den posttranskriptionelle regulerende netværk i cellerne. En udbredte strategi for RBP capture udnytter polyadenylation [poly(A)] af target RNA’er, som for det meste opstår på eukaryote modne mRNAs, forlader de fleste bindende proteiner af non-poly(A) RNA’er uidentificerede. Her beskriver vi de detaljerede procedurer i en nyligt rapporterede metode kaldes Klik kemi-assisteret RNA-interactome capture (CARIC), som muliggør transkriptom-wide erobringen af både poly(A) og non-poly(A) RBPs ved at kombinere den metaboliske mærkning af RNA’er, i vivo UV cross-linking og bioorthogonal tagging.

Introduction

Det menneskelige genom er transskriberet i forskellige typer af kodning og noncoding RNA’er (klarlægning), herunder mRNAs, rRNAs, tRNAer, små nukleare RNA’er (snRNAs), lille nucleolar RNA’er (snoRNAs) og længe ikke-kodende RNA’er (lncRNAs)1. De fleste af disse RNA’er besidder tøj af RBPs og fungere som ribonucleoprotein partikler (RNPs)2. En omfattende identifikation af RBPs er derfor en forudsætning for at forstå den regulerende netværk mellem RNA’er og RBPs, som er impliceret i forskellige menneskelige sygdomme3,4,5.

De sidste par år har været vidne til et stort løft af RBPs opdaget i forskellige eukaryote systemer2,6, herunder menneskelige7,8,9,10,11, musen12,13,14, gær9,15,16, zebrafisk17, Drosophila melanogaster18,19 , Caenorhabditis elegans16, Arabidopsis thaliana20,21,22, og menneskelige parasitter23,24,25 . Disse fremskridt har været lettet ved en RBP capture strategi udviklet af Castello et al. 7 og Baltz et al. 8 i 2012, som kombinerer i vivo UV cross-linking af RNA og dens interagerende proteiner, oligo(dT) opsamling af poly(A) RNA’er og massespektrometri (MS)-baseret proteom profilering. I betragtning af, at poly(A) overvejende findes på modne mRNAs, som tegner sig for kun ~ 3% – 5% af eukaryote transkriptom26, er denne udbredte strategi imidlertid ikke i stand til at indfange RBPs interagerer med non-poly(A) RNA’er, herunder de fleste klarlægning og pre-mRNAs.

Her, rapportere vi de detaljerede procedurer for en nyligt udviklede strategi for transkriptom-wide erobringen af både poly(A) og non-poly(A) RBPs27. Betegnes CARIC, denne strategi kombinerer i vivo UV cross-linking og metaboliske mærkning af RNA’er med photoactivatable og “klikkes” nucleoside analoger (som indeholder en bioorthogonal funktionelle gruppe, der kan deltage i klik reaktion), 4 – thiouridine (4SU), og 5-ethynyluridine (EU). Trin, der er nøglen til at få ideelle resultater med den CARIC strategi er effektiv metaboliske mærkning, UV cross-linking og klik reaktion og vedligeholdelse af RNA integritet. Fordi Cu(I) brugt som katalysator i klik reaktion kan forårsage fragmentering af RNA’er, er en Cu(I) ligand, der kan reducere RNA fragmentering afgørende. Vi beskriver, hvordan du udføre effektiv Klik reaktioner i cellelysater uden at forårsage alvorlige RNA nedbrydning.

Selv om RBP fange og identifikation i HeLa celler kun er beskrevet i denne protokol, kan den CARIC strategi anvendes til forskellige celletyper og eventuelt levende organismer. Udover RBP capture giver denne protokol også strømlinet trinvise procedurer for MS prøveforberedelsen og protein identifikation og kvantificering, som kan være nyttige for dem, der ikke er bekendt med proteom eksperimenter.

Protocol

Forsigtig: Når det er relevant, de reagenser skal købes i form af RNase-fri, eller opløst i RNase-fri, opløsningsmidler (i de fleste tilfælde, i diethylether pyrocarbonate (DEPC)-behandlet vand). Når du håndterer RNA prøver og RNase-fri reagenser, altid bære handsker og masker, og ændre dem ofte for at undgå RNase forurening. 1. forberedelse af Lysate af metabolisk mærket og UV krydsbundet celler Metaboliske indarbejdelse af EU og 4SU Kultur He…

Representative Results

De repræsentative resultater af kvalitetskontrol trin præsenteres. Resultaterne inkluderer tal i-gel fluorescens analyse beskrevet taktfast 2.3.2 (figur 1), western blot analysen beskrevet taktfast 4.1.3 (figur 2A) og sølv-farvning analysen beskrevet taktfast 4.2.2 (figur 2B). Kvalitetskontrol trin er kritisk for optimering af CARIC protokoller. Altid medtage kvalitetskontrol i forberedelsen af RB…

Discussion

Vedligeholdelse af fair RNA integritet er en af nøglerne til succes CARIC eksperimenter. Med passende ligander af Cu(I) og forsigtig drift, kan RNA nedbrydning reduceres betydeligt, selv om delvis nedbrydning blev observeret. Substitution forhold mellem EU og 4SU i eksperimentelle prøver er 1,18% og 0,46%, henholdsvis (data ikke vist). For intakte RNA’er med en længde på 2.000 nt, ~ 90% af RNA’er indeholder mindst én EU og en 4SU. For delvist nedbrudte RNA’er med en længde på 1.000 nt, ~ 70% af RNA’er indeholder m…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbejde er støttet af den National Natural Science Foundation i Kina tilskud 91753206, 21425204, og 21521003 og af den nationale nøgle forsknings- og udviklingsprojekt 2016YFA0501500.

