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Biochemistry

Captura e identificação de proteínas de ligação de RNA usando clique química assistida RNA-interactome capturam estratégia (CARIC)

doi: 10.3791/58580 Published: October 19, 2018
* These authors contributed equally

Summary

Um protocolo detalhado para a aplicação a clique química assistida RNA-interactome captura (CARIC) estratégia para identificar proteínas obrigatório para ambos os de codificação e não-codificante RNAs é apresentado.

Abstract

Uma abrangente identificação das proteínas RNA-obrigatórias (RBPs) é a chave para entender a rede reguladora posttranscriptional nas células. Uma estratégia amplamente utilizada para a captura de RBP explora a poliadenilação [poli] de RNAs de alvo, que ocorre principalmente em eucarióticos mRNAs maduros, deixando a maioria das proteínas de ligação de non-poly(A) RNAs não identificado. Aqui descrevemos os procedimentos detalhados de um método recentemente relatado denominado clique química assistida RNA-interactome captura (CARIC), que permite a captura de todo o transcriptoma do RBPs tanto poli e non-poly(A) combinando a rotulagem metabólica do RNAs, na vivo UV do cross-linking e opaco de marcação.

Introduction

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O genoma humano é transcrito em vários tipos de codificação e não-codificante RNAs (ncRNAs), incluindo os mRNAs, rRNAs, os tRNAs, pequenos RNAs nucleares (snRNPs), pequenos RNAs nucleolares (snoRNAs) e tempo não-codificantes RNAs (lncRNAs)1. A maioria destes RNAs possuem roupas de RBPs e funciona como ribonucleoprotein partículas (RNPs)2. Portanto, uma identificação abrangente do RBPs é um pré-requisito para a compreensão da rede regulamentar entre RNAs e RBPs, que está implicada em várias doenças humanas3,4,5.

Nos últimos anos têm testemunhado um grande impulso de RBPs, descoberto em vários sistemas eukaryotic2,6, incluindo humano7,8,9,10,11, rato12,13,14, fermento9,15,16, zebrafish17, Drosophila melanogaster18,19 , Caenorhabditis elegans16, Arabidopsis thaliana20,21,22e parasitas humanos23,24,25 . Estes avanços têm sido facilitados por uma estratégia de captura RBP desenvolvida pela Castello et al 7 e Baltz et al 8 em 2012, que combina na vivo UV do cross-linking de RNA e sua interação proteínas, oligo (descolamento) captura de RNAs poli (a) e espectrometria de massa (MS)-com base em perfis de proteomic. No entanto, dado o fato de que poli existe principalmente em mRNAs maduros, que são responsáveis por apenas ~ 3-5% de eukaryotic transcriptome26, esta estratégia amplamente utilizada não é capaz de capturar RBPs interagindo com non-poly(A) RNAs, incluindo a maioria de ncRNAs e pré-mRNAs.

Aqui, nós relatamos os procedimentos detalhados de uma estratégia desenvolvida recentemente para a captura de todo o transcriptoma de tanto poli e non-poly(A) RBPs27. Denominado CARIC, esta estratégia combina na vivo UV do cross-linking e rotulagem metabólicos de RNAs com photoactivatable e "clicáveis" análogos nucleosídeos (que contêm um grupo funcional opaco que podem participar na reação de clique), 4 - thiouridine (4SU) e 5-ethynyluridine (UE). Etapas que são a chave para obter resultados ideais com a estratégia CARIC são eficiente rotulação metabólica, cross-linking e clique em reacção à luz UV e a manutenção da integridade do RNA. Porque Cu(I) usado como catalisador na reação de clique pode causar fragmentação dos RNAs, um ligante de Cu(I) que pode reduzir a fragmentação de RNA é essencial. Descrevemos como realizar reações eficiente clique no lisados celulares sem causar grave degradação do RNA.

Embora RBP captura e identificação em células HeLa só é descrita no presente protocolo, a estratégia CARIC pode ser aplicada para vários tipos de células e, possivelmente, de organismos vivos. Além de captura RBP, este protocolo também fornece procedimentos passo a passo simplificados para preparação de amostras de MS e proteína identificação e quantificação, que pode ser útil para aqueles que não estão familiarizados com os experimentos de proteomic.

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Protocol

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Cuidado: Quando aplicável, os reagentes utilizados devem ser comprados na forma de RNase-livre, ou dissolvidos em RNase-livre, solventes (na maioria dos casos, em pyrocarbonate de dietilo (DEPC)-água tratada). Ao manusear amostras do RNA e reagentes RNase-livre, sempre use luvas e máscaras e alterá-los com frequência para evitar contaminação de RNase.

