Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biochemistry

Opsamling og identifikation af RNA-bindende proteiner ved hjælp af klik kemi-assisteret RNA-interactome Capture (CARIC) strategi

doi: 10.3791/58580 Published: October 19, 2018
* These authors contributed equally

Summary

En detaljeret protokol for at anvende den Klik kemi-assisteret RNA-interactome capture (CARIC) strategi for at identificere proteiner bindende til begge kodning og noncoding RNA'er præsenteres.

Abstract

En omfattende identifikation af RNA-bindende proteiner (RBPs) er nøglen til at forstå den posttranskriptionelle regulerende netværk i cellerne. En udbredte strategi for RBP capture udnytter polyadenylation [poly(A)] af target RNA'er, som for det meste opstår på eukaryote modne mRNAs, forlader de fleste bindende proteiner af non-poly(A) RNA'er uidentificerede. Her beskriver vi de detaljerede procedurer i en nyligt rapporterede metode kaldes Klik kemi-assisteret RNA-interactome capture (CARIC), som muliggør transkriptom-wide erobringen af både poly(A) og non-poly(A) RBPs ved at kombinere den metaboliske mærkning af RNA'er, i vivo UV cross-linking og bioorthogonal tagging.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Det menneskelige genom er transskriberet i forskellige typer af kodning og noncoding RNA'er (klarlægning), herunder mRNAs, rRNAs, tRNAer, små nukleare RNA'er (snRNAs), lille nucleolar RNA'er (snoRNAs) og længe ikke-kodende RNA'er (lncRNAs)1. De fleste af disse RNA'er besidder tøj af RBPs og fungere som ribonucleoprotein partikler (RNPs)2. En omfattende identifikation af RBPs er derfor en forudsætning for at forstå den regulerende netværk mellem RNA'er og RBPs, som er impliceret i forskellige menneskelige sygdomme3,4,5.

De sidste par år har været vidne til et stort løft af RBPs opdaget i forskellige eukaryote systemer2,6, herunder menneskelige7,8,9,10,11, musen12,13,14, gær9,15,16, zebrafisk17, Drosophila melanogaster18,19 , Caenorhabditis elegans16, Arabidopsis thaliana20,21,22, og menneskelige parasitter23,24,25 . Disse fremskridt har været lettet ved en RBP capture strategi udviklet af Castello et al. 7 og Baltz et al. 8 i 2012, som kombinerer i vivo UV cross-linking af RNA og dens interagerende proteiner, oligo(dT) opsamling af poly(A) RNA'er og massespektrometri (MS)-baseret proteom profilering. I betragtning af, at poly(A) overvejende findes på modne mRNAs, som tegner sig for kun ~ 3% - 5% af eukaryote transkriptom26, er denne udbredte strategi imidlertid ikke i stand til at indfange RBPs interagerer med non-poly(A) RNA'er, herunder de fleste klarlægning og pre-mRNAs.

Her, rapportere vi de detaljerede procedurer for en nyligt udviklede strategi for transkriptom-wide erobringen af både poly(A) og non-poly(A) RBPs27. Betegnes CARIC, denne strategi kombinerer i vivo UV cross-linking og metaboliske mærkning af RNA'er med photoactivatable og "klikkes" nucleoside analoger (som indeholder en bioorthogonal funktionelle gruppe, der kan deltage i klik reaktion), 4 - thiouridine (4SU), og 5-ethynyluridine (EU). Trin, der er nøglen til at få ideelle resultater med den CARIC strategi er effektiv metaboliske mærkning, UV cross-linking og klik reaktion og vedligeholdelse af RNA integritet. Fordi Cu(I) brugt som katalysator i klik reaktion kan forårsage fragmentering af RNA'er, er en Cu(I) ligand, der kan reducere RNA fragmentering afgørende. Vi beskriver, hvordan du udføre effektiv Klik reaktioner i cellelysater uden at forårsage alvorlige RNA nedbrydning.

Selv om RBP fange og identifikation i HeLa celler kun er beskrevet i denne protokol, kan den CARIC strategi anvendes til forskellige celletyper og eventuelt levende organismer. Udover RBP capture giver denne protokol også strømlinet trinvise procedurer for MS prøveforberedelsen og protein identifikation og kvantificering, som kan være nyttige for dem, der ikke er bekendt med proteom eksperimenter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Forsigtig: Når det er relevant, de reagenser skal købes i form af RNase-fri, eller opløst i RNase-fri, opløsningsmidler (i de fleste tilfælde, i diethylether pyrocarbonate (DEPC)-behandlet vand). Når du håndterer RNA prøver og RNase-fri reagenser, altid bære handsker og masker, og ændre dem ofte for at undgå RNase forurening.