Materials

HeLa ATCC
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) Thermo Fisher Scientific 11995065
FBS (Fetal Bovine Serum) Thermo Fisher Scientific 10099141
Penicillin & Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122
EU (5-ethynyl uridine) Wuhu Huaren Co. CAS:69075-42-9
4SU (4-thiouridine) Sigma Aldrich T4509
10×PBS (Phosphate-Buffered Saline) Thermo Fisher Scientific AM9625
UV cross-linker UVP CL-1000 Equiped with 365-nm UV lamp
DEPC (Diethyl pyrocarbonate) Sigma Aldrich D5758 To treat water. Highly toxic!
Tris·HCl, pH 7.5 Thermo Fisher Scientific 15567027
LiCl Sigma Aldrich 62476
Nonidet P-40 Biodee 74385
EDTA-free protease inhibitor cocktail Thermo Fisher Scientific 88265 One tablet for 50 mL lysis buffer.
LDS (Lithium dodecyl sulfate) Sigma Aldrich L9781
15-mL ultrafiltration tube (10 kDa cutoff) Millipore UFC901024
0.5-mL ultrafiltration tube (10 kDa cutoff) Millipore UFC501096
Streptavidin magnetic beads Thermo Fisher Scientific 88816
DMSO (Dimethyl sulfoxide) Sigma Aldrich 41639
Azide-biotin Click Chemistry Tools AZ104
Copper(II) sulfate Sigma Aldrich C1297
THPTA [Tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl)amine] Sigma Aldrich 762342
Sodium ascorbate Sigma Aldrich 11140
Azide-Cy5 Click Chemistry Tools AZ118
LDS sample buffer (4×) Thermo Fisher Scientific NP0008
10% bis-Tris gel Thermo Fisher Scientific NP0301BOX
EDTA Thermo Fisher Scientific AM9260G
RNase A Sigma Aldrich R6513
SDS (Sodium dodecyl sulfate) Thermo Fisher Scientific 15525017
NaCl Sigma Aldrich S3014
Brij-97 [Polyoxyethylene (20) oleyl ether] J&K 315442
Triethanolamine Sigma Aldrich V900257
Streptavidin agarose Thermo Fisher Scientific 20353
Urea Sigma Aldrich U5378
Sarkosyl (N-Lauroylsarcosine sodium salt) Sigma Aldrich 61743
Biotin Sigma Aldrich B4501
Sodium deoxycholate Sigma Aldrich 30970
MaxQuant Version: 1.5.5.1
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Djebali, S., et al. Landscape of transcription in human cells. Nature. 489 (7414), 101-108 (2012).
  2. Gerstberger, S., Hafner, M., Tuschl, T. A census of human RNA-binding proteins. Nature Reviews Genetics. 15 (12), 829-845 (2014).
  3. Castello, A., Fischer, B., Hentze, M. W., Preiss, T. RNA-binding proteins in Mendelian disease. Trends in Genetics. 29 (5), 318-327 (2013).
  4. Nussbacher, J. K., Batra, R., Lagier-Tourenne, C., Yeo, G. W. RNA-binding proteins in neurodegeneration: Seq and you shall receive. Trends in Neuroscience. 38 (4), 226-236 (2015).
  5. Jazurek, M., Ciesiolka, A., Starega-Roslan, J., Bilinska, K., Krzyzosiak, W. J. Identifying proteins that bind to specific RNAs – focus on simple repeat expansion diseases. Nucleic Acids Research. 44 (19), 9050-9070 (2016).
  6. Hentze, M. W., Castello, A., Schwarzl, T., Preiss, T. A brave new world of RNA-binding proteins. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (5), 327-341 (2018).
  7. Castello, A., et al. Insights into RNA biology from an atlas of mammalian mRNA-binding proteins. Cell. 149 (6), 1393-1406 (2012).
  8. Baltz, A. G., et al. The mRNA-bound proteome and its global occupancy profile on protein-coding transcripts. Molecular Cell. 46 (5), 674-690 (2012).
  9. Beckmann, B. M., et al. The RNA-binding proteomes from yeast to man harbour conserved enigmRBPs. Nature Communications. 6, 10127-10135 (2015).
  10. Conrad, T., et al. Serial interactome capture of the human cell nucleus. Nature Communications. 7, 11212-11222 (2016).
  11. Castello, A., et al. Comprehensive identification of RNA-binding domains in human cells. Molecular Cell. 63 (4), 696-710 (2016).
  12. Kwon, S. C., et al. The RNA-binding protein repertoire of embryonic stem cells. Nature Structural & Molecular Biology. 20 (9), 1122-1130 (2013).
  13. Liepelt, A., et al. Identification of RNA-binding proteins in macrophages by interactome capture. Molecular & Cellular Proteomics. 15 (8), 2699-2714 (2016).
  14. Liao, Y., et al. The cardiomyocyte RNA-binding proteome: Links to intermediary metabolism and heart disease. Cell Reports. 16 (5), 1456-1469 (2016).