1. preparação de lisado de metabolicamente rotulado e reticuladas células UV

  1. Incorporação metabólica da UE e 4SU
    1. Células HeLa de cultura em modificado águia de Dulbecco médio (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS), 100 U/mL penicilina e estreptomicina 100 de μg/mL a 37 ° C numa atmosfera 5% CO2 . Cultura de ~ 4 x 107 células de HeLa (em dois pratos de 15 cm) para a preparação de um experimental ou amostra de controlo para uma corrida de MS padrão.
    2. Quando culturas de células HeLa alcançar confluência de ~ 80%, remover o meio de cultura e adicionar 15 mL de meio fresco escaldado por prato de 15 cm.
    3. Adicionar 15 μL por prato de EU (dissolvido em tampão fosfato salino (PBS)) a uma concentração final de 1 mM a 100 mM e 7.5 μL por prato de 100mm 4SU (dissolvida em PBS) a uma concentração final de 0,5 mM para experimental e amostras de controle noUV. Adicione 15 μL por prato de 100 mM EU (dissolvido em PBS) a uma concentração final de 1 mM para amostras de controlo de no4SU.
      Nota: 4SU é foto-ativável; assim, é necessária a protecção da luz depois de adicionar 4SU.
    4. Cobrir os pratos com uma folha e cultura das células para 16 h. adicionar metade da quantidade da UE e 4SU ou só UE da etapa 1.1.3 para o experimental, noUV-e amostras de controlo de no4SU, respectivamente e continuam cultivo para outro 2 h.
  2. Na vivo Cross-linking UV
    1. Remover o meio de cultura, lavar as células 3 x com 5 mL de PBS por prato e remover o máximo possível de PBS residual.
      Nota: Líquido de resíduo irá reduzir significativamente a eficiência do cross-linking.
    2. Para experimental e amostras de controlo de no4SU, coloque os pratos no gelo com a tampa removida e irradiar as células com luz de 2 J/cm2 por um cross-linker UV de UV 365 nm.
    3. Para amostras de noUV-controle, coloque os pratos no gelo e protegê-los de luz.
      Nota: Todas as etapas a seguir para amostras noUV-controle devem ser realizadas em uma sala escura.
  3. Lise celular e homogeneização
    1. Adicionar 1 mL por prato de pre-lise (10mm Tris∙HCl, pH 7,5, 50mm ácido LiCl, 0,02% Nonidet P-40 e ácido etilenodiaminotetracético (EDTA)-coquetel de inibidor de protease gratuito) para as células. Raspar as células usando um levantador de célula de borracha e coletar a suspensão pre-lise em um tubo de 15mL.
      Nota: Este passo irá romper a membrana da célula e liberar proteínas citoplasmáticas solúveis e RNAs. Não centrifugar o tubo e remover o sobrenadante.
    2. A suspensão de dois pratos de 15 cm, ajuste o volume para 6 mL adicionando pré-Lise. Adicione à suspensão pre-lise um volume igual de R-lise (200 mM Tris∙HCl, pH 7,5, 500mm LiCl, 2% de lítio Dodecil sulfato [LDS]).
    3. Homogeneizar o lisado celular por passagem através de uma seringa com uma agulha estreita (27-G) várias vezes até o lisado é clara e homogênea. Incube o lisado a 4 ° C, com suave rotação (~ 15 rpm) por 1h.
      Nota: Esta última etapa permitirá a completa desnaturação das proteínas. O lisado pode ser armazenado com segurança a-70 ° C por até um mês.
  4. Preparação para a reação de clique
    1. Diluir o lisado adicionando 20 volumes de tampão de diluição (50 mM Tris∙HCl, pH 7,5) e dividi-lo em frações de 15 mL.
      Nota: Soluções contendo uma alta concentração de sal e detergente vão comprometer a eficiência do Cu (I)-catalisada reação clique; assim, a reserva do lisado deve ser alterada.
    2. Concentre-se cada fração usando um tubo de 15 mL de ultrafiltração (com um peso molecular de corte de 10 kDa) até que o volume é menor do que 1 mL. Use um rotor balançando-balde para girar o tubo de ultrafiltração a 4.000 x g a 4 ° C para ~ 15 min.
    3. Adicionar 14 mL de tampão de diluição para a fração de lisado concentrada e repita a etapa 1.4.2. Combinar as frações e concentrá-las a um volume de 6 mL por ultrafiltração (4.000 x g a 4 ° C para ~ 15 min).
      Nota: A maioria do sal e LDS vai agora ser removido, assim é o lisado pronto para a reação de clique. O lisado pode ser armazenado a-70 ° C por até uma semana. Evite múltiplos ciclos de gelo-degelo, porque eles resultará em significativa degradação de RNA. Alíquota do lisado se caracterizações em pequena escala são necessárias.

