JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biochemistry

Fånga och identifiering av RNA-bindande proteiner med hjälp av klick kemi-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) strategi

Published: October 19, 2018
doi:
10.3791/58580
, , ,
1College of Chemistry and Molecular Engineering,Peking University, 2Beijing National Laboratory for Molecular Sciences,Peking University, 3Peking-Tsinghua Center for Life Sciences,Peking University, 4Synthetic and Functional Biomolecules Center,Peking University, 5Key Laboratory of Bioorganic Chemistry and Molecular Engineering of Ministry of Education,Peking University

Summary

Ett detaljerat protokoll för att tillämpa den Klicka på kemi-assisted RNA-interactome capture (CARIC) strategin för att identifiera proteiner som bindande för båda kodning och icke-kodande RNAs presenteras.

Abstract

En heltäckande identifiering av RNA-bindande proteiner (RBPs) är nyckeln till att förstå det postttransskriptionell regulatoriska nätverket i celler. En vanligt förekommande strategi för RBP fånga utnyttjar den polyadenylation [poly(A)] av målet RNAs, vilket oftast sker på eukaryota mogen mRNA, lämnar de flesta bindningsproteiner på non-poly(A) RNAs oidentifierade. Här beskriver vi de detaljerade förfarandena för en nyligen rapporterade metod kallas Klicka kemi-assisted RNA-interactome capture (CARIC), vilket gör att transkriptom-wide fånga både poly(A) och non-poly(A) RBPs genom att kombinera metabola märkning av RNAs i vivo UV cross-linking och bioorthogonal taggning.

Introduction

Det mänskliga genomet är transkriberas till olika typer av kodning och icke-kodande RNAs (ncRNAs), inklusive mRNA, rRNAs, tRNAs, små nukleära RNAs (snRNAs), små nukleolära RNAs (snoRNAs) och långa icke-kodande RNAs (lncRNAs)1. De flesta av dessa RNAs besitter kläder av RBPs och fungera som ribonukleoprotein partiklar (RNPs)2. En heltäckande identifiering av RBPs är därför en förutsättning för att förstå den regulatoriska nätverk mellan RNAs och RBPs, som är inblandade i olika mänskliga sjukdomar3,4,5.

De senaste åren har bevittnat ett stort uppsving av RBPs upptäckte olika eukaryota system2,6, inklusive mänskliga7,8,9,10,11, mus12,13,14, jäst9,15,16, zebrafiskar17, Drosophila melanogaster18,19 , Caenorhabditis elegans16, Arabidopsis thaliana20,21,22och mänskliga parasiter23,24,25 . Dessa framsteg har underlättats genom en RBP fånga strategi som utvecklats av Castello o.a. 7 och Baltz o.a. 8 i 2012, som kombinerar i vivo UV cross-linking av RNA och dess samverkande proteiner, oligo(dT) fångst av poly(A) RNAs och masspektrometri (MS)-baserat proteomiska profilering. Med tanke på att poly(A) främst finns på mogen mRNA, som står för bara ~ 3% – 5% av de eukaryota transkriptom26, är denna utbredda strategi emellertid inte kan fånga RBPs interagerar med non-poly(A) RNAs, inklusive de flesta ncRNAs och pre-mRNA.

Här rapporterar vi de detaljerade förfarandena för en nyligen utvecklad strategi för transkriptom-wide tillfångatagandet av både poly(A) och non-poly(A) RBPs27. Denna strategi kallas CARIC, och kombinerar i vivo UV cross-linking och metabola märkning av RNAs med photoactivatable och ”klickbara” nukleosid-analoger (som innehåller en bioorthogonal funktionell grupp som kan delta i Klicka reaktion), 4 – thiouridine (4SU) och 5-ethynyluridine (EU). Stegen som är nyckeln till att få perfekt resultat med den CARIC strategin är effektiv metabola märkning, UV cross-linking och klicka reaktion och underhåll av RNA integritet. Eftersom Cu(I) används som katalysator i Klicka reaktion kan orsaka fragmenteringen av RNAs, är en Cu(I)-ligand som kan minska RNA fragmentering viktigt. Vi beskriver hur du utför effektiv Klicka reaktioner i cellen lysates utan att orsaka allvarliga RNA försämringar.