  15. Mitchell, S. F., Jain, S., She, M. P., Parker, R. Global analysis of yeast mRNPs. Nature Structural & Molecular Biology. 20 (1), 127-133 (2013).
  16. Matia-González, A. M., Laing, E. E., Gerber, A. P. Conserved mRNA-binding proteomes in eukaryotic organisms. Nature Structural & Molecular Biology. 22 (12), 1027-1033 (2015).
  17. Despic, V., et al. Dynamic RNA-protein interactions underlie the zebrafish maternal-to-zygotic transition. Genome Research. 27 (7), 1184-1194 (2017).
  18. Wessels, H. H., et al. The mRNA-bound proteome of the early fly embryo. Genome Research. 26 (7), 1000-1009 (2016).
  19. Sysoev, V. O., et al. Global changes of the RNA-bound proteome during the maternal-to-zygotic transition in Drosophila. Nature Communications. 7, 12128 (2016).
  20. Reichel, M., et al. In planta determination of the mRNA-binding proteome of Arabidopsis etiolated seedlings. Plant Cell. 28 (10), 2435-2452 (2016).
  21. Marondedze, C., Thomas, L., Serrano, N. L., Lilley, K. S., Gehring, C. The RNA-binding protein repertoire of Arabidopsis thaliana. Scientific Reports. 6, 29766-29778 (2016).
  22. Zhang, Z., et al. UV crosslinked mRNA-binding proteins captured from leaf mesophyll protoplasts. Plant Methods. 12, 42-53 (2016).
  23. Bunnik, E. M., et al. The mRNA-bound proteome of the human malaria parasite Plasmodium falciparum. Genome Biology. 17, 147-164 (2016).
  24. Lueong, S., Merce, C., Fischer, B., Hoheisel, J. D., Erben, E. D. Gene expression regulatory networks in Trypanosoma brucei: insights into the role of the mRNA-binding proteome. Molecular Microbiology. 100 (3), 457-471 (2016).
  25. Nandan, D., et al. Comprehensive identification of mRNA-binding proteins of Leishmania donovani by interactome capture. PLoS ONE. 12 (1), e0170068 (2017).
  26. Jankowsky, E., Harris, M. E. Specificity and nonspecificity in RNA-protein interactions. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (9), 533-544 (2015).
  27. Huang, R., Han, M., Meng, L., Chen, X. Transcriptome-wide discovery of coding and noncoding RNA-binding proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (17), E3879-E3887 (2018).
  28. Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nature Protocols. 1 (6), 2856-2860 (2006).
  29. Boersema, P. J., Raijmakers, R., Lemeer, S., Mohammed, S., Heck, A. J. R. Multiplex peptide stable isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics. Nature Protocols. 4 (4), 484-494 (2009).
  30. Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips. Nature Protocols. 2 (8), 1896-1906 (2007).
  31. Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).
  32. Ritchie, M. E., et al. limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies. Nucleic Acids Research. 43 (7), e47 (2015).
  33. Grammel, M., Hang, H., Conrad, N. K. Chemical reporters for monitoring RNA synthesis and poly(A) tail dynamics. ChemBioChem. 13 (8), 1112-1115 (2012).
  34. Curanovic, D., et al. Global profiling of stimulus-induced polyadenylation in cells using a poly(A) trap. Nature Chemical Biology. 9 (11), 671-673 (2013).
  35. Zheng, Y. X., Beal, P. A. Synthesis and evaluation of an alkyne-modified ATP analog for enzymatic incorporation into RNA. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 26 (7), 1799-1802 (2016).
  36. Nainar, S., et al. Metabolic incorporation of azide functionality into cellular RNA. ChemBioChem. 17 (22), 2149-2152 (2016).
  37. Bao, X., et al. Capturing the interactome of newly transcribed RNA. Nature Methods. 15 (3), 213-220 (2018).
  38. Holmqvist, E., Vogel, J. RNA-binding proteins in bacteria. Nature Reviews Microbiology. , (2018).

Tags

RNA-binding ProteinsCARICClick ChemistryRNA-interactome CapturePost-transcriptional Gene RegulationMRNANon-coding RNAHeLa CellsEU4SUUV Cross-linkingCell LysisRNA-protein Interaction

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Huang, R., Han, M., Meng, L., Chen, X. Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) Strategy. J. Vis. Exp. (140), e58580, doi:10.3791/58580 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image