2. preparação das amostras para RNA-interactome capturar

  1. Preclearing do lisado
    1. Adicionar contas magnéticas de 100 μL streptavidin por 6 mL de lisado e rodar suavemente (~ 15 rpm) por 30 min à temperatura ambiente para eliminar naturalmente proteínas biotinilado.
    2. Granule os grânulos usando um ímã (por ~ 20 min a 4 ° C) e a transferência do lisado lisado para um novo tubo.
  2. Desempenho da reação clique
    1. Preparar a mistura de reação: 6.5 μL de estoque de biotina (100mm azida-biotina dissolvido em Dimetilsulfóxido [DMSO] em uma concentração final de 100 μM), 3.25 μL do estoque de cobre (torná-lo fresco; 1 M CuSO4 dissolvido na água em uma concentração final de 500 μM) , 65 μL de estoque de ligante (200 mM THPTA dissolvido na água em uma concentração final de 2 mM) e 262.75 μL de H2O.
      Nota: THPTA defende a amina de Tris [(1-hydroxypropyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl) metil].
    2. Adicione a mistura de reação a 6 mL de lisado lisado e misture bem. Em seguida, adicione 162.5 μL de reduzir reagente (torná-lo fresco; ascorbato de sódio 40 mg/mL em uma concentração final de 5mm) para o lisado e misture bem. O volume final deve ser de 6,5 mL.
    3. Incube a mistura de reação para 2 h à temperatura ambiente em um agitador orbital (800 rpm). Adicionar 5 mM EDTA para a mistura de reação e incubar por 5 min saciar a reação.
  3. Caracterizações de pequena escala
    1. Prepare a mistura de reação como na etapa 2.2.1 com o estoque de biotina, substituída pelo estoque de corante (por exemplo, 100 mM azida-Cy5 dissolvidos em DMSO).
      Nota: A quantidade de reagente deve ser ajustada de acordo com o volume de lisado. Normalmente, uma alíquota de 20 μL do lisado é suficiente para caracterizações como uma análise da fluorescência em-gel.
    2. Adicione a mistura de reação para o lisado e incube-lo por 2 h à temperatura ambiente. Em seguida, adicione um terço do volume de tampão de amostra o LDS (4x), desnaturam a 55 ° C por 5 min e resolver a amostra em um gel de bis-Tris 10%.
      Nota: Para confirmar que o sinal de fluorescência é apresentado em RNAs, incluem controles com digestão RNase A após a reação de clique.
  4. Limpeza da mistura de reação
    1. Adicione oito volumes de metanol prechilled (100%) a mistura de reacção extinto e incube durante 30 min a-30 ° C para a precipitação. Execute a precipitação em tubos de centrifuga conico de 50 mL.
      Nota: Se o volume total é superior a 50 mL, divida a mistura de reação em dois tubos de centrifuga conico de 50 mL.
    2. Preparar o tampão de reconstituição: combinar um volume de tampão A (Dodecil sulfato de sódio 4% [SDS] e 10 mM de EDTA) com oito volumes de tampão B (1% trietanolamina de Brij-97, NaCl de 150 mM e 50 mM, pH 7,4).
    3. Centrifugar a 4.000 x g durante 15 minutos a 4 ° C e descartar o sobrenadante. Adicione ~ 1-2 mL de metanol prechilled ao pellet. Pipeta de cima e para baixo para quebrar a pelota e certifique-se que a pelota é completamente suspenso com pedaços não visíveis. Encha o tubo com metanol prechilled. Repita este passo 2x.
    4. Centrifugar a 4.000 x g durante 15 minutos a 4 ° C e descartar o sobrenadante. Colocar os tubos e centrifugar novamente 4.000 x g por 5 min. cuidadosamente tirar o metanol residual máximo possível sem perturbar o sedimento de volta.
    5. Adicione 10 mL de tampão de reconstituição ao pellet. Pipete para cima e para baixo dissolva a pelota. Centrifugar a 4.000 x g por 10 min a 4 ° C.
    6. Transferi o sobrenadante para um tubo novo. Recolha 20 μL da amostra para controle de qualidade (ver secção 4).
      Nota: Agora, a amostra está pronta para a captura de RNA-interactome. A amostra de leite reconstituído pode ser armazenada a-70 ° C por até uma semana.

3. RNA-interactome captura

  1. Preparação dos grânulos streptavidin-agarose
    1. Leve 1.600 μL de chorume streptavidin-agarose (800 μL de grânulos liquidados) por 10 mL de amostra de leite reconstituído em um tubo de centrifuga conico de 15 mL.
    2. Gire para baixo as contas a 4000 x g por 5 min. Retire cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar os grânulos se estabeleceram.
    3. Lave os grânulos com 10 mL de 50mm Tris∙HCl (pH 7,5). Spin para baixo os grânulos (4.000 x g por 5 min) e remover o sobrenadante. Repita este passo 2x.
  2. Afinidade pulldown
    1. Transferi a amostra limpa-up e reconstituída da etapa 2.4.6 aos talões de streptavidin-agarose (ver passo 3.1). Incubar durante uma noite com suave rotação a 4 ° C.
  3. Lavagem dos grânulos streptavidin
    1. Gire para baixo as contas (4.000 x g por 5 min) e transferir o sobrenadante para um tubo novo. Recolha 20 μL da amostra para controle de qualidade.
    2. Lave os grânulos com 10 mL de tampão de lavagem (um SDS 2% em PBS, pH 7,4). Incube durante 10 min com suave rotação (~ 12 rpm) à temperatura ambiente. Spin para baixo os grânulos (4.000 x g por 5 min) e remover o sobrenadante. Repita 1 x.
    3. Repita a etapa 3.3.2 com tampão de lavagem B (ureia 8m e 250mm NH4HCO3 dissolvido na água). Repita a etapa 3.3.2 com tampão de lavagem C (2,5 M NaCl em PBS, pH 7,4). Em seguida, lave os grânulos com 10 mL de 50mm Tris∙HCl (pH 7,5). Spin para baixo os grânulos (4.000 x g por 5 min) e remover o sobrenadante.
    4. Dividir os grânulos uniformemente e transferi-los para dois tubos de 1,5 mL microcentrifuge.
  4. Eluição dos RNPs capturados
    1. Preparar o tampão de eluição de biotina: biotina 12,5 mM, 75 mM NaCl, 7,5 mM Tris∙HCl (pH 7,5), 1,5 mM EDTA, 0.15% SDS, sarkosyl de 0,075% e 0,02% de sódio Deoxycholate do.
      Nota: Loja reserva em temperatura ambiente, para biotina pode precipitar a 4 ° C.
    2. De 400 μL de grânulos se estabeleceram lavados, adicione 400 μL de tampão de eluição de biotina.
    3. Incube-os em um agitador orbital (1.500 rpm) à temperatura ambiente por 20 min. Em seguida, incubar um agitador orbital com um bloco de calor (1.500 rpm, 65 ° C) por 10 min. Spin para baixo os grânulos (7.800 x g por 1 min) e recolher a RNP eluted.
    4. Para as contas, adicionar 400 μL de tampão de eluição de biotina fresco e repita o passo 3.4.3. Combinar as duas elutes em um tubo de 15 mL.
  5. Digestão de RNase
    1. Adicione três volumes de tampão de diluição para a RNP eluted para diminuir a concentração de SDS. Concentrar a amostra diluída usando um tubo de 0,5 mL de ultrafiltração (com um peso molecular de corte de 10 kDa; girar a 12.000 x g a 4 ° C por 30 min) para ~ 40 μL.
    2. Adicionar 0,5 μg/μL RNase A e incube-lo por 2 h a 37 ° C para liberar RBPs de RNAs reticulados. Colete 2 μL do RBPs para controle de qualidade (ver secção 4).