Även om RBP fånga och identifiering i HeLa celler endast beskrivs i detta protokoll, kan CARIC strategin tillämpas olika celltyper och eventuellt levande organismer. Förutom RBP fånga finns detta protokoll också strömlinjeformad stegvisa procedurer för MS provberedning och protein identifiering och kvantifiering, vilket kan vara användbart för dem som inte är bekant med proteomiska experiment.

Protocol

FÖRSIKTIGHET: I förekommande fall, de använda reagenserna bör köpas i form av RNase-fri, eller upplöst i RNase-fri, lösningsmedel (i de flesta fall i dietyleter pyrocarbonate (DEPC)-behandlat vatten). Vid hantering av RNA-prover och reagenser som RNase-fri, alltid bära handskar och masker, och ändra dem ofta för att undvika RNase kontaminering. 1. beredning av lysat av metaboliskt märkta och UV tvärbundna celler Metaboliska införlivandet av EU och 4SU …

Representative Results

De representativa resultat av kvalitetskontroll steg presenteras. Resultatet inkluderar siffror i-gel fluorescens analysen beskrivs i steg 2.3.2 (figur 1), western blot analys beskrivs i steg 4.1.3 (figur 2A) och silver-färgning analysen beskrivs i steg 4.2.2 (figur 2B). Stegen för kvalitetskontroll är kritiska för optimering av CARIC protokoll. Inkludera alltid kvalitetskontroller i utarbetandet…

Discussion

Underhåll av verkligt RNA integritet är en av nycklarna till framgångsrik CARIC experiment. Med lämpliga ligander av Cu(I) och noggrann drift, kan RNA nedbrytning minskas betydligt, även partiell nedbrytning observerades. Substitution kvoterna i EU och 4SU i experimentprover är 1,18% respektive 0,46%, (inga data anges). För intakt RNAs med en längd av 2 000 nt, ~ 90% av RNAs innehåller minst ett EU och ett 4SU. För delvis försämrad RNAs med en längd på 1000 nt, ~ 70% av RNAs innehåller minst ett EU och ett…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Detta arbete stöds av den nationella naturvetenskap Foundation av Kina bidrag 91753206, 21425204, och 21521003 och av nationella nyckel forsknings- och utvecklingsprojektet 2016YFA0501500.

