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Biochemistry

Captura e identificación de proteínas de unión a RNA usando Click química asistida por ARN-interactoma capturan (CARIC) estrategia

doi: 10.3791/58580 Published: October 19, 2018
* These authors contributed equally

Summary

Un protocolo detallado para la aplicación de la haga clic en ayuda de química RNA interactoma estrategia de captura (CARIC) para identificar proteínas de enlace de codificación de ambas y los RNAs se presenta.

Abstract

Una completa identificación de proteínas de unión a RNA (restrictivas) es clave para entender la red de regulación postranscripcional en las células. Una estrategia ampliamente utilizada para la captura RBP explota la poliadenilación [poly(A)] de RNAs de destino, que ocurre sobre todo en eukaryotic mRNAs maduros, dejando la mayoría proteínas de non-poly(A) RNAs no identificados. Aquí describimos los procedimientos detallados de un método reciente denominado haga clic en ayuda de química RNA interactoma captura (CARIC), que permite la captura de todo el transcriptoma de poly(A) y non-poly(A) restrictivas combinando el etiquetado metabólico de RNAs en vivo UV Cross-linking y etiquetado bioorthogonal.

Introduction

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El genoma humano se transcribe en distintos tipos de codificación y noncoding RNAs (ncRNAs), incluyendo mRNAs, rRNAs y tRNAs, ARNs nucleares pequeños (snRNAs), RNAs nucleolares pequeño (ARNnop ' s) y largo no-codificación RNAs (lncRNAs)1. La mayoría de estos RNAs posee ropa de prácticas comerciales restrictivas y funciona como ribonucleoproteína partículas (RNPs)2. Por lo tanto, una identificación integral de prácticas comerciales restrictivas es un prerrequisito para la comprensión de la red reguladora entre RNAs y prácticas comerciales restrictivas, que está implicada en varias enfermedades humanas3,4,5.

Los últimos años han sido testigos de un gran refuerzo de prácticas comerciales restrictivas en varios sistemas eucariotas2,6, incluyendo humano7,8,9,10,11, ratón12,13,14, levadura9,15,16, pez cebra17, Drosophila melanogaster18,19 , Elegans de Caenorhabditis16, thaliana de Arabidopsis20,21,22y23,de parásitos humanos24,25 . Estos avances se han facilitado por una estrategia de captura RBP desarrollada por Castello et al. 7 y Baltz et al. 8 en el 2012, que combina en vivo UV Cross-linking de RNA y sus proteínas interactuantes, captura de oligo(dT) de poly(A) RNAs y espectrometría de masas (MS)-basado en perfiles proteómicos. Sin embargo, dado el hecho de que poly(A) existe sobre todo en los mRNAs maduros, que cuenta para solamente ~ 3-5% de los eucariotas transcriptoma26, esta estrategia ampliamente utilizada no es capaz de capturar restrictivas interactuando con non-poly(A) RNAs, incluyendo la mayoría ncRNAs y pre-mRNAs.

Aquí, Divulgamos los procedimientos detallados de una estrategia desarrollada recientemente para la captura de todo el transcriptoma de prácticas comerciales restrictivas de poly(A) y non-poly(A)27. Denomina CARIC, esta estrategia combina en vivo UV Cross-linking y el etiquetado metabólico de RNAs con photoactivatable y "clickable" nucleósidos análogos (que contienen un grupo funcional de bioorthogonal que participan en la reacción de clic), 4 - thiouridine (4SU) y 5-ethynyluridine (UE). Pasos que son claves para obtener resultados ideales con la estrategia de CARIC son etiquetado metabólico eficiente UV Cross-linking y haga clic en la reacción y el mantenimiento de la integridad del RNA. Porque el Cu(I) utilizada como catalizador en la reacción de clic puede causar la fragmentación del ARN, un ligando de Cu(I) que puede reducir la fragmentación de la RNA es esencial. Describimos cómo realizar reacciones eficientes clic en lysates de la célula sin causar grave degradación de RNA.

Aunque RBP captura e identificación de las células HeLa sólo se describe en el presente Protocolo, la estrategia de CARIC puede aplicarse a varios tipos de células y posiblemente a los organismos vivos. Además captura las prácticas comerciales restrictivas, este protocolo también proporciona procedimientos paso a paso ágil para preparación de muestras de MS y proteína identificación y cuantificación, que puede ser útil para aquellos que no están familiarizados con los experimentos de la proteómica.