1. forberedelse af Lysate af metabolisk mærket og UV krydsbundet celler

  1. Metaboliske indarbejdelse af EU og 4SU
    1. Kultur HeLa celler i Dulbeccos modificerede Eagle Medium (DMEM) suppleret med 10% føtal bovint serum (FBS), 100 U/mL penicillin og 100 μg/mL streptomycin ved 37 ° C i 5% CO2 atmosfære. Kultur ~ 4 x 107 HeLa celler (i to 15-cm retter) for at forberede en eksperimenterende eller kontrollere prøven for en standard MS køre.
    2. Når de kulturperler HeLa celler når ~ 80% sammenløb, fjerne næringssubstratet og tilføje 15 mL af forvarmet frisk medium pr. 15-cm parabol.
    3. Tilføj 15 μl pr. fad 100 mm EU (opløst i fosfatbufferet saltopløsning (PBS)) til en endelig koncentration på 1 mM og 7,5 μL per parabol af 100 mM 4SU (opløst i PBS) til en endelig koncentration på 0,5 mM til eksperimenterende og noUV-kontrolprøver. Tilføje 15 μl pr. fad 100 mm EU (opløst i PBS) til en endelig koncentration på 1 mM for no4SU-kontrolprøver.
      Bemærk: 4SU er foto-activatable; beskyttelse mod lys efter tilsætning af 4SU er således påkrævet.
    4. Dække retter med folie og kultur celler for 16 h. Tilføj halvdelen af mængden af EU og 4SU eller kun EU fra trin 1.1.3 til den eksperimentelle, noUV- og no4SU-kontrolprøver, henholdsvis, og fortsat dyrkning til en anden 2 h.
  2. In vivo UV tværbinding
    1. Fjern næringssubstratet, vaske cellerne 3 x med 5 mL PBS pr parabol, og fjern rester PBS så meget som muligt.
      Bemærk: Rester flydende vil reducere tværbindingsmidler effektivitet.
    2. For eksperimenterende og no4SU-kontrolprøver, placere retterne på isen med låget fjernes og bestråle cellerne med 365-nm UV-lys på 2 J/cm2 af en UV tværs linker.
    3. For noUV-kontrolprøver, placere retterne på is og beskytte dem mod lys.
      Bemærk: Alle følgende trin for noUV-kontrolprøver bør udføres i et mørkelagt rum.
  3. Celle lysis og homogenisering
    1. Der tilsættes 1 mL pr parabol af pre lysisbuffer (10 mM Tris∙HCl, pH 7,5, 50 mM LiCl, 0,02% Nonidet P-40 og ethylendiamintetra syre (EDTA)-gratis protease hæmmer cocktail) til cellerne. Skrab celler ved hjælp af en gummi cellen løfteren og indsamle pre lysis suspension i en 15mL tube.
      Bemærk: Dette trin vil bryde cellemembranen og frigive opløselige cytoplasmatisk proteiner og RNA'er. Må ikke centrifugeres røret og Fjern supernatanten.
    2. Regulér lydstyrken til 6 mL ved at tilføje pre lysisbuffer for suspension fra to 15-cm retter. Tilføje til pre lysis suspension et lige saa stort volumen af R-lysisbuffer (200 mM Tris∙HCl, pH 7,5, 500 mM LiCl, 2% lithium dodecyl sulfat [LDS]).
    3. Homogeniseres cellen lysate ved, at det gennem en sprøjte med en smal nål (27-G) flere gange indtil den lysate er klart og homogent. Inkubér lysate ved 4 ° C med blide rotation (~ 15 rpm) i 1 time.
      Bemærk: Dette sidste trin kan den komplette denaturering af proteiner. Den lysate kan sikkert opbevares ved-70 ° C i op til en måned.
  4. Forberedelse til Klik reaktion
    1. Fortynd den lysate ved at tilføje 20 bind af fortynding buffer (50 mM Tris∙HCl, pH 7,5) og opdele den i 15 mL fraktioner.
      Bemærk: Løsninger indeholder en høj koncentration af salt og rengøringsmiddel vil kompromittere effektiviteten af Cu (I)-katalyseret Klik reaktion; således skal buffer på den lysate ændres.
    2. Koncentrere hver fraktion ved hjælp af en 15 mL ultrafiltrering tube (med en molekylevægt cutoff af 10 kDa), indtil volumen er mindre end 1 mL. Bruge en svinge spanden rotoren til at dreje ultrafiltrering røret på 4.000 x g ved 4 ° C for ~ 15 min.
    3. Tilføje 14 mL fortynding buffer til den koncentrerede lysate fraktion og Gentag trin 1.4.2. Kombinere fraktioner og koncentrere dem til et volumen på 6 mL af ultrafiltrering (4.000 x g ved 4 ° C for ~ 15 min).
      Bemærk: De fleste af salt og LDS vil nu blive fjernet, så den lysate er klar til Klik reaktion. Den lysate kan opbevares ved-70 ° C i op til en uge. Undgå flere fryse-tø cykler, fordi de vil resultere i betydelige RNA nedbrydning. Alikvot lysate hvis små beskrivelser er påkrævet.