4. controle de qualidade

  1. Controle da eficiência do pulldown de afinidade
    1. Leve 10 μL da amostra do "antes-pulldown" de passo 2.4.6 e 10 μL da amostra da etapa 3.3.1 "após-pulldown".
    2. Analise as amostras usando procedimentos padrão ocidental do borrão (gel de 10% bis-Tris).
    3. Mancha de membrana polivinilideno fluoreto (PVDF) com conjugado streptavidin-HRP para monitorar os sinais de biotina do resíduo da amostra "após-pulldown".
      Nota: Se o sinal de biotina da amostra "após-pulldown" for superior um quinto do sinal da amostra do "antes-pulldown", aumente a quantidade de grânulos streptavidin-agarose usado na etapa 3.1.1.
  2. Controle da captura total eficiência
    1. Tomar 2 μL da amostra lançada RBP passo 3.5.2 e 0,5 μL da amostra do "antes-pulldown" (como 0,1% de entrada) de passo 2.4.6.
    2. Analise as amostras usando os procedimentos padrão de coloração de prata.
      1. Corrigi o gel com tampão de fixação (40% de etanol, 10% ácido acético) por 20 min, seguido de sensibilização (13 mM Na2S2O3, acetato de sódio de 83 milímetros, 30% de etanol) por 30 min.
      2. Lave o gel 3 x com água por 5 min e, em seguida, manchá-la com uma 15mm AgNO3 solução de 20 min. Lave o gel 2 x com água por 1 min, desenvolvê-la em 0,24 M Na2CO3 e 0,012% de formaldeído e finalizar com 45 mM de EDTA quando a coloração está suffici ent.
        Nota: A intensidade de coloração de prata das RBPs capturados deve ser similar da entrada de 0,1%.

5. preparação das amostras para MS

  1. Digestão do trypsin do RBPs capturados em-gel 28
    1. Adicione um quarto volume de tampão de amostra SDS (5x) para as amostras RBP lançadas da etapa 3.5.2. Desnature a amostra a 95 ° C por 10 min.
    2. Resolva os RBPs em um gel de SDS-poliacrilamida de 10% de 1,5 mm.
    3. Manche o gel com prata, seguintes protocolos padrão.
    4. Impostos especiais de consumo pista da amostra experimental ou amostra de controlo com gel de empilhamento e a banda principal de RNase removido um (~ 15 kDa).
    5. Corte a pista extirpada em pedaços pequenos (~ 1-1.5 x ~ 1-1.5 mm).
      Nota: A borda mais curta da peça gel deve ser não inferior a 1 mm para evitar o entupimento em pontas de pipetas.
    6. Transfira os pedaços de gel para um tubo de microcentrifugadora e destain com descoloração buffer (uma mistura de volumes iguais de 100 mM nd2S2O3 e 30 mM K3[Fe(CN)6]).
    7. Lave os pedaços de gel com 200 mM de bicarbonato de amónio (ABC) até os pedaços de gel são totalmente incolores.
    8. Desidrata-se os pedaços de gel em 1 mL de puro acetonitrila (ACN). Reidratar com 200 μL de 10mm ditiotreitol (dissolvida em 50 milímetros ABC) e incube a 56 ° C durante 45 min.
      Nota: Peças completamente desidratado gel devem ser muito duro e opaco. Se os pedaços de gel ainda estão moles após desidratação, remover o Grupo ACN e adicionar 1 mL de puro ACN desidratar novamente.
    9. Arrefecer os pedaços de gel à temperatura ambiente. Adicionar 200 μL de 58 milímetros iodoacetamide (dissolvida em 50 milímetros ABC) e incubar a temperatura ambiente por 45 min no escuro.
    10. Após uma breve lavagem com água, desidrata-se os pedaços de gel em 1 mL de puro ACN.
      Nota: Os pedaços de gel devem ser completamente desidratados.
    11. Hidratar os pedaços de gel com a quantidade adequada de tripsina de ng/μL 10 (dissolvida em 50 milímetros ABC) e incubar a 37 ° C, durante 12-16 h.
      Nota: Os pedaços de gel devem ser completamente reidratados com núcleos não opacos. Remova qualquer excesso de líquido.
  2. Isótopo estável dimetil rotulagem dos peptides digeridos 29
    1. Extrair os peptídeos digeridos dos pedaços de gel, adicionando 200 μL de tampão de extração (5% de ácido fórmico e 50% ACN na água) e incubar a 37 ° C por 30 min, com utilização do Vortex (a 1.200 rpm).
    2. Repita a etapa 5.2.1 2x. Combine os extratos em um tubo de microcentrifugadora.
    3. Seque os peptídeos extraídos por centrifugação de vácuo.
    4. Reconstitua os peptídeos em 200 μL de bicarbonato de trietilamônio 100mm (TEAB, pH 8,5).
      Cuidado: Etapas 5.2.4 - 5.2.6 devem ser executadas no gelo em uma coifa.
    5. Adicione 8 μL de 4% CH2O e 8 μL de 4% 13CD2O que o experimental e amostras de controle, respectivamente.
      Nota: Para controlar o viés de marcação isotópica estável, trocar o isótopo estável para experimental e amostras de outro replicar o biologicamente independente de controlo.
    6. Adicionar 8 μL de 0,6 M NaBH3CN (torná-lo fresco) e misture bem.
    7. Incube as amostras à temperatura ambiente durante 1 h com utilização do vortex.
    8. Arrefecer as amostras no gelo. Saciar a reação adicionando 32 µ l de solução aquosa de amoníaco de 1%. Então, ainda mais saciar a reação adicionando 16 μL de solução de ácido fórmico.
    9. Combine a amostra experimental com a amostra de controle correspondente em um tubo de microcentrifugadora. Seca as amostras por centrifugação de vácuo.
  3. Fracionamento de dimetil-rotulado de peptídeos
    1. Prepare as dicas para-e-ir-extração (StageTips)30.
      1. Inserir uma ponta de 10 μL de estendido-comprimento, uma membrana C18.
      2. Adicione 300 μg de grânulos de alta-pH C18 suspenso no Grupo ACN na ponta.
      3. Coloque a ponta vertical em um tubo de microcentrifugadora com um rack de caseiro que pode estabilizar a ponta e levante a ponta fora da parte inferior.
      4. Gire a ponta a 1.400 x g por 2 min. descarte o escoamento.
      5. Lave a ponta com 50 μL de 80% ACN em 10mm ABC (pH 10,0). Repita 1 x.
        Nota: Ajuste o pH da solução de 10mm ABC pela adição de hidróxido de amônio 28%.
      6. Lave a ponta com 50 μL de 50% ACN em 10mm ABC (pH 10,0). Repita 1 x.
      7. Lave a ponta com 50 μL de 10mm ABC (pH 10,0). Repita 1 x.
    2. Reconstitua os peptídeos em 50 μL de 10mm ABC (pH 10,0).
    3. Adicione a amostra de leite reconstituído à ponta preparada. Recarrega o escoamento à ponta para assegurar a ligação do peptide eficiente.
    4. Lave a ponta com 50 μL de 10mm ABC (pH 10,0). Repita 1 x.
    5. Eluir o peptídeo gradual para 12 fracções com 50 μL de 6%, 9%, 12%, 15%, 18%, 21%, 25%, 30%, 35%, 40%, 80% e 6% ACN em 10mm ABC (pH 10,0).
    6. Combinar duas frações com um intervalo igual (fração 1 com 7, 2 com 8, e assim por diante) obter seis combinado fracções.
    7. Seca as amostras por centrifugação de vácuo. Os peptídeos secos podem ser armazenados a-30 ° C.

