Um protocolo detalhado para a aplicação a clique química assistida RNA-interactome captura (CARIC) estratégia para identificar proteínas obrigatório para ambos os de codificação e não-codificante RNAs é apresentado.
Uma abrangente identificação das proteínas RNA-obrigatórias (RBPs) é a chave para entender a rede reguladora posttranscriptional nas células. Uma estratégia amplamente utilizada para a captura de RBP explora a poliadenilação [poli] de RNAs de alvo, que ocorre principalmente em eucarióticos mRNAs maduros, deixando a maioria das proteínas de ligação de non-poly(A) RNAs não identificado. Aqui descrevemos os procedimentos detalhados de um método recentemente relatado denominado clique química assistida RNA-interactome captura (CARIC), que permite a captura de todo o transcriptoma do RBPs tanto poli e non-poly(A) combinando a rotulagem metabólica do RNAs, na vivo UV do cross-linking e opaco de marcação.
O genoma humano é transcrito em vários tipos de codificação e não-codificante RNAs (ncRNAs), incluindo os mRNAs, rRNAs, os tRNAs, pequenos RNAs nucleares (snRNPs), pequenos RNAs nucleolares (snoRNAs) e tempo não-codificantes RNAs (lncRNAs)1. A maioria destes RNAs possuem roupas de RBPs e funciona como ribonucleoprotein partículas (RNPs)2. Portanto, uma identificação abrangente do RBPs é um pré-requisito para a compreensão da rede regulamentar entre RNAs e RBPs, que está implicada em várias doenças humanas3,4,5.
Nos últimos anos têm testemunhado um grande impulso de RBPs, descoberto em vários sistemas eukaryotic2,6, incluindo humano7,8,9,10,11, rato12,13,14, fermento9,15,16, zebrafish17, Drosophila melanogaster18,19 , Caenorhabditis elegans16, Arabidopsis thaliana20,21,22e parasitas humanos23,24,25 . Estes avanços têm sido facilitados por uma estratégia de captura RBP desenvolvida pela Castello et al 7 e Baltz et al 8 em 2012, que combina na vivo UV do cross-linking de RNA e sua interação proteínas, oligo (descolamento) captura de RNAs poli (a) e espectrometria de massa (MS)-com base em perfis de proteomic. No entanto, dado o fato de que poli existe principalmente em mRNAs maduros, que são responsáveis por apenas ~ 3-5% de eukaryotic transcriptome26, esta estratégia amplamente utilizada não é capaz de capturar RBPs interagindo com non-poly(A) RNAs, incluindo a maioria de ncRNAs e pré-mRNAs.
Aqui, nós relatamos os procedimentos detalhados de uma estratégia desenvolvida recentemente para a captura de todo o transcriptoma de tanto poli e non-poly(A) RBPs27. Denominado CARIC, esta estratégia combina na vivo UV do cross-linking e rotulagem metabólicos de RNAs com photoactivatable e “clicáveis” análogos nucleosídeos (que contêm um grupo funcional opaco que podem participar na reação de clique), 4 – thiouridine (4SU) e 5-ethynyluridine (UE). Etapas que são a chave para obter resultados ideais com a estratégia CARIC são eficiente rotulação metabólica, cross-linking e clique em reacção à luz UV e a manutenção da integridade do RNA. Porque Cu(I) usado como catalisador na reação de clique pode causar fragmentação dos RNAs, um ligante de Cu(I) que pode reduzir a fragmentação de RNA é essencial. Descrevemos como realizar reações eficiente clique no lisados celulares sem causar grave degradação do RNA.
Embora RBP captura e identificação em células HeLa só é descrita no presente protocolo, a estratégia CARIC pode ser aplicada para vários tipos de células e, possivelmente, de organismos vivos. Além de captura RBP, este protocolo também fornece procedimentos passo a passo simplificados para preparação de amostras de MS e proteína identificação e quantificação, que pode ser útil para aqueles que não estão familiarizados com os experimentos de proteomic.
A manutenção da integridade de RNA justa é uma das chaves para experiências bem sucedidas de CARIC. Com ligantes apropriadas de Cu(I) e operação cuidadosa, degradação de RNA pode ser significativamente reduzida, embora tenha sido observada degradação parcial. As taxas de substituição da UE e 4SU em amostras experimentais são 1,18% e 0,46%, respectivamente (dados não mostrados). Para RNAs intactas com um comprimento de 2.000 nt, ~ 90% de RNAs conter pelo menos um da UE e um 4SU. Para parcialmente degradadas …
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho é apoiado pelo nacional ciências naturais Fundação de China bolsas 91753206, 21425204 e 21521003 e pelo nacional chave de pesquisa e desenvolvimento do projeto 2016YFA0501500.
HeLa | ATCC | ||
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Thermo Fisher Scientific | 11995065 | |
FBS (Fetal Bovine Serum) | Thermo Fisher Scientific | 10099141 | |
Penicillin & Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
EU (5-ethynyl uridine) | Wuhu Huaren Co. | CAS:69075-42-9 | |
4SU (4-thiouridine) | Sigma Aldrich | T4509 | |
10×PBS (Phosphate-Buffered Saline) | Thermo Fisher Scientific | AM9625 | |
UV cross-linker | UVP | CL-1000 | Equiped with 365-nm UV lamp |
DEPC (Diethyl pyrocarbonate) | Sigma Aldrich | D5758 | To treat water. Highly toxic! |
Tris·HCl, pH 7.5 | Thermo Fisher Scientific | 15567027 | |
LiCl | Sigma Aldrich | 62476 | |
Nonidet P-40 | Biodee | 74385 | |
EDTA-free protease inhibitor cocktail | Thermo Fisher Scientific | 88265 | One tablet for 50 mL lysis buffer. |
LDS (Lithium dodecyl sulfate) | Sigma Aldrich | L9781 | |
15-mL ultrafiltration tube (10 kDa cutoff) | Millipore | UFC901024 | |
0.5-mL ultrafiltration tube (10 kDa cutoff) | Millipore | UFC501096 | |
Streptavidin magnetic beads | Thermo Fisher Scientific | 88816 | |
DMSO (Dimethyl sulfoxide) | Sigma Aldrich | 41639 | |
Azide-biotin | Click Chemistry Tools | AZ104 | |
Copper(II) sulfate | Sigma Aldrich | C1297 | |
THPTA [Tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl)amine] | Sigma Aldrich | 762342 | |
Sodium ascorbate | Sigma Aldrich | 11140 | |
Azide-Cy5 | Click Chemistry Tools | AZ118 | |
LDS sample buffer (4×) | Thermo Fisher Scientific | NP0008 | |
10% bis-Tris gel | Thermo Fisher Scientific | NP0301BOX | |
EDTA | Thermo Fisher Scientific | AM9260G | |
RNase A | Sigma Aldrich | R6513 | |
SDS (Sodium dodecyl sulfate) | Thermo Fisher Scientific | 15525017 | |
NaCl | Sigma Aldrich | S3014 | |
Brij-97 [Polyoxyethylene (20) oleyl ether] | J&K | 315442 | |
Triethanolamine | Sigma Aldrich | V900257 | |
Streptavidin agarose | Thermo Fisher Scientific | 20353 | |
Urea | Sigma Aldrich | U5378 | |
Sarkosyl (N-Lauroylsarcosine sodium salt) | Sigma Aldrich | 61743 | |
Biotin | Sigma Aldrich | B4501 | |
Sodium deoxycholate | Sigma Aldrich | 30970 | |
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