2. forberedelse af proever til RNA-interactome Capture

  1. Preclearing af den lysate
    1. Tilføje 100 μL streptavidin magnetiske perler pr. 6 mL af lysate, og forsigtigt dreje (~ 15 rpm) i 30 min. ved stuetemperatur til at fjerne naturligvis biotinylated proteiner.
    2. Pellet perlerne ved hjælp af en magnet (for ~ 20 min. ved 4 ° C) og overførsel af precleared lysate til en ny tube.
  2. Udførelsen af klik reaktion
    1. Forberede mastermix: 6,5 μL af biotin stock (100 mM indeholder-biotin opløst i dimethylsulfoxid [DMSO] i en endelig koncentration på 100 μM), 3.25 μL af kobber stock (gøre det friske; 1 M CuSO4 opløst i vand i en endelig koncentration på 500 μM) , 65 μL af ligand stock (200 mM THPTA opløst i vand i en endelig koncentration på 2 mM), og 262.75 μL af H2O.
      Bemærk: THPTA står for Tris [(1-hydroxypropyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl) methyl] Amin.
    2. Tilføje mastermix til 6 mL af precleared lysate og bland godt. Derefter tilføje 162,5 μl for at mindske reagens (gøre det friske; 40 mg/mL natrium Ascorbat i en endelig koncentration 5 mM) til de lysate og bland godt. Den endelige rumfang bør 6,5 mL.
    3. Inkuber reaktionsblandingen i 2 timer ved stuetemperatur på en orbitalryster (800 rpm). Tilføj 5 mM EDTA til reaktionsblandingen og Inkuber det i 5 min til at slukke reaktionen.
  3. Små beskrivelser
    1. Forberede mastermix som i trin 2.2.1 med biotin stock erstattet af farvestof materiel (f.eks.100 mM indeholder-Cy5 opløst i DMSO).
      Bemærk: Beløbet reagens skal justeres efter volumen af lysate. Typisk, en 20-μL alikvot af den lysate er nok beskrivelser som en i-gel fluorescens analyse.
    2. Tilføje reaktion mix til den lysate og der inkuberes i 2 timer ved stuetemperatur. Derefter skal du føje en tredjedel af mængden af LDS prøvebuffer (4 x), denaturere det ved 55 ° C i 5 min, og løse prøve på et 10% bis-Tris gel.
      Bemærk: For at bekræfte fluorescens signal præsenteres på RNA'er, omfatte kontrol med RNase A fordøjelsen efter klik reaktion.
  4. Oprydning af reaktionsblandingen
    1. Tilføje otte bind prechilled methanol (100%) til slukkes reaktionsblandingen og Inkuber i 30 min. ved 30 ° C for nedbør. Udføre Nedbøren i 50 mL konisk centrifugeglas.
      Bemærk: Hvis den samlede mængde er større end 50 mL, opdele reaktionsmiljøet i to 50 mL konisk centrifugeglas.
    2. Forberede rekonstitution buffer: Kombiner 1 rumfang buffer A (4% sodium dodecyl sulfat [SDS] og 10 mM EDTA) med otte bind af buffer B (1% Annemette-97, 150 mM NaCl og 50 mM triethanolamin, pH 7,4).
    3. Der centrifugeres ved 4.000 x g i 15 min. ved 4 ° C, og supernatanten. Tilføje ~ 1-2 mL prechilled methanol til pellet. Pipetteres op og ned til at bryde pelleten og sikre pelleten er helt suspenderet med ingen synlige klumper. Fyld glasset med prechilled methanol. Gentag dette trin 2 x.
    4. Der centrifugeres ved 4.000 x g i 15 min. ved 4 ° C, og supernatanten. Lagt ryg rør og centrifugeres igen på 4.000 x g i 5 min. forsigtigt trække ud de resterende methanol så meget som muligt uden at forstyrre pelleten.
    5. Der tilsættes 10 mL af rekonstitution buffer til pellet. Pipetteres op og ned for at opløse pelleten. Der centrifugeres ved 4.000 x g i 10 min. ved 4 ° C.
    6. Overføre supernatanten til en ny tube. Indsamle 20 μL af prøven for kvalitetskontrol (Se afsnit 4).
      Bemærk: Nu, prøven er klar til RNA-interactome capture. Rekonstitueret prøven kan opbevares ved-70 ° C i op til en uge.

3. RNA-interactome Capture

  1. Forberedelse af streptavidin-Agarosen perler
    1. Tage 1.600 μL af streptavidin-Agarosen gylle (800 μL af fastboende perler) pr. 10 mL af rekonstitueret prøve i en 15 mL konisk centrifugeglas.
    2. Spin ned perler på 4000 x g for 5 min. Fjern forsigtigt supernatanten uden at forstyrre de udlignede perler.
    3. Vask perler med 10 mL 50 mm Tris∙HCl (pH 7,5). Spin ned perler (4.000 x g for 5 min) og Fjern supernatanten. Gentag dette trin 2 x.
  2. Affinitet pulldown
    1. Overføre den rensede og rekonstituerede prøve fra trin 2.4.6 til streptavidin-Agarosen perler (Se trin 3.1). Der inkuberes natten over med blide rotation ved 4 ° C.
  3. Vask af streptavidin perler
    1. Spin ned perler (4.000 x g for 5 min) og overføre supernatanten til en ny tube. Indsamle 20 μL af prøven for kvalitetskontrol.
    2. Vask perler med 10 mL af vaskebuffer en (2% SDS i PBS, pH 7,4). Der inkuberes i 10 min med blide rotation (~ 12 rpm) ved stuetemperatur. Spin ned perler (4.000 x g for 5 min) og Fjern supernatanten. Gentag 1 x.
    3. Gentag trin 3.3.2 med vaskebuffer B (8 M urinstof og 250 mM NH4HCO3 opløst i vand). Gentag trin 3.3.2 med vaskebuffer C (2,5 M NaCl i PBS, pH 7,4). Derefter vask perler med 10 mL 50 mm Tris∙HCl (pH 7,5). Spin ned perler (4.000 x g for 5 min) og Fjern supernatanten.
    4. Delt perlerne og overføre dem til to 1,5 mL microcentrifuge rør.
  4. Eluering af de erobrede RNPs
    1. Forberede biotin eluering buffer: 12,5 mM biotin, 75 mM NaCl, 7.5 mM Tris∙HCl (pH 7,5), 1,5 mM EDTA, 0,15% SDS, 0.075% sarkosyl og 0,02% natrium deoxycholate.
      Bemærk: Butikken buffer ved stuetemperatur, til biotin kan udfældes ved 4 ° C.
    2. 400 μL af vasket udlignede perler, tilføje 400 μL af biotin eluering buffer.
    3. Inkuber dem på en orbitalryster (1.500 rpm) ved stuetemperatur i 20 min. Derefter inkuberes på en orbitalryster med en varme blok (1.500 rpm, 65 ° C) til 10 min. Spin ned perler (7.800 x g til 1 min) og indsamle de eluted RNP.
    4. Perler, tilføje 400 μL af frisk biotin eluering buffer og Gentag trin 3.4.3. Kombinere de to eluerer ind i en 15 mL rør.
  5. RNase fordøjelsen
    1. Tilføje tre bind af fortynding buffer til den eluted RNP at mindske koncentrationen af SDS. Koncentrere den fortyndede prøve ved hjælp af en 0,5 mL ultrafiltrering tube (med en molekylevægt cutoff af 10 kDa; spin på 12.000 x g ved 4 ° C for ~ 30 min) til ~ 40 μL.
    2. Tilsæt 0,5 μg/μL RNase A og inkuberes i 2 timer ved 37 ° C til at frigive RBPs fra krydsbundet RNA'er. Indsamle 2 μl af RBPs for kvalitetskontrol (Se afsnit 4).