6. desempenho do MS e análise de dados

  1. Análise de peptídeo por espectrometria de massa em tandem-cromatografia líquida
    1. Reconstitua as frações peptídicas secas de passo 5.3.7 em 15 μL de água contendo 0,1% de ácido fórmico. Verificar o pH de peptídeos reconstituídos por manchar 1 μL da solução em uma faixa de pH (o pH deve ser abaixo dos 3).
    2. Injete a amostra de reconstituir a coluna de cromatografia líquida (LC). Aplica um gradiente apropriado de solvente (solvente é água contendo 0,1% de ácido fórmico, solvente B é ACN contendo 0,1% de ácido fórmico) em cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC). Um típico gradiente de solvente B é como segue: 5% - 35% em 40 min; 35% - 70% em 4 min; e realizada em 75% por 10 min.
    3. Ionizar os peptídeos eluted por electrospray e operar o espectrômetro de massa no modo dependente de dados. Selecione 15 íons mais abundantes (multiplique carregada: 2 +, 3 + ou superior) no MS inicial digitalizar para um exame de espectrometria de massa (MS/MS) em tandem (dissociação induzida por colisão, CID). Definir o tamanho de exclusão dinâmica para 500 com um tempo de duração máxima de 25 s.
  2. Identificação de proteínas e quantificação usando MaxQuant 31
    1. Definir a taxa falsa da descoberta (FDR) de identificação de proteínas para 0,01 e definir o número de peptídeos exclusivos para 2 para aumentar a precisão e confiabilidade.
    2. Conjunto o mínimo necessário a relação conta (exclusivo + razor) para quantificação de proteína para 2 e permitir a re-quantificar e combinar entre as execuções de funções.
  3. Avaliação de significância de enriquecimento com o R/Bioconductor pacote se 32
    1. Executar um moderado t-teste implementado em se para testar a alteração Log2-dobra contra zero pelo menos três repetições biológicas. Use a função read.table para ler a tabela de dados. Em seguida, use as funções lmFit e eBayes de dados apropriado. Use a função topTable para exportar os resultados de cálculo (incluindo os valores de P e mudança de Log2-dobra em média).
    2. Corrigi os valores de P , usando o método Benjamini – Hochberg para controlar o FDR.
    3. Aplica um FDR de 0,01 para gerar uma lista das proteínas significativamente enriquecido nas amostras experimentais. Defina um limite de dois - ou tríplice mudança para controlar os falsos positivos.