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Protocol

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PRECAUCIÓN: Cuando sea aplicable, los reactivos usados deben comprar en forma de libre de Rnasa, o disuelto en libre de Rnasa, solventes (para la mayoría de los casos, en dietil pirocarbonato (DEPC)-agua tratada). Al manipular las muestras de RNA y reactivos libres de Rnasa, siempre use guantes y máscaras y cambiarlos frecuentemente para evitar la contaminación de la Rnasa.

1. preparación de lisado de etiquetado metabólico y las células reticuladas UV

  1. Incorporación metabólica de UE y 4SU
    1. Células HeLa de cultura en el medio modificado Eagle de Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% suero bovino fetal (FBS), 100 U/mL de penicilina y estreptomicina 100 de μg/mL a 37 ° C en una atmósfera de 5% CO2 . ~ 4 x 107 células de HeLa (en dos platos de 15 cm) de la cultura para la preparación de uno experimental o de control de muestra para una que carrera de MS estándar.
    2. Cuando las células HeLa cultivadas alcanzan confluencia de ~ 80%, retire el medio de cultivo y añadir 15 mL de medio fresco precalentado por 15 cm plato.
    3. Añadir 15 μL por plato de 100 mM EU (disuelto en solución salina tamponada con fosfato (PBS)) a una concentración final de 1 mM y 7.5 μL por plato de 100 mM 4SU (disuelta en PBS) a una concentración final de 0,5 mM para experimental y muestras de control de la noUV. Añadir 15 μL por plato de 100 mM EU (disuelta en PBS) a una concentración final de 1 mM para muestras de control de no4SU.
      Nota: 4SU es foto-activatable; por lo tanto, se requiere protección de la luz después de agregar 4SU.
    4. Cubre los platos con papel de aluminio y cultura las células para 16 h. agregar la mitad de la cantidad de la UE y 4SU o sólo UE de paso 1.1.3 a la experimental, noUV y muestras de control de no4SU, respectivamente y continuar el cultivo por otro 2 h.
  2. En vivo UV Cross-linking
    1. Retire el medio de cultivo, lavar las células 3 x con 5 mL de PBS por plato y PBS residual de quitar tanto como sea posible.
      Nota: Líquido residuo significativamente reduce eficacia Cross-linking.
    2. Para experimental y muestras de control de no4SU, coloque los platos en hielo con la tapa quitada y se irradian las células con luz a 2 J/cm2 de un vinculante UV Ultravioleta de 365 nm.
    3. Para muestras de control de la noUV, coloque las placas de hielo y protegerlos de la luz.
      Nota: Todos los pasos siguientes para muestras de control de la noUV deben realizarse en una habitación oscura.
  3. Lisis celular y la homogeneización
    1. Añada 1 mL por caja de tampón de lisis previo (10 mM Tris∙HCl, pH 7.5, 50 mM ácido LiCl 0,02% Nonidet P-40 y etilendiaminotetracético (EDTA)-Cóctel de inhibidor de la proteasa libre) a las células. Raspar las células usando un levantador de caucho celular y recoger la lisis previa suspensión en un tubo de 15mL.
      Nota: Este paso romper la membrana celular y liberan proteínas citoplasmáticas soluble y RNAs. No el tubo de centrífuga y eliminar el sobrenadante.
    2. Para la suspensión de los dos platos de 15 cm, ajuste el volumen a 6 mL mediante la adición de tampón de lisis previo. Añadir a la suspensión de la lisis de un volumen igual de buffer de lisis I (200 mM Tris∙HCl, pH 7,5, LiCl, de 500 mM 2% litio dodecil sulfato [LDS]).
    3. Homogeneizar el lisado celular haciéndola pasar por una jeringa con una aguja estrecha (27 G) varias veces hasta que el lisado es clara y homogénea. Incubar el lisado a 4 ° C con rotación suave (~ 15 rpm) durante 1 hora.
      Nota: Este último paso permite la completa desnaturalización de las proteínas. El lisado puede se puedan almacenar a-70 ° C hasta por un mes.
  4. Preparación para la reacción de clic
    1. Diluir el lisado mediante la adición de 20 volúmenes de tampón de dilución (50 mM Tris∙HCl, pH 7,5) y dividirlo en fracciones de 15 mL.
      Nota: Las soluciones que contienen una alta concentración de sal y detergente pondrá en peligro la eficacia de la Cu (I)-catalizado reacción del clic; por lo tanto, debe cambiarse el tampón del lisado.
    2. Concentrar cada fracción usando un tubo de 15 mL ultrafiltración (con un límite de peso molecular de 10 kDa) hasta que el volumen es menor de 1 mL. Usar un rotor oscilante-cubo para hacer girar el tubo de ultrafiltración a 4.000 x g a 4 ° C ~ 15 minutos.
    3. Añadir 14 mL de tampón de dilución de la fracción concentrada de lisado y repita paso 1.4.2. Combine las fracciones y concentrarlos en un volumen de 6 mL por ultrafiltración (4.000 x g a 4 ° C ~ 15 minutos).
      Nota: La mayoría de la sal y la voluntad LDS ahora eliminarse, así que el lisado es listo para la reacción de clic. El lisado puede conservarse a-70 ° C hasta una semana. Evitar múltiples ciclos de hielo-deshielo, porque resultan de significativa degradación del RNA. Alícuota del lisado en caso de caracterizaciones en pequeña escala.