4. kvalitetskontrol

  1. Kontrol af effektiviteten af affinitet pulldown
    1. Tage 10 μL af "før-pulldown" prøven fra trin 2.4.6 og 10 μl af "efter-pulldown" prøven fra trin 3.3.1.
    2. Analysere prøverne ved hjælp af standard vestlige skamplet procedurer (10% bis-Tris gel).
    3. Pletten polyvinylidene fluorid (PVDF) membran med streptavidin-HRP konjugat til overvågning af restkoncentrationer biotin signaler i eksemplet "efter-pulldown".
      Bemærk: Hvis biotin signal om "efter-pulldown" prøven er større end en femtedel af signalet fra "før-pulldown" prøven, øge mængden af streptavidin-Agarosen perler bruges i trin 3.1.1.
  2. Kontrol af den samlede fangst effektivitet
    1. Tage 2 μl af frigivne RBP prøven fra trin 3.5.2 og 0,5 μl af eksemplet "før-pulldown" (som 0,1% input) fra trin 2.4.6.
    2. Analysere prøverne ved hjælp af standard sølv-farvning procedurer.
      1. Fix gel med fiksering buffer (ethanol 40%, 10% eddikesyre) i 20 min. efterfulgt af overfølsomhed (13 mM Na2S2O3, 83 mM natriumacetat, 30% ethanol) i 30 min.
      2. Vaske gel 3 x med vand i 5 min og derefter, bejdse det med en 15 mM AgNO3 løsning i 20 min. Skyl gel 2 x med vand til 1 min, udvikle det i 0,24 M Na2CO3 og 0,012% formaldehyd, og afslutte med 45 mM EDTA, når farvning er suffici ENT.
        Bemærk: Sølv-farvning intensiteten af de erobrede RBPs bør svarer til 0,1% input.