Materials

HeLa ATCC
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) Thermo Fisher Scientific 11995065
FBS (Fetal Bovine Serum) Thermo Fisher Scientific 10099141
Penicillin & Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122
EU (5-ethynyl uridine) Wuhu Huaren Co. CAS:69075-42-9
4SU (4-thiouridine) Sigma Aldrich T4509
10×PBS (Phosphate-Buffered Saline) Thermo Fisher Scientific AM9625
UV cross-linker UVP CL-1000 Equiped with 365-nm UV lamp
DEPC (Diethyl pyrocarbonate) Sigma Aldrich D5758 To treat water. Highly toxic!
Tris·HCl, pH 7.5 Thermo Fisher Scientific 15567027
LiCl Sigma Aldrich 62476
Nonidet P-40 Biodee 74385
EDTA-free protease inhibitor cocktail Thermo Fisher Scientific 88265 One tablet for 50 mL lysis buffer.
LDS (Lithium dodecyl sulfate) Sigma Aldrich L9781
15-mL ultrafiltration tube (10 kDa cutoff) Millipore UFC901024
0.5-mL ultrafiltration tube (10 kDa cutoff) Millipore UFC501096
Streptavidin magnetic beads Thermo Fisher Scientific 88816
DMSO (Dimethyl sulfoxide) Sigma Aldrich 41639
Azide-biotin Click Chemistry Tools AZ104
Copper(II) sulfate Sigma Aldrich C1297
THPTA [Tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl)amine] Sigma Aldrich 762342
Sodium ascorbate Sigma Aldrich 11140
Azide-Cy5 Click Chemistry Tools AZ118
LDS sample buffer (4×) Thermo Fisher Scientific NP0008
10% bis-Tris gel Thermo Fisher Scientific NP0301BOX
EDTA Thermo Fisher Scientific AM9260G
RNase A Sigma Aldrich R6513
SDS (Sodium dodecyl sulfate) Thermo Fisher Scientific 15525017
NaCl Sigma Aldrich S3014
Brij-97 [Polyoxyethylene (20) oleyl ether] J&K 315442
Triethanolamine Sigma Aldrich V900257
Streptavidin agarose Thermo Fisher Scientific 20353
Urea Sigma Aldrich U5378
Sarkosyl (N-Lauroylsarcosine sodium salt) Sigma Aldrich 61743
Biotin Sigma Aldrich B4501
Sodium deoxycholate Sigma Aldrich 30970
MaxQuant Version: 1.5.5.1
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Djebali, S., et al. Landscape of transcription in human cells. Nature. 489 (7414), 101-108 (2012).
  2. Gerstberger, S., Hafner, M., Tuschl, T. A census of human RNA-binding proteins. Nature Reviews Genetics. 15 (12), 829-845 (2014).
  3. Castello, A., Fischer, B., Hentze, M. W., Preiss, T. RNA-binding proteins in Mendelian disease. Trends in Genetics. 29 (5), 318-327 (2013).
  4. Nussbacher, J. K., Batra, R., Lagier-Tourenne, C., Yeo, G. W. RNA-binding proteins in neurodegeneration: Seq and you shall receive. Trends in Neuroscience. 38 (4), 226-236 (2015).
  5. Jazurek, M., Ciesiolka, A., Starega-Roslan, J., Bilinska, K., Krzyzosiak, W. J. Identifying proteins that bind to specific RNAs – focus on simple repeat expansion diseases. Nucleic Acids Research. 44 (19), 9050-9070 (2016).
  6. Hentze, M. W., Castello, A., Schwarzl, T., Preiss, T. A brave new world of RNA-binding proteins. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (5), 327-341 (2018).
  7. Castello, A., et al. Insights into RNA biology from an atlas of mammalian mRNA-binding proteins. Cell. 149 (6), 1393-1406 (2012).
  8. Baltz, A. G., et al. The mRNA-bound proteome and its global occupancy profile on protein-coding transcripts. Molecular Cell. 46 (5), 674-690 (2012).
  9. Beckmann, B. M., et al. The RNA-binding proteomes from yeast to man harbour conserved enigmRBPs. Nature Communications. 6, 10127-10135 (2015).
  10. Conrad, T., et al. Serial interactome capture of the human cell nucleus. Nature Communications. 7, 11212-11222 (2016).
  11. Castello, A., et al. Comprehensive identification of RNA-binding domains in human cells. Molecular Cell. 63 (4), 696-710 (2016).
  12. Kwon, S. C., et al. The RNA-binding protein repertoire of embryonic stem cells. Nature Structural & Molecular Biology. 20 (9), 1122-1130 (2013).
  13. Liepelt, A., et al. Identification of RNA-binding proteins in macrophages by interactome capture. Molecular & Cellular Proteomics. 15 (8), 2699-2714 (2016).
  14. Liao, Y., et al. The cardiomyocyte RNA-binding proteome: Links to intermediary metabolism and heart disease. Cell Reports. 16 (5), 1456-1469 (2016).