2. preparación de las muestras de RNA-interactoma captura

  1. Preclearing del lisado
    1. Añadir granos magnéticos de 100 μL estreptavidina por 6 mL de lisado y gire suavemente (~ 15 rpm) por 30 min a temperatura ambiente para eliminar naturalmente las proteínas biotiniladas.
    2. Los granos con un imán (de ~ 20 min a 4 ° C) y la transferencia la precleared lisado a un tubo nuevo de pellets.
  2. Rendimiento de la reacción de clic
    1. Preparar la mezcla de reacción: 6,5 μL del stock de biotina (100 mM azida-biotina disuelta en dimetilsulfóxido [DMSO] a una concentración final de 100 μM), 3.25 μL del stock cobre (hacerla fresca; 1 M CuSO4 disuelto en agua a una concentración final de 500 μM) , 65 μL del stock de ligando (200 mM THPTA disuelto en agua a una concentración final de 2 mM) y 262.75 μL de H2O.
      Nota: THPTA significa amina de Tris [(1-hydroxypropyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl) metil].
    2. Añadir la mezcla de reacción a 6 mL de precleared lisado y mezclar bien. Luego agregue 162,5 μL de reactivo de reducir (hacer fresco; ascorbato de sodio 40 mg/mL en una concentración final 5 mM) para el lisado y mezclar bien. El volumen final debe ser de 6,5 mL.
    3. Incubar la mezcla de reacción durante 2 h a temperatura ambiente en un agitador orbital (800 rpm). Añadir 5 mM EDTA a la mezcla de reacción e incubar por 5 minutos calmar la reacción.
  3. Caracterizaciones en pequeña escala
    1. Preparar la mezcla de reacción como en el paso 2.2.1 con la acción de la biotina sustituido por acción de tinte (por ejemplo, 100 mM de azida-Cy5 disuelto en DMSO).
      Nota: La cantidad de reactivo debe ser ajustada según el volumen de lisado. Por lo general, una alícuota de 20 μL del lisado basta caracterizaciones tales como un análisis de la fluorescencia en gel.
    2. Añadir la mezcla de reacción para el lisado e incubar por 2 h a temperatura ambiente. Añadimos un tercio del volumen del Sud del tampón de muestra (4 x), desnaturalizar a 55 ° C por 5 min y resolver la muestra en un gel de bis-Tris de 10%.
      Nota: Para confirmar que la señal de fluorescencia se presenta en RNAs, incluyen controles con digestión Rnasa A después de la reacción de clic.
  4. Limpieza de la mezcla de reacción
    1. Añadir ocho volúmenes de metanol prechilled (100%) a la mezcla de reacción apagado e incubar durante 30 min a-30 ° C precipitación. Realizar la precipitación en los tubos de centrífuga cónico de 50 mL.
      Nota: Si el volumen total es mayor de 50 mL, dividir la mezcla de reacción en dos tubos de centrífuga cónico de 50 mL.
    2. Preparar el tampón de reconstitución: combinar un volumen de tampón A (dodecil sulfato de sodio al 4% [SDS] y 10 mM EDTA) con ocho volúmenes de tampón B (1% trietanolamina Brij 97 y 150 mM NaCl, 50 mM, pH 7,4).
    3. Centrifugar a 4.000 x g durante 15 min a 4 ° C y descarte el sobrenadante. Añadir ~ 1-2 mL de metanol prechilled a la pelotilla. Pipetee hacia arriba y hacia abajo para romper los pellets y asegúrese de que el sedimento se suspende completamente con ninguna trozos visibles. Llenar el tubo con prechilled metanol. Repetir este paso 2 x.
    4. Centrifugar a 4.000 x g durante 15 min a 4 ° C y descarte el sobrenadante. Coloca nuevamente en que los tubos y centrifugar a 4.000 x g por 5 min con cuidado sacar el metanol residual tanto como sea posible sin perturbar el pellet.
    5. Añadir 10 mL de tampón de reconstitución de la pelotilla. Pipetee hacia arriba y hacia abajo para disolver el precipitado. Centrifugar a 4.000 x g por 10 min a 4 ° C.
    6. Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo. Recoger 20 μL de la muestra para control de calidad (véase sección 4).
      Nota: Ahora, la muestra está lista para captura de RNA interactoma. La muestra reconstituida puede almacenarse a-70 ° C hasta una semana.

3. ARN-interactoma captura

  1. Preparación de las perlas de agarosa estreptavidina
    1. Tener 1.600 μL de mezcla de estreptavidina-agarosa (800 μL de perlas colocadas) por 10 mL de muestra reconstituida en un tubo de centrífuga cónico de 15 mL.
    2. Desactivación de los granos a 4000 x g por 5 minutos Retire con cuidado el sobrenadante sin molestar a los granos colocados.
    3. Lavar los granos con 10 mL de 50 mM Tris∙HCl (pH 7.5). Desactivación de los granos (4.000 x g durante 5 min) y eliminar el sobrenadante. Repetir este paso 2 x.
  2. Desplegable de afinidad
    1. Transferir la muestra limpia y reconstituida de paso 2.4.6 a las perlas de agarosa estreptavidina (ver paso 3.1). Incubar durante una noche con rotación suave a 4 ° C.
  3. Lavado de los granos de estreptavidina
    1. Desactivación de los granos (4.000 x g durante 5 min) y transferir el sobrenadante a un tubo nuevo. Recoger 20 μL de la muestra para control de calidad.
    2. Lavar los granos con 10 mL de tampón de lavado (SDS de 2% en PBS, pH 7,4). Incubar por 10 min con rotación suave (~ 12 rpm) a temperatura ambiente. Desactivación de los granos (4.000 x g durante 5 min) y eliminar el sobrenadante. Repetir 1 x.
    3. Repita el paso 3.3.2, con tampón de lavado B (8 M de urea y 250 mM NH4HCO3 disuelto en agua). Repita el paso 3.3.2 con tampón de lavado C (2.5 M NaCl en PBS, pH 7,4). Luego, lavar los granos con 10 mL de 50 mM Tris∙HCl (pH 7.5). Desactivación de los granos (4.000 x g durante 5 min) y eliminar el sobrenadante.
    4. Dividir los granos uniformemente y transferirlas a tubos de microcentrífuga de 1,5 mL dos.
  4. Elución de las RNPs capturados
    1. Preparar el tampón de elución de biotina: biotina de 12,5 mM, 75 mM de NaCl, 7,5 Tris∙HCl (pH 7,5), EDTA 1,5 mM, 0.15% SDS, sarkosyl de 0.075% y desoxicolato de sodio 0,02%.
      Nota: Tienda el buffer a temperatura ambiente, para la biotina puede precipitar a 4 ° C.
    2. A 400 μL de perlas colocadas lavadas, añadir 400 μL de tampón de elución de biotina.
    3. Les Incube en un agitador orbital (1.500 rpm) a temperatura ambiente durante 20 minutos. Luego, incubar en un agitador orbital con un bloque de calor (1.500 rpm, 65 ° C) durante 10 minutos de la vuelta a los granos (7.800 x g durante 1 min) y recoger el RNP eluída.
    4. A los granos, añadir 400 μL de tampón de elución de biotina fresca y repetir el paso 3.4.3. Combinar los dos elutes en un tubo de 15 mL.
  5. Digestión Rnasa
    1. Añadir tres volúmenes de tampón de dilución para la RNP eluída a disminuir la concentración de SDS. Concentrar la muestra diluida utilizando un tubo de 0,5 mL de ultrafiltración (con un corte de peso molecular de 10 kDa; vuelta a 12.000 x g a 4 ° C para 30 min) a ~ 40 μL.
    2. Añadir 0,5 μg/μL de ARNasa A e incubar por 2 h a 37 ° C para liberar prácticas comerciales restrictivas de RNAs reticulados. Recoger 2 μL de prácticas comerciales restrictivas para el control de calidad (véase sección 4).

4. Control de calidad

  1. Control de la eficacia de la afinidad de telecine
    1. Tomar 10 μL de la muestra "antes de la desconexión" de paso 2.4.6 y 10 μL de la muestra "después de la desconexión" de paso 3.3.1.
    2. Analizar las muestras utilizando procedimientos estándar inmunoblot (gel 10% bis-Tris).
    3. La membrana de fluoruro (PVDF) del polivinilideno con conjugado estreptavidina-HRP para monitorear las señales de biotina del residuo de la muestra "después de la desconexión" de la mancha.
      Nota: Si la señal de la biotina de la muestra "después de la desconexión" es mayor que un quinto de la señal de la muestra "antes de la desconexión", aumentar la cantidad de perlas de estreptavidina-agarosa utilizadas en paso 3.1.1.
  2. Control de la eficiencia de la captura total
    1. Tomar 2 μL de la muestra RBP lanzada desde paso 3.5.2 y 0,5 μL de la muestra "antes de la desconexión" (como entrada de 0.1%) de paso 2.4.6.
    2. Analizar las muestras utilizando procedimientos estándar de tinción de plata.
      1. Fije el gel con tampón de fijación (40% de etanol, ácido acético al 10%) por 20 min seguido de sensibilización (m 13 Na2S2O3, 83 mM acetato de sodio, etanol 30%) durante 30 minutos.
      2. Lavar el gel 3 x con agua durante 5 minutos y, luego, se mancha con una solución de AgNO3 por 20 min lavado de 15 mM el gel 2 x con agua durante 1 minuto, desarrollarlo en 0,24 M Na2CO3 y 0.012% formaldehído y terminar con 45 mM EDTA cuando la tinción es suffici ENT.
        Nota: La intensidad de tinción de plata de las prácticas comerciales restrictivas capturados debe ser similar a la de la entrada de 0.1%.

5. preparación de las muestras de MS

  1. En el gel de la digestión de la tripsina de prácticas comerciales restrictivas capturados 28
    1. Agregar un cuarto volumen SDS del tampón de muestra (x 5) a las muestras RBP lanzadas desde paso 3.5.2. Desnaturalice la muestra a 95 ° C durante 10 minutos.
    2. Resolver las prácticas comerciales restrictivas en un gel de SDS-poliacrilamida de 1.5mm de 10%.
    3. Teñir el gel con plata, siguientes protocolos estándar.
    4. Suprimir el carril de la muestra experimental o muestra de control con el gel de apilamiento y la gran banda de Rnasa A (~ 15 kDa) quitado.
    5. Cortar el carril suprimido en trozos pequeños (~ 1-1.5 x ~ 1-1.5 mm).
      Nota: El borde más corto de la pieza de gel debe ser no menor de 1 mm para evitar atascamientos en las puntas de pipeta.
    6. Transferir las piezas de gel a un tubo de microcentrífuga y desmanchar con tampón de extracción (una mezcla de volúmenes iguales de Na2S2O3 de 100 mM y 30 mM K3[Fe(CN)6]).
    7. Lave las piezas de gel con bicarbonato de amonio de 200 mM (ABC) hasta que las piezas de gel son totalmente incoloras.
    8. Deshidrate las piezas de gel de 1 mL de aseado acetonitrilo (ACN). Rehidratar con 200 μL de 10 mM Ditiotreitol (disuelto en 50 mM ABC) e incubar a 56 ° C durante 45 minutos.
      Nota: Piezas de gel totalmente deshidratado deben ser muy duro y opaco. Si la pieza de gel todavía después de la deshidratación, eliminar el ACN y añadir 1 mL de ACN aseado para deshidratar otra vez.
    9. Enfriar las piezas de gel a temperatura ambiente. Añadir 200 μL de 58 mM Yodoacetamida (disuelto en 50 mM ABC) e incubar a temperatura ambiente durante 45 minutos en la oscuridad.
    10. Después de un breve lavado con agua, se deshidratan las piezas de gel de 1 mL de ACN aseado.
      Nota: Las piezas de gel deben ser completamente deshidratadas.
    11. Rehidratar las piezas de gel con la cantidad apropiada de 10 tripsina ng/μL (disuelto en 50 mM ABC) e incubar a 37 ° C durante 12-16 h.
      Nota: Las piezas de gel deben ser completamente rehidratadas con no núcleos opacos. Retire el exceso de líquido.
  2. Isótopos estables dimetil etiquetado de los péptidos digeridos 29
    1. Extraiga los péptidos digeridos de las piezas de gel mediante la adición de 200 μL de tampón de extracción (ácido fórmico al 5% y 50% ACN en agua) e incubar a 37 ° C durante 30 minutos con Vortex (a 1.200 rpm).
    2. Repita el paso 5.2.1 x 2. Combinar los extractos en un tubo de microcentrífuga.
    3. Seque los péptidos extraídos por centrifugación vacío.
    4. Reconstituir los péptidos en 200 μL de bicarbonato de Trietilamonio 100 mM (TEAB, pH 8,5).
      PRECAUCIÓN: Pasos 5.2.4 - 5.2.6 deben realizarse sobre el hielo en una campana de humos.
    5. Añadir 8 μL 4% CH2O y 8 μL de 4% 13CD2O en el experimental y las muestras de control, respectivamente.
      Nota: Para controlar el sesgo de etiquetado isotópico estable, intercambiar el isótopo estable de experimental y control de las muestras de la repetición de otros biológicamente independiente.
    6. Añadir 8 μL de 0,6 M NaBH3CN (hacer fresco) y mezclar bien.
    7. Incubar las muestras a temperatura ambiente durante 1 h con un vórtex.
    8. Enfriar las muestras en hielo. Calmar la reacción añadiendo 32 μL de solución acuosa de amoníaco 1%. Luego, más apagar la reacción mediante la adición de 16 μL de ácido fórmico.
    9. La muestra experimental con la muestra de control correspondientes se combinan en un tubo de microcentrífuga. Secar las muestras por centrifugación vacío.
  3. Fraccionamiento de péptidos marcados con dimetil
    1. Preparar el stop y go extracción consejos (StageTips)30.
      1. Inserte una punta de 10 μL de la extendido-longitud, a una membrana de C18.
      2. Añadir 300 μg de granos de C18 de alto pH suspendido en ACN a la punta.
      3. Coloque la punta en un tubo de microcentrífuga con un bastidor casero que puede estabilizar la punta y levantar la punta de la parte inferior.
      4. Girar la punta en 1.400 x g durante 2 minutos, descartar el flujo a través.
      5. Lavar la punta con 50 μL de 80% ACN en 10 mM ABC (pH 10.0). Repetir 1 x.
        Nota: Ajustar el pH de 10 mM ABC solución mediante la adición de hidróxido de amonio 28%.
      6. Lavar la punta con 50 μL 50% ACN en 10 mM ABC (pH 10.0). Repetir 1 x.
      7. Lavar la punta con 50 μL de 10 mM ABC (pH 10.0). Repetir 1 x.
    2. Reconstituir los péptidos en 50 μL de 10 mM ABC (pH 10.0).
    3. Añadir la muestra reconstituida a la punta del preparado. Vuelva a cargar el paso a la punta para asegurar la Unión del péptido eficiente.
    4. Lavar la punta con 50 μL de 10 mM ABC (pH 10.0). Repetir 1 x.
    5. Eluir el péptido paso a paso para las 12 fracciones con 50 μL de 6%, 9%, 12%, 15%, 18%, 21%, 25%, 30%, 35%, 40%, 80% y 6% ACN en 10 mM ABC (pH 10.0).
    6. Dos fracciones se combinan con un intervalo igual (fracción 1 con 7, 2 8, y así sucesivamente) obtener seis combinados fracciones.
    7. Secar las muestras por centrifugación vacío. Los péptidos secos pueden conservarse a-30 ° C.

6. ejecución de la MS y análisis de datos

  1. Análisis de péptidos mediante espectrometría de tándem de cromatografía de líquido
    1. Reconstituir las fracciones secas péptido de paso 5.3.7 en 15 μL de agua que contiene 0.1% de ácido fórmico. Compruebe el pH de los péptidos reconstituidos por telescopio 1 μL de la solución sobre una tira de pH (el pH debe ser menores de 3 años).
    2. Inyectar la muestra de reconstituir en la columna de cromatografía líquida (LC). Se aplica un gradiente adecuado de disolvente (disolvente es el agua que contiene 0.1% de ácido fórmico, solvente B es ACN que contiene 0.1% de ácido fórmico) en cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC). Un gradiente típico de solvente B es como sigue: 5% - 35% en 40 minutos; 35% - 70% en 4 min; y celebrada en 75% durante 10 minutos.
    3. Ionizar los péptidos eluídos por electrospray y operar el espectrómetro de masas en el modo de datos dependientes. Seleccionar 15 iones más abundantes (multipliqúese cargado: 2 +, 3 + o más) en el MS inicial de análisis para un análisis de espectrometría de masas (MS/MS) tandem (disociación colisión-inducida, CID). Establecer el tamaño de exclusión dinámica 500 con un tiempo de duración máxima de 25 s.
  2. Identificación de proteínas y cuantificación utilizando MaxQuant 31
    1. Establece tarifa falsa del descubrimiento (FDR) de identificación de proteínas a 0.01 y establece el número de péptidos únicos en 2 para aumentar la exactitud y confiabilidad.
    2. Conjunto la mínima necesaria relación cuenta (único + Navaja) para cuantificación de proteínas a 2 y permiten el volver a cuantificar y fósforo entre funciones.
  3. Evaluación de la importancia de enriquecimiento mediante la R/Bioconductor paquete limma 32
    1. Realizar un moderado t-prueba en limma para probar el cambio doble Log2 contra cero de al menos tres réplicas biológicas. Utilice la función read.table para leer la tabla de datos. A continuación, utilice las funciones lmFit y eBayes para ajuste de datos. Utilice la función de topTable exportar los resultados de cálculo (incluyendo el promedio de doble Log2 de cambio y valores de P ).
    2. Corregir los valores de P mediante el método de Benjamini, Hochberg para el control de la FDR.
    3. Aplicar un FDR de 0.01 para generar una lista de proteínas enriquecida significativamente en las muestras experimentales. Establezca un corte de dos o tres cambios para controlar más los falsos positivos.

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Representative Results

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Se presentan los resultados representativos de pasos de control de calidad. Los resultados incluyen figuras de análisis en gel fluorescencia descrito en el paso 2.3.2 (figura 1), el análisis de western blot que se describe en el paso 4.1.3 (figura 2A) y el análisis de coloración de plata que se describe en el paso 4.2.2 (figura 2B). Las medidas de control de calidad son críticas para la optimización de protocolos CARIC. Incluir siempre controles de calidad en la preparación de los experimentos de identificación de las prácticas comerciales restrictivas a gran escala.

Figure 1
Figura 1: Análisis de fluorescencia de las muestras haga clic en etiqueta se describe en el paso 2.3.2 en gel. (A) este panel muestra un típico en gel fluorescencia patrones de muestras haga clic en etiqueta. Sólo el doblemente marcada muestra una banda fuerte frotis en un alto peso molecular (> 250 kDa), que representa la señal de RNPs reticulados. Para suprimir la señal de la RNP, omitir 4SU o EU o digest con Rnasa A. Las bandas de sharp de fondo con un peso molecular inferior representan las señales de etiqueta proteínas no específicas. (B) en algunas ocasiones, puede observarse una fuerte banda borrosos (~ 130-250 kDa) en la muestra de control de no4SU. Esta banda representa la señal de etiquetado RNAs uncross-vinculados, que se degradará durante la desnaturalización de calor, para la mayoría de los casos. No interferirán con los procedimientos posteriores. CBB = Coomassie azul brillante. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: control de calidad de afinidad telecine eficiencia y capturado de prácticas comerciales restrictivas. (A) este panel muestra señales de un análisis de western blot de la biotina en muestras antes de telecine (entrada) y en las muestras después de telecine (sobrenadante). Estimar la proporción de las restantes señales y optimizar la cantidad de grano usada en paso 3.1.1. (B) este panel muestra un análisis de coloración de plata de capturado restrictivas en comparación con 0,1% proteínas totales entrada. Para las células HeLa, la eficiencia de captura total general es ~0.05% - 0.1% de las proteínas de la entrada. Este valor puede variar significativamente debido a la variación de la eficiencia metabólica de etiquetado de diferentes tipos de células. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Representante MS resultados de CARIC. (A) este panel muestra una parcela de volcán mostrando el promedio Log2 veces cambiar y ajustar valores de P de proteínas cuantificadas, calculados por el paquete limma. 597 de proteínas con un cambio de doble Log2 de > 2 y un valor P ajustado < 0,01 fueron clasificados como "CARIC restrictivas". (B) este panel muestra la superposición de las proteínas CARIC con poly(A) humana previamente identificado prácticas comerciales restrictivas7,8,9,10,11. Las proteínas superpuestas sobre todo son codificación de prácticas comerciales restrictivas, mientras que el resto de las prácticas comerciales restrictivas CARIC tienen más probabilidades de ser no-codificación de prácticas comerciales restrictivas. Esta cifra es un reimpreso de trabajo anteriormente publicado con el permiso de la Academia Nacional de Ciencias27. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

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El mantenimiento de la integridad de RNA Feria es una de las claves del éxito experimentos CARIC. Con ligandos apropiados de Cu(I) y cuidado, degradación de RNA puede reducirse significativamente, aunque se observó degradación parcial. La sustitución de la UE y 4SU en muestras experimentales son 1.18% y 0,46%, respectivamente (datos no mostrados). Para RNAs intactos con una longitud de 2.000 nt, ~ 90% de los ARN contienen por lo menos un UE y uno 4SU. Para RNAs parcialmente degradados con una longitud de 1.000 nt, ~ 70% de los ARN contienen por lo menos un UE y uno 4SU. Por lo tanto, la degradación parcial de RNAs no disminuir considerablemente la eficacia de CARIC, degradación severa no es aceptable.

Otro paso fundamental es paso 1.4, la preparación para la reacción de clic. El Cu (I)-reacción catalizada clic en RNAs es sensible a la concentración de LDS. Una alta concentración (> 0.1%) de LDS conducirá a una disminución de etiquetar las señales en EU-que contienen ARN y un aumento de las señales de fondo en las proteínas (datos no mostrados).

Además de UE, CARIC también es compatible con otros nucleósidos clickable, como alkynyl y azido análogos de adenosina33,34,35,36. Sin embargo, la aplicación de CARIC está limitada significativamente por la eficiencia metabólica de nucleósidos antinaturales puede hacer clic en un sistema biológico de interés. Por lo tanto, antes de realizar CARIC condiciones distintas de las de uso demostrado en el presente Protocolo, compruebe siempre el etiquetado eficiencia metabólica (por ejemplo, por la proyección de imagen fluorescente).

Recientemente, una estrategia similar llamada RICK (captura del interactoma de RNA recién transcrito usando química del tecleo), que incorpora sólo UE para etiquetar el ARN total y utiliza UV de 254 nm para entrecruzar RNAs y proteínas, fue divulgado37. En particular, UV de 254 nm puede activar todos los cuatro nucleósidos naturales, así como EU. Por lo tanto, irradiación UV de 254 nm puede entrecruzar UE libre y sus metabolitos (p. ej., fosfatos de EU) con proteínas correspondientes, que deben ser tenidas en cuenta como posibles falsos positivos.

Una aplicación interesante de CARIC es identificar prácticas comerciales restrictivas en bacterias que RNAs son en su mayoría no cofia. La identificación a gran escala de prácticas comerciales restrictivas proporcionará recursos inestimables para comprender la base molecular del Reglamento postranscripcional en bacterias38.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este trabajo es apoyado por la nacional Ciencias naturales Fundación de China becas 91753206, 21425204 y 21521003 y por la nacional clave de investigación y proyecto de desarrollo 2016YFA0501500.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HeLa ATCC
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) Thermo Fisher Scientific 11995065
FBS (Fetal Bovine Serum) Thermo Fisher Scientific 10099141
Penicillin & Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122
EU (5-ethynyl uridine) Wuhu Huaren Co. CAS:69075-42-9
4SU (4-thiouridine) Sigma Aldrich T4509
10×PBS (Phosphate-Buffered Saline) Thermo Fisher Scientific AM9625
UV cross-linker UVP CL-1000 Equiped with 365-nm UV lamp
DEPC (Diethyl pyrocarbonate) Sigma Aldrich D5758 To treat water. Highly toxic!
Tris·HCl, pH 7.5 Thermo Fisher Scientific 15567027
LiCl Sigma Aldrich 62476
Nonidet P-40 Biodee 74385
EDTA-free protease inhibitor cocktail Thermo Fisher Scientific 88265 One tablet for 50 mL lysis buffer.
LDS (Lithium dodecyl sulfate) Sigma Aldrich L9781
15-mL ultrafiltration tube (10 kDa cutoff) Millipore UFC901024
0.5-mL ultrafiltration tube (10 kDa cutoff) Millipore UFC501096
Streptavidin magnetic beads Thermo Fisher Scientific 88816
DMSO (Dimethyl sulfoxide) Sigma Aldrich 41639
Azide-biotin Click Chemistry Tools AZ104
Copper(II) sulfate Sigma Aldrich C1297
THPTA [Tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl)amine] Sigma Aldrich 762342
Sodium ascorbate Sigma Aldrich 11140
Azide-Cy5 Click Chemistry Tools AZ118
LDS sample buffer (4×) Thermo Fisher Scientific NP0008
10% bis-Tris gel Thermo Fisher Scientific NP0301BOX
EDTA Thermo Fisher Scientific AM9260G
RNase A Sigma Aldrich R6513
SDS (Sodium dodecyl sulfate) Thermo Fisher Scientific 15525017
NaCl Sigma Aldrich S3014
Brij-97 [Polyoxyethylene (20) oleyl ether] J&K 315442
Triethanolamine Sigma Aldrich V900257
Streptavidin agarose Thermo Fisher Scientific 20353
Urea Sigma Aldrich U5378
Sarkosyl (N-Lauroylsarcosine sodium salt) Sigma Aldrich 61743
Biotin Sigma Aldrich B4501
Sodium deoxycholate Sigma Aldrich 30970
MaxQuant Version: 1.5.5.1

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References

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Captura e identificación de proteínas de unión a RNA usando Click química asistida por ARN-interactoma capturan (CARIC) estrategia
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Huang, R., Han, M., Meng, L., Chen, X. Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) Strategy. J. Vis. Exp. (140), e58580, doi:10.3791/58580 (2018).More

Huang, R., Han, M., Meng, L., Chen, X. Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) Strategy. J. Vis. Exp. (140), e58580, doi:10.3791/58580 (2018).

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