5. forberedelse af prøverne til MS

  1. I-gel trypsin fordøjelsen af erobrede RBPs 28
    1. Tilføje en fjerdedel volumen af SDS prøvebuffer (5 x) til de frigivne RBP prøver fra trin 3.5.2. Denaturere prøve ved 95 ° C i 10 min.
    2. Løse RBPs på en 1,5 mm 10% SDS-polyacrylamid gel.
    3. Pletten gel med sølv, følgende standardprotokoller.
    4. Punktafgifter lane eksperimentel prøve eller kontrolprøve med stabling gel og den store band af RNase en (~ 15 kDa) fjernet.
    5. Skær den skåret lane i små stykker (~ 1-1,5 mm x ~ 1-1,5 mm).
      Bemærk: Den korteste kanten af gel stykke bør være ikke kortere end 1 mm til at forhindre tilstopning i pipette tips.
    6. Overføre gel stykker til et microcentrifuge rør og destain med affarvning buffer (en blanding af lige store mængder af 100 mM Na2S2O3 og 30 mM K3[Fe(CN)6]).
    7. Vaske gel stykker med 200 mM ammoniumbicarbonat (ABC), indtil gel stykkerne er helt farveløse.
    8. Dehydrere gel stykkerne i 1 mL af pæn acetonitril (ACN). Rehydrere med 200 μl af 10 mM dithiothreitol (opløst i 50 mM ABC) og inkuberes ved 56 ° C i 45 min.
      Bemærk: Helt dehydreret gel stykker bør være meget hårdt og uigennemsigtig. Hvis gel stykker er stadig bløde efter dehydrering, fjerne ACN og tilsættes 1 mL af pæn ACN at dehydrere igen.
    9. Køle gel stykker til stuetemperatur. Tilføje 200 μl af 58 mM iodoacetamide (opløst i 50 mM ABC) og inkuberes ved stuetemperatur i 45 min. i mørke.
    10. Efter en kort vask med vand, dehydrere gel stykker i 1 mL af pæn ACN.
      Bemærk: Gel stykker skal helt dehydreret.
    11. Rehydrere gel stykker med det tilsvarende beløb af 10 ng/μl trypsin (opløst i 50 mM ABC) og inkuberes ved 37 ° C i 12-16 h.
      Bemærk: Gel stykker bør være helt rehydreret med ingen uigennemsigtig kerner. Fjern overskydende væske.
  2. Stabil isotop dimethyl mærkning af fordøjet peptider 29
    1. Uddrag de fordøjede peptider fra gel stykker ved at tilføje 200 μl af ekstraktionsbuffer (5% myresyre og 50% ACN i vand), og der inkuberes ved 37 ° C i 30 min med vortexing (ved 1.200 omdrejninger).
    2. Gentag trin 5.2.1 2 x. Kombinere ekstrakter ind i et microcentrifuge rør.
    3. Tør de udpakkede peptider ved vakuum centrifugering.
    4. Rekonstruere peptider i 200 μl af 100 mM triethylammonium bikarbonat (TEAB, pH 8,5).
      Forsigtig: Trin 5.2.4 - 5.2.6 bør udføres på is i et stinkskab.
    5. Tilsæt 8 μL af 4% CH2O og 8 μL af 4% 13CD2O til den eksperimentelle og kontrolprøver, henholdsvis.
      Bemærk: Du kan styre bias af stabil isotopiske mærkning, bytte den stabile isotop for eksperimenterende og kontrolprøver af de andre biologisk uafhængige replikeres.
    6. Tilsæt 8 μL af 0,6 M Kristian3CN (gøre det friske) og bland godt.
    7. Inkuber prøverne ved stuetemperatur i 1 time med vortexing.
    8. Køle ned prøver på is. Slukke reaktionen ved at tilføje 32 μL af 1% ammoniak vandig opløsning. Derefter, yderligere dæmpning reaktion ved at tilføje 16 μL af myresyre.
    9. Kombinere den eksperimentelle prøve med den tilsvarende kontrolprøve i et microcentrifuge rør. Tørre prøver af vakuum centrifugering.
  3. Fraktionering af dimethyl-mærket peptider
    1. Forberede stop-og-gå-udvinding tips (StageTips)30.
      1. Indsæt en C18 membran i en udvidet længden, 10 μL tip.
      2. Tilføje 300 μg af høj pH C18 perler suspenderet i ACN til spidsen.
      3. Placer spidsen oprejst i et microcentrifuge rør med en hjemmelavet rack, der kan stabilisere spidsen og løfte spidsen ned i bunden.
      4. Spin tip på 1.400 x g i 2 min. udsmid gennemstrømnings.
      5. Vaske spidsen med 50 μL af 80% ACN i 10 mM ABC (pH 10,0). Gentag 1 x.
        Bemærk: Justere pH i 10 mM ABC løsning ved at tilføje 28% ammoniumhydroxid.
      6. Vaske spidsen med 50 μL af 50% ACN i 10 mM ABC (pH 10,0). Gentag 1 x.
      7. Vask spidsen med 50 μl af 10 mM ABC (pH 10,0). Gentag 1 x.
    2. Rekonstruere peptider i 50 μl af 10 mM ABC (pH 10,0).
    3. Tilføje den rekonstituerede prøve at rede spidsen. Genindlæse gennemstrømnings til spidsen for at sikre effektiv peptid bindende.
    4. Vask spidsen med 50 μl af 10 mM ABC (pH 10,0). Gentag 1 x.
    5. Elueres peptid trinvis for 12 fraktioner med 50 μL af 6%, 9%, 12%, 15%, 18%, 21%, 25%, 30%, 35%, 40%, 80% og 6% ACN i 10 mM ABC (pH 10,0).
    6. Kombinere to brøker med samme interval (fraktion 1 med 7, 2 med 8, og så videre) at få seks kombineret fraktioner.
    7. Tørre prøver af vakuum centrifugering. De tørrede peptider kan opbevares ved-30 ° C.

6. udførelsen af MS og dataanalyse

  1. Peptid analyse af liquid chromatography-tandem massespektrometri
    1. Rekonstruere de tørrede peptid fraktioner fra trin 5.3.7 i 15 μl vand, der indeholder 0,1% myresyre. Kontrollere pH af rekonstitueret peptider ved spotting 1 μL af løsningen på en pH strimmel (pH skal være under 3).
    2. Indsprøjtes rekonstruere prøven i kolonnen væskekromatografi (LC). Anvende en passende forløb af opløsningsmiddel (opløsningsmiddel A er vand, der indeholder 0,1% myresyre, opløsningsmiddel B er ACN der indeholder 0,1% myresyre) i high-performance væskekromatografi (HPLC). Et typisk forløb af opløsningsmiddel B er som følger: 5-35% i 40 min. 35-70% i 4 min. og holdt på 75% i 10 min.
    3. Ionisere de eluted peptider ved electrospray og drive massespektrometer i data-afhængige tilstand. Vælg 15 mest rigelige ioner (Multiplicer opladet: 2 + 3 + eller højere) i den oprindelige MS scanner efter en tandem massespektrometri (MS/MS) scanning (kollision-induceret dissociation, CID). Indstille dynamiske udstødelse størrelse til 500 med en maksimal varighed af 25 s.
  2. Protein identifikation og kvantitativ bestemmelse ved hjælp af MaxQuant 31
    1. Indstille falsk opdagelse sats (FDR) af protein identifikation til 0,01 og indstille antallet af unikke peptider til 2 for at øge nøjagtighed og pålidelighed.
    2. Sæt den minimal kræves forholdet tæller (unikke + razor) for protein kvantificering til 2, og aktivere igen kvantificere og Match mellem kører funktioner.
  3. Berigelse betydning evaluering ved hjælp af R/Bioconductor pakke limma 32
    1. Udføre en modereret t-test implementeret i limma til test Log2-fold ændring mod nul fra mindst tre biologiske replikater. Brug funktionen read.table til at læse datatabellen. Derefter bruge funktionerne lmFit og eBayes for data montering. Brug funktionen topTable til at eksportere beregningsresultater (herunder gennemsnit Log2-fold ændring og P -værdier).
    2. Rette P værdierne ved hjælp af metoden Benjamini – Hochberg til styring af FDR.
    3. Anvende en FDR 0,01 for at generere en liste af proteiner berigede væsentligt i de eksperimentelle prøver. Angive en cutoff for to- eller tre Skift til yderligere kontrol de falske positiver.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