  15. Mitchell, S. F., Jain, S., She, M. P., Parker, R. Global analysis of yeast mRNPs. Nature Structural & Molecular Biology. 20 (1), 127-133 (2013).
  16. Matia-González, A. M., Laing, E. E., Gerber, A. P. Conserved mRNA-binding proteomes in eukaryotic organisms. Nature Structural & Molecular Biology. 22 (12), 1027-1033 (2015).
  17. Despic, V., et al. Dynamic RNA-protein interactions underlie the zebrafish maternal-to-zygotic transition. Genome Research. 27 (7), 1184-1194 (2017).
  18. Wessels, H. H., et al. The mRNA-bound proteome of the early fly embryo. Genome Research. 26 (7), 1000-1009 (2016).
  19. Sysoev, V. O., et al. Global changes of the RNA-bound proteome during the maternal-to-zygotic transition in Drosophila. Nature Communications. 7, 12128 (2016).
  20. Reichel, M., et al. In planta determination of the mRNA-binding proteome of Arabidopsis etiolated seedlings. Plant Cell. 28 (10), 2435-2452 (2016).
  21. Marondedze, C., Thomas, L., Serrano, N. L., Lilley, K. S., Gehring, C. The RNA-binding protein repertoire of Arabidopsis thaliana. Scientific Reports. 6, 29766-29778 (2016).
  22. Zhang, Z., et al. UV crosslinked mRNA-binding proteins captured from leaf mesophyll protoplasts. Plant Methods. 12, 42-53 (2016).
  23. Bunnik, E. M., et al. The mRNA-bound proteome of the human malaria parasite Plasmodium falciparum. Genome Biology. 17, 147-164 (2016).
  24. Lueong, S., Merce, C., Fischer, B., Hoheisel, J. D., Erben, E. D. Gene expression regulatory networks in Trypanosoma brucei: insights into the role of the mRNA-binding proteome. Molecular Microbiology. 100 (3), 457-471 (2016).
  25. Nandan, D., et al. Comprehensive identification of mRNA-binding proteins of Leishmania donovani by interactome capture. PLoS ONE. 12 (1), e0170068 (2017).
  26. Jankowsky, E., Harris, M. E. Specificity and nonspecificity in RNA-protein interactions. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (9), 533-544 (2015).
  27. Huang, R., Han, M., Meng, L., Chen, X. Transcriptome-wide discovery of coding and noncoding RNA-binding proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (17), E3879-E3887 (2018).
  28. Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nature Protocols. 1 (6), 2856-2860 (2006).
  29. Boersema, P. J., Raijmakers, R., Lemeer, S., Mohammed, S., Heck, A. J. R. Multiplex peptide stable isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics. Nature Protocols. 4 (4), 484-494 (2009).
  30. Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips. Nature Protocols. 2 (8), 1896-1906 (2007).
  31. Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).
  32. Ritchie, M. E., et al. limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies. Nucleic Acids Research. 43 (7), e47 (2015).
  33. Grammel, M., Hang, H., Conrad, N. K. Chemical reporters for monitoring RNA synthesis and poly(A) tail dynamics. ChemBioChem. 13 (8), 1112-1115 (2012).
  34. Curanovic, D., et al. Global profiling of stimulus-induced polyadenylation in cells using a poly(A) trap. Nature Chemical Biology. 9 (11), 671-673 (2013).
  35. Zheng, Y. X., Beal, P. A. Synthesis and evaluation of an alkyne-modified ATP analog for enzymatic incorporation into RNA. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 26 (7), 1799-1802 (2016).
  36. Nainar, S., et al. Metabolic incorporation of azide functionality into cellular RNA. ChemBioChem. 17 (22), 2149-2152 (2016).
  37. Bao, X., et al. Capturing the interactome of newly transcribed RNA. Nature Methods. 15 (3), 213-220 (2018).
  38. Holmqvist, E., Vogel, J. RNA-binding proteins in bacteria. Nature Reviews Microbiology. , (2018).

Tags

RNA-binding ProteinsCARICClick ChemistryRNA-interactome CapturePost-transcriptional Gene RegulationMRNANon-coding RNAHeLa CellsEU4SUUV Cross-linkingCell LysisRNA-protein Interaction

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Huang, R., Han, M., Meng, L., Chen, X. Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) Strategy. J. Vis. Exp. (140), e58580, doi:10.3791/58580 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image