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Representative Results

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São apresentados os resultados representativos das etapas de controle de qualidade. Os resultados incluem figuras da análise de fluorescência em-gel descrito na etapa 2.3.2 (Figura 1), a análise ocidental do borrão descrito na etapa 4.1.3 (Figura 2A) e a análise é de coloração prata descrito na etapa 4.2.2 (Figura 2B). As etapas de controle de qualidade são essenciais para a otimização de protocolos CARIC. Sempre inclua controles de qualidade na preparação de experiências de identificação RBP em grande escala.

Figure 1
Figura 1: em gel-análise de fluorescência das amostras clique-rotulado descrito na etapa 2.3.2. (A) este painel mostra uma típica em-gel fluorescência padrão de amostras clique-rotulados. Só o duplamente rotulado mostra uma banda forte mancha em um alto peso molecular (> 250 kDa), que representa o sinal de RNPs reticulados. Para abolir o sinal da RNP, omitir ou 4SU ou UE ou digerir com RNase A. As bandas de fundo afiada em um peso molecular inferior representam os sinais de rotulado de proteínas não-específica. (B) em algumas ocasiões, uma forte banda manchada (~ 130-250 kDa) pode ser observada na amostra no4SU-controle. Esta banda representa o sinal de RNAs uncross vinculados rotulados, que será degradado durante a desnaturação do calor, para a maioria dos casos. Isso não interferirá com os procedimentos subsequentes. CBB = Coomassie azul brilhante. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: controle de qualidade de eficiência de pulldown de afinidade e os capturado RBPs. (A), este painel mostra uma análise ocidental do borrão da biotina sinaliza em amostras antes pulldown (entrada) e em amostras após pulldown (sobrenadante). Estimar a proporção dos restantes sinais e otimizar a quantidade de grânulo usada na etapa 3.1.1. (B) este painel mostra uma análise de prata-mancha do RBPs capturados em comparação com 0,1% de proteínas totais entrada. Para as células HeLa, a eficiência de captura total geral é ~0.05% - 0.1% de proteínas de entrada. Este valor pode variar significativamente, devido à variação da eficiência metabólica rotulagem dos diferentes tipos de células. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: resultados de MS de representante de CARIC. (A), este painel mostra uma trama de vulcão exibindo a média Log2-dobra mudar e ajustado P valores de proteínas quantificadas, calculadas pelo pacote se. 597 de proteínas com uma mudança de Log2-dobra de > 2 e um valor de P ajustado de < 0,01 foram classificados como "CARIC RBPs". (B), este painel mostra a sobreposição das proteínas CARIC com poli humanos identificados anteriormente RBPs7,8,9,10,11. As proteínas sobrepostas são principalmente codificação RBPs, enquanto o resto do RBPs CARIC são mais propensos a ser não-codificantes RBPs. Esta figura é um reimpresso de trabalho anteriormente publicado com permissão da National Academy of Sciences27. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

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A manutenção da integridade de RNA justa é uma das chaves para experiências bem sucedidas de CARIC. Com ligantes apropriadas de Cu(I) e operação cuidadosa, degradação de RNA pode ser significativamente reduzida, embora tenha sido observada degradação parcial. As taxas de substituição da UE e 4SU em amostras experimentais são 1,18% e 0,46%, respectivamente (dados não mostrados). Para RNAs intactas com um comprimento de 2.000 nt, ~ 90% de RNAs conter pelo menos um da UE e um 4SU. Para parcialmente degradadas RNAs com um comprimento de 1.000 nt, ~ 70% dos RNAs conter pelo menos um da UE e um 4SU. Portanto, degradação parcial de RNAs não drasticamente diminui a eficiência de CARIC, enquanto a degradação grave não é aceitável.

Outro passo crítico é passo 1.4, a preparação para a reação de clique. O Cu (I)-reação catalisada clique em RNAs é sensível à concentração de LDS. Alta concentração (> 0,1%) de LDS conduzirá a uma diminuição de rotulagem sinais na EU-contendo RNAs e um aumento dos sinais de fundo sobre proteínas (dados não mostrados).

Além de UE, CARIC também é compatível com outros nucleosídeos clicáveis, como análogos de alceno e azido de adenosina33,34,35,36. No entanto, a aplicação de CARIC é significativamente limitada pela eficiência metabólica de nucleosídeos clicáveis não naturais em um sistema biológico de interesse. Portanto, antes de executar CARIC usando condições diferentes das que demonstrou neste protocolo, verifique sempre a rotulagem eficiência metabólica (por exemplo, pela imagem fluorescente).

Recentemente, uma estratégia semelhante chamada RICK (captura da interactome recém transcrito de RNA usando química clique), que incorpora só UE para rotular RNAs totais e usa UV 254 nm para cross-link RNAs e proteínas, foi relatado37. Notavelmente, UV 254 nm pode ativar todos os quatro nucleosídeos naturais, bem como EU. Assim, irradiação de UV 254 nm pode cross-link enciclopédia da UE e dos seus metabolitos (por exemplo, EU fosfatos) com proteínas de ligação correspondente, que devem ser tida em consideração como possíveis falsos positivos.

Uma aplicação intrigante de CARIC é identificar RBPs em bactérias cujas RNAs são principalmente não-polyadenylated. A identificação em larga escala do RBPs fornecerá recursos inestimáveis para entender a base molecular dos regulamentos posttranscriptional em bactérias38.

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Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgments

Este trabalho é apoiado pelo nacional ciências naturais Fundação de China bolsas 91753206, 21425204 e 21521003 e pelo nacional chave de pesquisa e desenvolvimento do projeto 2016YFA0501500.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HeLa ATCC
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) Thermo Fisher Scientific 11995065
FBS (Fetal Bovine Serum) Thermo Fisher Scientific 10099141
Penicillin & Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122
EU (5-ethynyl uridine) Wuhu Huaren Co. CAS:69075-42-9
4SU (4-thiouridine) Sigma Aldrich T4509
10×PBS (Phosphate-Buffered Saline) Thermo Fisher Scientific AM9625
UV cross-linker UVP CL-1000 Equiped with 365-nm UV lamp
DEPC (Diethyl pyrocarbonate) Sigma Aldrich D5758 To treat water. Highly toxic!
Tris·HCl, pH 7.5 Thermo Fisher Scientific 15567027
LiCl Sigma Aldrich 62476
Nonidet P-40 Biodee 74385
EDTA-free protease inhibitor cocktail Thermo Fisher Scientific 88265 One tablet for 50 mL lysis buffer.
LDS (Lithium dodecyl sulfate) Sigma Aldrich L9781
15-mL ultrafiltration tube (10 kDa cutoff) Millipore UFC901024
0.5-mL ultrafiltration tube (10 kDa cutoff) Millipore UFC501096
Streptavidin magnetic beads Thermo Fisher Scientific 88816
DMSO (Dimethyl sulfoxide) Sigma Aldrich 41639
Azide-biotin Click Chemistry Tools AZ104
Copper(II) sulfate Sigma Aldrich C1297
THPTA [Tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl)amine] Sigma Aldrich 762342
Sodium ascorbate Sigma Aldrich 11140
Azide-Cy5 Click Chemistry Tools AZ118
LDS sample buffer (4×) Thermo Fisher Scientific NP0008
10% bis-Tris gel Thermo Fisher Scientific NP0301BOX
EDTA Thermo Fisher Scientific AM9260G
RNase A Sigma Aldrich R6513
SDS (Sodium dodecyl sulfate) Thermo Fisher Scientific 15525017
NaCl Sigma Aldrich S3014
Brij-97 [Polyoxyethylene (20) oleyl ether] J&K 315442
Triethanolamine Sigma Aldrich V900257
Streptavidin agarose Thermo Fisher Scientific 20353
Urea Sigma Aldrich U5378
Sarkosyl (N-Lauroylsarcosine sodium salt) Sigma Aldrich 61743
Biotin Sigma Aldrich B4501
Sodium deoxycholate Sigma Aldrich 30970
MaxQuant Version: 1.5.5.1

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References

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Captura e identificação de proteínas de ligação de RNA usando clique química assistida RNA-interactome capturam estratégia (CARIC)
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Huang, R., Han, M., Meng, L., Chen, X. Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) Strategy. J. Vis. Exp. (140), e58580, doi:10.3791/58580 (2018).More

Huang, R., Han, M., Meng, L., Chen, X. Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) Strategy. J. Vis. Exp. (140), e58580, doi:10.3791/58580 (2018).

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