De repræsentative resultater af kvalitetskontrol trin præsenteres. Resultaterne inkluderer tal i-gel fluorescens analyse beskrevet taktfast 2.3.2 (figur 1), western blot analysen beskrevet taktfast 4.1.3 (figur 2A) og sølv-farvning analysen beskrevet taktfast 4.2.2 (figur 2B). Kvalitetskontrol trin er kritisk for optimering af CARIC protokoller. Altid medtage kvalitetskontrol i forberedelsen af RBP identifikation storskalaforsøg.

Figure 1
Figur 1: I-gel fluorescens analyse af klik-mærket prøver beskrevet taktfast 2.3.2. (A) dette panel viser en typisk i-gel fluorescens mønster af klik-mærket prøver. Kun dobbelt mærket prøven viser en stærk smøre bandet på en høj molekylvægt (> 250 kDa), som repræsenterer signal af tværbundet RNPs. For at afskaffe RNP signal, Udelad enten 4SU eller EU eller digest med RNase A. Baggrund skarpe bands på en lavere molekylvægt repræsentere signalerne fra ikke-specifikke mærket proteiner. (B) i nogle tilfælde, en stærk udtværet band (~ 130-250 kDa) kan iagttages i no4SU-kontrolprøve. Dette band repræsenterer signal af mærket uncross-sammenkædede RNA'er, som vil blive nedbrudt under varme denaturering, i de fleste tilfælde. Det vil ikke forstyrre de efterfølgende procedurer. CBB = Coomassie strålende blå. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: kvalitetskontrol af affinitet pulldown effektivitet og de erobrede RBPs. (A) dette panel viser en western blot analyse af biotin signaler i prøver før pulldown (input) og i prøver efter pulldown (supernatanten). Anslå forholdet mellem de resterende signaler og optimere perle beløb bruges i trin 3.1.1. (B) dette panel viser en sølv-farvning analyse af erobrede RBPs i forhold til 0,1% input samlede proteiner. For HeLa celler er det generelle samlede capture effektivitet ~0.05% - 0,1% af input proteiner. Denne værdi kan variere betydeligt på grund af variansen af metaboliske mærkning effektiviteten af forskellige celletyper. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: repræsentant MS resultaterne af CARIC. (A) dette panel viser en vulkan plot viser den gennemsnit Log2-fold ændre og justeret P værdier af kvantificerede proteiner, beregnet af pakken limma. 597 af proteiner med en Log2-fold ændring > 2 og en justerede P -værdi af < 0,01 blev klassificeret som "CARIC RBPs". (B) dette panel viser overlapning af de CARIC proteiner med tidligere identificerede menneskelige poly(A) RBPs7,8,9,10,11. De overlappede proteiner for det meste kodning RBPs, mens resten af de CARIC RBPs er mere tilbøjelige til at ikke-kodende RBPs. Denne figur er en Genoptrykt fra tidligere publicerede arbejde med tilladelse fra National Academy of Sciences27. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Vedligeholdelse af fair RNA integritet er en af nøglerne til succes CARIC eksperimenter. Med passende ligander af Cu(I) og forsigtig drift, kan RNA nedbrydning reduceres betydeligt, selv om delvis nedbrydning blev observeret. Substitution forhold mellem EU og 4SU i eksperimentelle prøver er 1,18% og 0,46%, henholdsvis (data ikke vist). For intakte RNA'er med en længde på 2.000 nt, ~ 90% af RNA'er indeholder mindst én EU og en 4SU. For delvist nedbrudte RNA'er med en længde på 1.000 nt, ~ 70% af RNA'er indeholder mindst én EU og en 4SU. Derfor, delvis nedbrydning af RNA'er ikke dramatisk falde effektiviteten af CARIC, mens alvorlige forringelse ikke er acceptabelt.

En anden kritisk trin er trin 1.4, forberedelse til Klik reaktion. Cu (I)-katalyseret Klik reaktion på RNA'er er følsomme over for LDS koncentration. En høj koncentration (> 0,1%) af LDS vil føre til en nedgang på mærkning signaler på EU-holdige RNA'er og en stigning på baggrund signaler på proteiner (data ikke vist).

Ud over EU er CARIC også kompatibel med andre klikbare Nukleosider, såsom alkynyl og azido analoger af adenosin33,34,35,36. Anvendelsen af CARIC er dog betydeligt begrænset af den metaboliske effektivitet af unaturlige klikbare Nukleosider i et biologisk system af interesse. Derfor, før udfører CARIC ved hjælp af andre betingelser end dem, der demonstrerede i denne protokol, altid tjekke de metaboliske mærkning effektivitet (f.eks.af fluorescerende imaging).

For nylig var en lignende strategi kaldet RICK (erobringen af den nyligt transskriberede RNA interactome ved hjælp af klik kemi), som omfatter kun EU for at mærke samlede RNA'er og bruger 254 nm UV at krydse-link RNA'er og proteiner, rapporteret37. Navnlig, kan 254 nm UV aktivere alle fire naturlige Nukleosider såvel som EU. Således 254 nm UV-bestråling kan krydse-link gratis EU og dets metabolitter (fx, EU fosfater) med tilhørende bindende proteiner, som bør tages i betragtning som mulige falske positiver.

En spændende anvendelsen af CARIC er at identificere RBPs i bakterier hvis RNA'er er for det meste ikke-polyadenylated. Den omfattende identifikation af RBPs vil give uvurderlige ressourcer for at forstå det molekylære grundlag af posttranskriptionelle forordninger i bakterier38.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Dette arbejde er støttet af den National Natural Science Foundation i Kina tilskud 91753206, 21425204, og 21521003 og af den nationale nøgle forsknings- og udviklingsprojekt 2016YFA0501500.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HeLa ATCC
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) Thermo Fisher Scientific 11995065
FBS (Fetal Bovine Serum) Thermo Fisher Scientific 10099141
Penicillin & Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122
EU (5-ethynyl uridine) Wuhu Huaren Co. CAS:69075-42-9
4SU (4-thiouridine) Sigma Aldrich T4509
10×PBS (Phosphate-Buffered Saline) Thermo Fisher Scientific AM9625
UV cross-linker UVP CL-1000 Equiped with 365-nm UV lamp
DEPC (Diethyl pyrocarbonate) Sigma Aldrich D5758 To treat water. Highly toxic!
Tris·HCl, pH 7.5 Thermo Fisher Scientific 15567027
LiCl Sigma Aldrich 62476
Nonidet P-40 Biodee 74385
EDTA-free protease inhibitor cocktail Thermo Fisher Scientific 88265 One tablet for 50 mL lysis buffer.
LDS (Lithium dodecyl sulfate) Sigma Aldrich L9781
15-mL ultrafiltration tube (10 kDa cutoff) Millipore UFC901024
0.5-mL ultrafiltration tube (10 kDa cutoff) Millipore UFC501096
Streptavidin magnetic beads Thermo Fisher Scientific 88816
DMSO (Dimethyl sulfoxide) Sigma Aldrich 41639
Azide-biotin Click Chemistry Tools AZ104
Copper(II) sulfate Sigma Aldrich C1297
THPTA [Tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl)amine] Sigma Aldrich 762342
Sodium ascorbate Sigma Aldrich 11140
Azide-Cy5 Click Chemistry Tools AZ118
LDS sample buffer (4×) Thermo Fisher Scientific NP0008
10% bis-Tris gel Thermo Fisher Scientific NP0301BOX
EDTA Thermo Fisher Scientific AM9260G
RNase A Sigma Aldrich R6513
SDS (Sodium dodecyl sulfate) Thermo Fisher Scientific 15525017
NaCl Sigma Aldrich S3014
Brij-97 [Polyoxyethylene (20) oleyl ether] J&K 315442
Triethanolamine Sigma Aldrich V900257
Streptavidin agarose Thermo Fisher Scientific 20353
Urea Sigma Aldrich U5378
Sarkosyl (N-Lauroylsarcosine sodium salt) Sigma Aldrich 61743
Biotin Sigma Aldrich B4501
Sodium deoxycholate Sigma Aldrich 30970
MaxQuant Version: 1.5.5.1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Djebali, S., et al. Landscape of transcription in human cells. Nature. 489, (7414), 101-108 (2012).
  2. Gerstberger, S., Hafner, M., Tuschl, T. A census of human RNA-binding proteins. Nature Reviews Genetics. 15, (12), 829-845 (2014).
  3. Castello, A., Fischer, B., Hentze, M. W., Preiss, T. RNA-binding proteins in Mendelian disease. Trends in Genetics. 29, (5), 318-327 (2013).
  4. Nussbacher, J. K., Batra, R., Lagier-Tourenne, C., Yeo, G. W. RNA-binding proteins in neurodegeneration: Seq and you shall receive. Trends in Neuroscience. 38, (4), 226-236 (2015).
  5. Jazurek, M., Ciesiolka, A., Starega-Roslan, J., Bilinska, K., Krzyzosiak, W. J. Identifying proteins that bind to specific RNAs - focus on simple repeat expansion diseases. Nucleic Acids Research. 44, (19), 9050-9070 (2016).
  6. Hentze, M. W., Castello, A., Schwarzl, T., Preiss, T. A brave new world of RNA-binding proteins. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19, (5), 327-341 (2018).
  7. Castello, A., et al. Insights into RNA biology from an atlas of mammalian mRNA-binding proteins. Cell. 149, (6), 1393-1406 (2012).
  8. Baltz, A. G., et al. The mRNA-bound proteome and its global occupancy profile on protein-coding transcripts. Molecular Cell. 46, (5), 674-690 (2012).
  9. Beckmann, B. M., et al. The RNA-binding proteomes from yeast to man harbour conserved enigmRBPs. Nature Communications. 6, 10127-10135 (2015).
  10. Conrad, T., et al. Serial interactome capture of the human cell nucleus. Nature Communications. 7, 11212-11222 (2016).
  11. Castello, A., et al. Comprehensive identification of RNA-binding domains in human cells. Molecular Cell. 63, (4), 696-710 (2016).
  12. Kwon, S. C., et al. The RNA-binding protein repertoire of embryonic stem cells. Nature Structural & Molecular Biology. 20, (9), 1122-1130 (2013).
  13. Liepelt, A., et al. Identification of RNA-binding proteins in macrophages by interactome capture. Molecular & Cellular Proteomics. 15, (8), 2699-2714 (2016).
  14. Liao, Y., et al. The cardiomyocyte RNA-binding proteome: Links to intermediary metabolism and heart disease. Cell Reports. 16, (5), 1456-1469 (2016).
  15. Mitchell, S. F., Jain, S., She, M. P., Parker, R. Global analysis of yeast mRNPs. Nature Structural & Molecular Biology. 20, (1), 127-133 (2013).
  16. Matia-González, A. M., Laing, E. E., Gerber, A. P. Conserved mRNA-binding proteomes in eukaryotic organisms. Nature Structural & Molecular Biology. 22, (12), 1027-1033 (2015).
  17. Despic, V., et al. Dynamic RNA-protein interactions underlie the zebrafish maternal-to-zygotic transition. Genome Research. 27, (7), 1184-1194 (2017).
  18. Wessels, H. H., et al. The mRNA-bound proteome of the early fly embryo. Genome Research. 26, (7), 1000-1009 (2016).
  19. Sysoev, V. O., et al. Global changes of the RNA-bound proteome during the maternal-to-zygotic transition in Drosophila. Nature Communications. 7, 12128 (2016).
  20. Reichel, M., et al. In planta determination of the mRNA-binding proteome of Arabidopsis etiolated seedlings. Plant Cell. 28, (10), 2435-2452 (2016).
  21. Marondedze, C., Thomas, L., Serrano, N. L., Lilley, K. S., Gehring, C. The RNA-binding protein repertoire of Arabidopsis thaliana. Scientific Reports. 6, 29766-29778 (2016).
  22. Zhang, Z., et al. UV crosslinked mRNA-binding proteins captured from leaf mesophyll protoplasts. Plant Methods. 12, 42-53 (2016).
  23. Bunnik, E. M., et al. The mRNA-bound proteome of the human malaria parasite Plasmodium falciparum. Genome Biology. 17, 147-164 (2016).
  24. Lueong, S., Merce, C., Fischer, B., Hoheisel, J. D., Erben, E. D. Gene expression regulatory networks in Trypanosoma brucei: insights into the role of the mRNA-binding proteome. Molecular Microbiology. 100, (3), 457-471 (2016).
  25. Nandan, D., et al. Comprehensive identification of mRNA-binding proteins of Leishmania donovani by interactome capture. PLoS ONE. 12, (1), e0170068 (2017).
  26. Jankowsky, E., Harris, M. E. Specificity and nonspecificity in RNA-protein interactions. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16, (9), 533-544 (2015).
  27. Huang, R., Han, M., Meng, L., Chen, X. Transcriptome-wide discovery of coding and noncoding RNA-binding proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115, (17), E3879-E3887 (2018).
  28. Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nature Protocols. 1, (6), 2856-2860 (2006).
  29. Boersema, P. J., Raijmakers, R., Lemeer, S., Mohammed, S., Heck, A. J. R. Multiplex peptide stable isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics. Nature Protocols. 4, (4), 484-494 (2009).
  30. Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips. Nature Protocols. 2, (8), 1896-1906 (2007).
  31. Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nature Biotechnology. 26, (12), 1367-1372 (2008).
  32. Ritchie, M. E., et al. limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies. Nucleic Acids Research. 43, (7), e47 (2015).
  33. Grammel, M., Hang, H., Conrad, N. K. Chemical reporters for monitoring RNA synthesis and poly(A) tail dynamics. ChemBioChem. 13, (8), 1112-1115 (2012).
  34. Curanovic, D., et al. Global profiling of stimulus-induced polyadenylation in cells using a poly(A) trap. Nature Chemical Biology. 9, (11), 671-673 (2013).
  35. Zheng, Y. X., Beal, P. A. Synthesis and evaluation of an alkyne-modified ATP analog for enzymatic incorporation into RNA. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 26, (7), 1799-1802 (2016).
  36. Nainar, S., et al. Metabolic incorporation of azide functionality into cellular RNA. ChemBioChem. 17, (22), 2149-2152 (2016).
  37. Bao, X., et al. Capturing the interactome of newly transcribed RNA. Nature Methods. 15, (3), 213-220 (2018).
  38. Holmqvist, E., Vogel, J. RNA-binding proteins in bacteria. Nature Reviews Microbiology. Published online (2018).
Opsamling og identifikation af RNA-bindende proteiner ved hjælp af klik kemi-assisteret RNA-interactome Capture (CARIC) strategi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Huang, R., Han, M., Meng, L., Chen, X. Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) Strategy. J. Vis. Exp. (140), e58580, doi:10.3791/58580 (2018).More

Huang, R., Han, M., Meng, L., Chen, X. Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) Strategy. J. Vis. Exp. (140), e58580, doi:10.3791/58580 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter