Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biochemistry

Fånga och identifiering av RNA-bindande proteiner med hjälp av klick kemi-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) strategi

doi: 10.3791/58580 Published: October 19, 2018
* These authors contributed equally

Summary

Ett detaljerat protokoll för att tillämpa den Klicka på kemi-assisted RNA-interactome capture (CARIC) strategin för att identifiera proteiner som bindande för båda kodning och icke-kodande RNAs presenteras.

Abstract

En heltäckande identifiering av RNA-bindande proteiner (RBPs) är nyckeln till att förstå det postttransskriptionell regulatoriska nätverket i celler. En vanligt förekommande strategi för RBP fånga utnyttjar den polyadenylation [poly(A)] av målet RNAs, vilket oftast sker på eukaryota mogen mRNA, lämnar de flesta bindningsproteiner på non-poly(A) RNAs oidentifierade. Här beskriver vi de detaljerade förfarandena för en nyligen rapporterade metod kallas Klicka kemi-assisted RNA-interactome capture (CARIC), vilket gör att transkriptom-wide fånga både poly(A) och non-poly(A) RBPs genom att kombinera metabola märkning av RNAs i vivo UV cross-linking och bioorthogonal taggning.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Det mänskliga genomet är transkriberas till olika typer av kodning och icke-kodande RNAs (ncRNAs), inklusive mRNA, rRNAs, tRNAs, små nukleära RNAs (snRNAs), små nukleolära RNAs (snoRNAs) och långa icke-kodande RNAs (lncRNAs)1. De flesta av dessa RNAs besitter kläder av RBPs och fungera som ribonukleoprotein partiklar (RNPs)2. En heltäckande identifiering av RBPs är därför en förutsättning för att förstå den regulatoriska nätverk mellan RNAs och RBPs, som är inblandade i olika mänskliga sjukdomar3,4,5.

De senaste åren har bevittnat ett stort uppsving av RBPs upptäckte olika eukaryota system2,6, inklusive mänskliga7,8,9,10,11, mus12,13,14, jäst9,15,16, zebrafiskar17, Drosophila melanogaster18,19 , Caenorhabditis elegans16, Arabidopsis thaliana20,21,22och mänskliga parasiter23,24,25 . Dessa framsteg har underlättats genom en RBP fånga strategi som utvecklats av Castello o.a. 7 och Baltz o.a. 8 i 2012, som kombinerar i vivo UV cross-linking av RNA och dess samverkande proteiner, oligo(dT) fångst av poly(A) RNAs och masspektrometri (MS)-baserat proteomiska profilering. Med tanke på att poly(A) främst finns på mogen mRNA, som står för bara ~ 3% - 5% av de eukaryota transkriptom26, är denna utbredda strategi emellertid inte kan fånga RBPs interagerar med non-poly(A) RNAs, inklusive de flesta ncRNAs och pre-mRNA.

Här rapporterar vi de detaljerade förfarandena för en nyligen utvecklad strategi för transkriptom-wide tillfångatagandet av både poly(A) och non-poly(A) RBPs27. Denna strategi kallas CARIC, och kombinerar i vivo UV cross-linking och metabola märkning av RNAs med photoactivatable och ”klickbara” nukleosid-analoger (som innehåller en bioorthogonal funktionell grupp som kan delta i Klicka reaktion), 4 - thiouridine (4SU) och 5-ethynyluridine (EU). Stegen som är nyckeln till att få perfekt resultat med den CARIC strategin är effektiv metabola märkning, UV cross-linking och klicka reaktion och underhåll av RNA integritet. Eftersom Cu(I) används som katalysator i Klicka reaktion kan orsaka fragmenteringen av RNAs, är en Cu(I)-ligand som kan minska RNA fragmentering viktigt. Vi beskriver hur du utför effektiv Klicka reaktioner i cellen lysates utan att orsaka allvarliga RNA försämringar.

Även om RBP fånga och identifiering i HeLa celler endast beskrivs i detta protokoll, kan CARIC strategin tillämpas olika celltyper och eventuellt levande organismer. Förutom RBP fånga finns detta protokoll också strömlinjeformad stegvisa procedurer för MS provberedning och protein identifiering och kvantifiering, vilket kan vara användbart för dem som inte är bekant med proteomiska experiment.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

FÖRSIKTIGHET: I förekommande fall, de använda reagenserna bör köpas i form av RNase-fri, eller upplöst i RNase-fri, lösningsmedel (i de flesta fall i dietyleter pyrocarbonate (DEPC)-behandlat vatten). Vid hantering av RNA-prover och reagenser som RNase-fri, alltid bära handskar och masker, och ändra dem ofta för att undvika RNase kontaminering.

1. beredning av lysat av metaboliskt märkta och UV tvärbundna celler

  1. Metaboliska införlivandet av EU och 4SU
    1. Kultur HeLa cells i Dulbeccos modifierade örnens Medium (DMEM) kompletteras med 10% fetalt bovint serum (FBS), 100 U/mL penicillin och 100 μg/mL streptomycin vid 37 ° C i en 5% CO2 atmosfär. Kultur ~ 4 x 107 HeLa cells (i två 15-cm rätter) för att förbereda en experimentell eller styra urvalet för en standard MS kör.
    2. När de odlade HeLa cellerna nå ~ 80% sammanflödet, ta bort odlingssubstratet och tillsätt 15 mL av förvärmd färskt medium per 15-cm skålen.
    3. Lägg till 15 μL per maträtt av 100 mM EU (upplöst i fosfatbuffrad saltlösning (PBS)) till en slutlig koncentration på 1 mM, och 7,5 μL per maträtt av 100 mM 4SU (upplöst i PBS) till en slutlig koncentration av 0,5 mM för experimentell och noUV-kontrollprover. Tillsätt 15 μl per maträtt av 100 mM EU (upplöst i PBS) till en slutlig koncentration på 1 mM för no4SU-kontrollprover.
      Obs: 4SU är foto-activatable; Således krävs skydd från ljus efter att lägga till 4SU.
    4. Täcka rätterna med folie och odla cellerna för 16 h. Lägg till halva mängden av EU och 4SU eller endast EU från steg 1.1.3 till den experimentella noUV- och no4SU-kontrollprover, respektive, och fortsätta odla för en annan 2 h.
  2. In vivo UV cross-linking
    1. Ta bort odlingsmediet, tvätta cellerna 3 x 5 ml PBS per maträtt, och ta bort resterande PBS så mycket som möjligt.
      Obs: Rester vätska minskar avsevärt tvärbindande effektivitet.
    2. För experimentell och no4SU-kontrollprover, placera rätter på is med locket tas bort och bestråla cellerna med 365-nm UV-ljus på 2 J/cm2 av en UV cross-linker.
    3. För noUV-kontrollprover, placera rätter på is och skydda dem från ljus.
      Obs: Alla följande steg för noUV-kontrollprover bör utföras i ett mörklagt rum.
  3. Cell lysis och homogenisering
    1. Tillsätt 1 mL per maträtt före lyseringsbuffert (10 mM Tris∙HCl, pH 7.5, 50 mM LiCl, 0,02% Nonidet p-40 och etylendiamintetraättiksyra syra (EDTA)-gratis proteas hämmare cocktail) till cellerna. Skrapa de celler som använder en gummi cell lyftare och samla före lysis suspensionen i en 15mL tub.
      Obs: Detta steg kommer bryta cellmembranet och släppa lösliga cytoplasmatiska proteiner och RNA. Inte Centrifugera röret och avlägsna supernatanten.
    2. För upphängning från två 15-cm rätter, justera volymen till 6 mL genom att lägga till före lyseringsbuffert. Lägga till före lysis suspensionen en lika stor volym av R-lyseringsbuffert (200 mM Tris∙HCl, pH 7.5, 500 mM LiCl, 2% litium dodecyl sulfate [LDS]).
    3. Homogenisera cellen lysate genom passering genom en spruta med en smal nål (27-G) flera gånger tills den lysate är klar och homogen. Inkubera den lysate vid 4 ° C med varsam rotering (~ 15 rpm) för 1 h.
      Obs: Detta sista steg kommer att tillåta att fullständigt denaturera proteiner. Den lysate kan lagras säkert vid-70 ° C i upp till en månad.
  4. Förberedelse för Klicka reaktion
    1. Späd den lysate genom att lägga till 20 volymer förtunningsbuffert (50 mM Tris∙HCl, pH 7.5) och dela upp den i 15 mL fraktioner.
      Obs: Lösningar som innehåller en hög koncentration av salt och rengöringsmedel kommer att äventyra effektiviteten i Cu (jag)-katalyseras Klicka reaktion; Således måste bufferten av den lysate ändras.
    2. Koncentrera sig respektive fraktion med hjälp av en 15 mL ultrafiltrering tube (med en molekylvikt cutoff av 10 kDa) tills volymen är mindre än 1 mL. Använd en svängande-hink rotorn för att snurra ultrafiltrering röret vid 4000 x g vid 4 ° C för ~ 15 min.
    3. Lägga till 14 mL förtunningsbuffert i det koncentrera lysate bråket och upprepa steg 1.4.2. Kombinera fraktioner och koncentrera dem till 6 mL volym genom ultrafiltrering (4 000 x g vid 4 ° C för ~ 15 min).
      Obs: De flesta salt och LDS kommer nu tas bort, så den lysate är redo för Klicka på reaktionen. Den lysate kan lagras vid-70 ° C i upp till en vecka. Undvik flera frysning-tining cykler, eftersom de kommer att resultera i betydande RNA nedbrytning. Alikvot Den lysate om småskaliga karakteriseringar krävs.

2. beredning av prover för RNA-interactome fånga

  1. Preclearing av den lysate
    1. Tillsätt 100 μL streptividin magnetiska pärlor per 6 mL lysat och rotera försiktigt (~ 15 rpm) under 30 minuter vid rumstemperatur för att eliminera naturligtvis biotinylerade proteiner.
    2. Pellet pärlor med hjälp av en magnet (för ~ 20 minuter vid 4 ° C) och överföring av precleared lysate till en ny tub.
  2. Prestanda Klicka reaktion
    1. Förbereda reaktionsblandning: 6,5 μL av biotin lager (100 mM natriumazid-biotin upplöst i dimetyl sulfoxid [DMSO] med en slutlig koncentration på 100 μM), 3.25 μL av koppar lager (gör det färska; 1 M CuSO4 upplöst i vatten med en slutkoncentration på 500 μM) , 65 μL av liganden lager (200 mM THPTA upplöst i vatten med en slutlig koncentration på 2 mM), och 262.75 μL av H2O.
      Obs: THPTA står för Tris [(1-hydroxypropyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl) metyl] amine.
    2. Tillsätt reaktionsblandning till 6 mL precleared lysate och blanda väl. Lägg sedan till 162,5 μl minska reagens (göra det färska; 40 mg/mL natriumaskorbat med en slutlig koncentration 5 mM) till den lysate och blanda väl. Den slutliga volymen bör vara 6,5 mL.
    3. Inkubera reaktionsblandningen för 2 h i rumstemperatur i orbitalskak (800 rpm). Lägga till 5 mM EDTA i reaktionsblandningen och inkubera det för 5 min att släcka reaktionen.
  3. Småskaliga karakteriseringar
    1. Förbereda reaktionsblandning som i steg 2.2.1 med biotin beståndet ersättas med dye lager (t.ex., 100 mM natriumazid-Cy5 upplöst i DMSO).
      Obs: Mängden reagens bör anpassas efter volymen av lysat. En 20-μl alikvot av den lysate är vanligtvis tillräckligt för karakteriseringar såsom en i-gel fluorescens analys.
    2. Lägg reaktionsblandning till den lysate och inkubera det för 2 h i rumstemperatur. Lägg sedan till en tredjedel av volymen av LDS prov bufferten (4 x), denaturera det vid 55 ° C i 5 min och lösa provet på en 10% bis-Tris gel.
      Obs: För att bekräfta fluorescens signalen presenteras på RNAs, inkludera kontroller med RNase A matsmältningen efter Klicka på reaktionen.
  4. Sanering av reaktionsblandningen
    1. Lägga till åtta volymer prechilled metanol (100%) i seghärdat reaktionsblandningen och inkubera det 30 min vid-30 ° C för nederbörd. Utföra nederbörden i 50 mL koniskt centrifugrör.
      Obs: Om den totala volymen är större än 50 mL, dela reaktionsblandningen i två 50 mL koniskt centrifugrör.
    2. Förbereda beredning buffert: kombinera en volym av buffert A (4% sodium dodecyl sulfate [SDS] och 10 mM EDTA) med åtta volymer av buffert B (1% Brij-97, 150 mM NaCl och 50 mM trietanolamin, pH 7,4).
    3. Centrifugera vid 4000 x g i 15 minuter vid 4 ° C och kasta bort supernatanten. Tillsätt ~ 1-2 mL prechilled metanol till pelleten. Pipettera upp och ner att bryta pelleten och kontrollera pelleten är helt upphängd med inga synliga bitar. Fyll röret med prechilled metanol. Upprepa detta steg 2 x.
    4. Centrifugera vid 4000 x g i 15 minuter vid 4 ° C och kasta bort supernatanten. Sätta tillbaka den rör och centrifugera igen vid 4000 x g i 5 min. noggrant rita ut kvarvarande metanol som möjligt utan att störa pelleten.
    5. Tillsätt 10 mL av beredning buffert till pelleten. Pipettera upp och ner för att upplösa pelleten. Centrifugera vid 4000 x g under 10 minuter vid 4 ° C.
    6. Överför supernatanten till en ny tub. Samla in 20 μL av prov för kvalitetskontroll (se avsnitt 4).
      Obs: Nu provet är redo för RNA-interactome fånga. Det beredda provet kan förvaras vid-70 ° C i upp till en vecka.

3. RNA-interactome Capture

  1. Förberedelse av streptividin-agaros pärlor
    1. Ta 1 600 μL streptividin-agaros slurry (800 μL av fast pärlor) per 10 mL av färdigberedd provet i en 15 mL koniskt centrifugrör.
    2. Snurra ner pärlorna på 4000 x g för 5 min. Ta försiktigt bort supernatanten utan att störa fast pärlorna.
    3. Tvätta pärlorna med 10 mL 50 mM Tris∙HCl (pH 7,5). Snurra ner pärlorna (4000 x g i 5 min) och avlägsna supernatanten. Upprepa detta steg 2 x.
  2. Affinitet pulldown
    1. Överföra rensade och beredda provet från steg 2.4.6 till streptividin-agaros pärlorna (se steg 3.1). Inkubera över natten med varsam rotering vid 4 ° C.
  3. Tvätt av streptividin pärlor
    1. Snurra ner pärlorna (4000 x g i 5 min) och överför supernatanten till en ny tub. Samla in 20 μL av prov för kvalitetskontroll.
    2. Tvätta pärlorna med 10 mL tvättbuffert en (2% SDS i PBS, pH 7,4). Inkubera i 10 minuter med varsam rotering (~ 12 rpm) vid rumstemperatur. Snurra ner pärlorna (4000 x g i 5 min) och avlägsna supernatanten. Upprepa 1 x.
    3. Upprepa steg 3.3.2 med tvättbuffert B (8 M urea och 250 mM NH4HCO3 upplöst i vatten). Upprepa steg 3.3.2 med tvättbuffert C (2,5 M NaCl i PBS, pH 7,4). Tvätta sedan, pärlorna med 10 mL 50 mM Tris∙HCl (pH 7,5). Snurra ner pärlorna (4000 x g i 5 min) och avlägsna supernatanten.
    4. Dela upp pärlorna jämnt och överföra dem till två 1,5 mL mikrocentrifugrör.
  4. Eluering av de fångade RNPs
    1. Förbereda biotin eluering buffert: 12,5 mM biotin, 75 mM NaCl, 7,5 mM Tris∙HCl (pH 7,5), 1,5 mM EDTA, 0,15% SDS, 0,075% sarkosyl och 0,02% natriumdeoxikolat.
      Obs: Store bufferten vid rumstemperatur, för biotin kan utlösa vid 4 ° C.
    2. Till 400 μL av tvättade fast pärlor, lägga 400 μL av biotin eluering buffert.
    3. Inkubera dem i orbitalskak (1500 rpm) i rumstemperatur i 20 min. Sedan, inkubera i orbitalskak med en värme block (1,500 rpm, 65 ° C) för 10 min. snurra ner pärlorna (7.800 x g för 1 min) och samla de eluerade RNP.
    4. Till pärlorna, tillsätt 400 μL av färska biotin eluering buffert och upprepa steg 3.4.3. Kombinera de två eluerar i en 15 mL tub.
  5. RNase matsmältningen
    1. Lägg till tre volymer förtunningsbuffert i de eluerade RNP att sänka koncentrationen av SDS. Koncentrera utspädda provet med hjälp av en 0,5 mL ultrafiltrering tube (med en molekylvikt cutoff av 10 kDa, snurra på 12 000 x g vid 4 ° C för ~ 30 min) till ~ 40 μl.
    2. Tillsätt 0,5 μg/μL RNase A och inkubera det för 2 h vid 37 ° C att släppa RBPs från tvärbunden RNAs. Samla 2 μL av RBPs för kvalitetskontroll (se avsnitt 4).

4. kvalitetskontroll

  1. Kontroll av effektiviteten av affinitet rullgardinsmenyn
    1. Ta 10 μL av ”före-pulldown” provet från steg 2.4.6 och 10 μL av ”efter-pulldown” provet från steg 3.3.1.
    2. Analysera proverna med standard western blot procedurer (10% bis-Tris gel).
    3. Färga polyvinylidene fluor (PVDF) membranet med streptividin-HRP-konjugat att övervaka rester biotin signalerna av ”efter-pulldown” provet.
      Obs: Om biotin signalen ”efter-pulldown” urvalet är större än en femtedel av signalen ”innan-pulldown” provet, öka mängden streptividin-agaros pärlor används i steg 3.1.1.
  2. Kontroll över den totala uppsamlingskapacitet
    1. Ta 2 μL av utgivna RBP provet från steg 3.5.2 och 0,5 μL av ”före-pulldown” provet (som 0,1% indata) från steg 2.4.6.
    2. Analysera proverna med hjälp av standardprocedurer för silver-färgning.
      1. Fixa gelen med fixering buffert (40% etanol, 10% ättiksyra) under 20 minuter följt av sensibilisering (13 mM Na2S2O3, 83 mM natriumacetat, 30% etanol) i 30 min.
      2. Tvätta gelen 3 x med vatten i 5 min och sedan färga det med en 15 mM AgNO3 lösning för 20 min. Tvätta gelen 2 x med vatten för 1 min, utveckla den i 0,24 M Na2CO3 och 0,012% formaldehyd och avsluta med 45 mM EDTA när färgningen är självförsörj Ent.
        Obs: Silver-färgning intensiteten av de fångade RBPs bör vara liknande den i ingången 0,1%.

5. beredning av proverna för MS

  1. I-gel trypsin rötning av fångade RBPs 28
    1. Lägga till en fjärde volymen av SDS prov buffert (5 x) släppt RBP prov från steg 3.5.2. Denature provet vid 95 ° C i 10 min.
    2. Lösa RBPs på en 1.5 mm 10% SDS-polyakrylamidgel.
    3. Fläcken gelen med silver, följande standardprotokoll.
    4. Punktskatt körfältet av experimental prov eller kontrollprov med stapling gel och stora bandet av RNase en (~ 15 kDa) bort.
    5. Skär den exciderad lanen i små bitar (~ 1-1,5 x ~ 1-1,5 mm).
      Obs: Den kortaste sidan av gel bit bör inte vara kortare än 1 mm att förhindra igensättning i pipettspetsar.
    6. Överför gel bitarna i en mikrocentrifug rör och avfärga med avfärgning buffert (en blandning av lika stora volymer av 100 mM Na2S2O3 och 30 mM K3[Fe(CN)6]).
    7. Tvätta gel bitar med 200 mM ammoniumbikarbonat (ABC) tills gel bitarna är helt färglös.
    8. Torka gel bitar i 1 mL av snyggt acetonitril (ACN). Rehydrera med 200 μL 10 mM Ditiotreitol (upplöst i 50 mM ABC) och inkubera vid 56 ° C i 45 min.
      Obs: Helt uttorkade gel bitar bör vara mycket hårt och ogenomskinlig. Om gel bitarna är fortfarande mjuka efter uttorkning, ta bort ACN och tillsätt 1 mL snyggt ACN att torka igen.
    9. Kyla ner gel bitar till rumstemperatur. Tillsätt 200 μl av 58 mM iodoacetamide (upplöst i 50 mM ABC) och inkubera i rumstemperatur i 45 min i mörker.
    10. Efter en kort tvätt med vatten, torka gel bitar i 1 mL av snyggt ACN.
      Obs: Gel bitar måste vara helt uttorkad.
    11. Rehydrera gel bitar med lämplig mängd 10 ng/μl trypsin (upplöst i 50 mM ABC) och inkubera vid 37 ° C i 12-16 h.
      Obs: Gel bitar bör vara fullständigt uppblött med ingen ogenomskinlig kärnor. Ta bort någon överflödig vätska.
  2. Stabil isotop dimethyl märkning av smält peptiderna 29
    1. Extrahera de smälta peptiderna från gel bitar genom att lägga till 200 μL av utvinning buffert (5% myrsyra och 50% ACN i vatten) och inkubera vid 37 ° C i 30 min med vortexa (vid 1200 rpm).
    2. Upprepa steg 5.2.1 2 x. Kombinera extrakt i en mikrocentrifug rör.
    3. Torka de extraherade peptiderna genom vakuum centrifugering.
    4. Beredes peptiderna i 200 μL av 100 mM triethylammonium bikarbonat (TEAB, pH 8,5).
      FÖRSIKTIGHET: Steg 5.2.4 - 5.2.6 bör utföras på is i dragskåp.
    5. Tillsätt 8 μl av 4% CH2O och 8 μl av 4% 13CD2O att de experimentella och kontrollprover, respektive.
      Obs: För att styra bias av stabil isotopiska märkning, byta den stabila isotopen för experimentell och kontrollprover av andra biologiskt oberoende replikera.
    6. Tillsätt 8 μl av 0,6 M NaBH3KN (gör det färska) och blanda väl.
    7. Inkubera proverna i rumstemperatur i 1 h med vortexa.
    8. Kyla ner proverna på is. Släcka reaktionen genom att lägga till 32 μL av 1% ammoniak vattenlösning. Sedan ytterligare släcka reaktionen genom att lägga till 16 μL av myrsyra.
    9. Kombinera experimentella provet med motsvarande kontrollprovet i en mikrocentrifug rör. Torra proverna genom vakuum centrifugering.
  3. Fraktionering av dimetyl-märkt peptider
    1. Förbereda de stopp-och-gå-extraktion tips (StageTips)30.
      1. Infoga en C18 membran i en utökad längd, 10-μL spets.
      2. Lägg till 300 μg av hög-pH C18 pärlor upphängd i ACN till spetsen.
      3. Placera spetsen upprätt i en mikrocentrifug rör med en hemgjord rack som kan stabilisera spetsen och lyfta spetsen av botten.
      4. Snurra spetsen vid 1400 x g i 2 min. Kassera genomflöde.
      5. Tvätta spetsen med 50 μL av 80% ACN i 10 mM ABC (pH 10,0). Upprepa 1 x.
        Obs: Justera 10 mM ABC lösningens pH genom att lägga till 28% ammoniumhydroxid.
      6. Tvätta spetsen med 50 μL 50% ACN i 10 mM ABC (pH 10,0). Upprepa 1 x.
      7. Tvätta spetsen med 50 μL 10 mM ABC (pH 10,0). Upprepa 1 x.
    2. Beredes peptiderna i 50 μL 10 mm ABC (pH 10,0).
    3. Lägg till det beredda provet till beredda spetsen. Ladda genomströmmande till spetsen att säkerställa effektiv peptid bindande.
    4. Tvätta spetsen med 50 μL 10 mM ABC (pH 10,0). Upprepa 1 x.
    5. Eluera peptiden stegvis för 12 fraktioner med 50 μL av 6%, 9%, 12%, 15%, 18%, 21%, 25%, 30%, 35%, 40%, 80% och 6% ACN i 10 mM ABC (pH 10,0).
    6. Kombinera två fraktioner med ett lika intervall (bråkdel 1 med 7, 2 8, och så vidare) att få sex kombinerat fraktioner.
    7. Torra proverna genom vakuum centrifugering. De torkade peptiderna kan lagras vid-30 ° C.

6. prestanda av MS och dataanalys

  1. Peptid analys av flytande kromatografi-tandem mass spectrometry
    1. Beredes torkade peptid fraktioner från steg 5.3.7 i 15 μL av vatten innehållande 0,1% myrsyra. Kontrollera pH-värdet i ombildade peptider genom tubkikare 1 μL av lösningen på en pH-remsa (pH-värdet bör vara under 3).
    2. Injicera Rekonstituera provet i kolumnen vätskekromatografi (LC). Applicera en lämplig lutning av lösningsmedel (lösningsmedel är vatten innehållande 0,1% myrsyra, lösningsmedel B är ACN som innehåller 0,1% myrsyra) i högpresterande vätskekromatografi (HPLC). En typisk gradient av lösningsmedel B är som följer: 5-35% i 40 min; 35-70% i 4 min; och hålls på 75% för 10 min.
    3. Jonisera de eluerade peptiderna av elektrospray och driva masspektrometer i data-beroende läge. Välj 15 vanligast förekommande joner (multiplicera laddade: 2 + 3 + eller högre) i den första MS skanna för en tandem masspektrometri (MS/MS) scan (kollision-inducerad dissociation, CID). Ange dynamisk utslagning storlek till 500 med en maximal varaktighet tid 25 s.
  2. Protein identifiering och kvantifiering med MaxQuant 31
    1. Ange andelen falska discovery (FDR) av protein identifiering till 0,01 och ange antalet unika peptider till 2 för att öka noggrannheten och tillförlitligheten.
    2. Ställ in den minimala krävs baserat räknas (unik + razor) för protein kvantifiering 2 och aktivera den igen kvantifiera och matcha mellan körningarna funktioner.
  3. Berikning betydelse utvärdering med den R/Bioconductor paketet limma 32
    1. Utföra en modererad t-test genomförs i limma att testa Log2-faldig förändring mot noll från minst tre biologiska replikat. Använda funktionen read.table för att läsa tabellen. Sedan använda funktionerna lmFit och eBayes för data montering. Använd funktionen topTable exportera beräkningens resultat (inklusive de i genomsnitt Log2-faldig förändring och P -värden).
    2. Korrigera P värdena med metoden Benjamini – Hochberg för att styra FDR.
    3. Applicera en FDR 0,01 för att generera en lista av proteiner avsevärt berikad i experimentella proverna. Ange en cutoff av två- eller tredelat förändring till ytterligare kontroll den falska positiv.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

De representativa resultat av kvalitetskontroll steg presenteras. Resultatet inkluderar siffror i-gel fluorescens analysen beskrivs i steg 2.3.2 (figur 1), western blot analys beskrivs i steg 4.1.3 (figur 2A) och silver-färgning analysen beskrivs i steg 4.2.2 (figur 2B). Stegen för kvalitetskontroll är kritiska för optimering av CARIC protokoll. Inkludera alltid kvalitetskontroller i utarbetandet av storskaliga RBP identifiering experiment.

Figure 1
Figur 1: I-gel fluorescens analys av de klick-märkt prover beskrivs i steg 2.3.2. (A) denna panel visar ett typiskt i-gel fluorescens mönster av Klicka-märkt prover. Endast dubbelt märkt provet visar en stark utstryk band på en hög molekylvikt (> 250 kDa), som föreställer signalera av tvärbunden RNPs. För att avskaffa RNP signalen, utelämna antingen 4SU eller EU eller sammanfattad med RNase A. Bakgrunden skarp banden på lägre molekylvikt representerar signalerar av icke-specifik märkt proteiner. (B) i vissa tillfällen, ett starkt utsmetad band (~ 130-250 kDa) kan observeras i det no4SU-stickprovet. Detta band representerar signalera av märkta uncross-länkade RNAs, som kommer att försämras under den värme denaturering, i de flesta fall. Det kommer inte störa de efterföljande förfaranden. CBB = Coomassie brilliant blue. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: kvalitetskontroll av affinitet pulldown effektivitet och de fångade RBPs. (A) denna panel visar en western blot-analys av biotin signaler i prover innan pulldown (ingång) och i prover efter pulldown (supernatanten). Beräkna förhållandet mellan återstående signalerna och optimera pärla beloppet som används i steg 3.1.1. (B) i denna panel visas en silver-färgning analys av fångade RBPs jämfört med 0,1% ingående totala proteiner. För HeLa celler är den allmänna totala uppsamlingskapacitet ~0.05% - 0,1% av ingående proteiner. Detta värde kan variera kraftigt på grund av variansen av metabola märkning effektiviteten av olika celltyper. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: representant MS resultaten av CARIC. (A) denna panel visar en vulkan tomt visar att i genomsnitt Log2-faldig ändra och justerat P värden av kvantifierade proteiner, beräknas av limma paketet. 597 av proteiner med en Log2-faldig förändring av > 2 och ett justerat P värde < 0,01 klassificerades som ”CARIC RBPs”. (B) denna panel visar överlappningen av CARIC proteiner med tidigare identifierade mänskliga poly(A) RBPs7,8,9,10,11. De överlappande proteinerna mestadels kodning RBPs, medan resten av de CARIC RBPs är mer benägna att icke-kodande RBPs. Denna siffra är en omtryckt från tidigare publicerade arbete med tillstånd från National Academy of Sciences27. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Underhåll av verkligt RNA integritet är en av nycklarna till framgångsrik CARIC experiment. Med lämpliga ligander av Cu(I) och noggrann drift, kan RNA nedbrytning minskas betydligt, även partiell nedbrytning observerades. Substitution kvoterna i EU och 4SU i experimentprover är 1,18% respektive 0,46%, (inga data anges). För intakt RNAs med en längd av 2 000 nt, ~ 90% av RNAs innehåller minst ett EU och ett 4SU. För delvis försämrad RNAs med en längd på 1000 nt, ~ 70% av RNAs innehåller minst ett EU och ett 4SU. Därför minskar delvis nedbrytning av RNAs dramatiskt inte effektiviteten i CARIC, medan allvarliga försämringar inte är acceptabelt.

Ett annat viktigt steg är steg 1.4, förberedelserna för Klicka reaktionen. Cu (jag)-katalyseras Klicka reaktion på RNAs är känslig för LDS koncentration. En hög koncentration (> 0,1%) av LDS kommer att leda till en minskning av märkning signaler på EU-innehållande RNAs och en ökning av bakgrunden signaler på proteiner (inga data anges).

Förutom EU är CARIC också kompatibel med andra klickbara nukleosider, såsom alkynyl och azid analoger av adenosin33,34,35,36. Tillämpningen av CARIC begränsas emellertid kraftigt av metabolisk effektivitet av onaturliga klickbara nukleosider i ett biologiskt system av intresse. Innan utför CARIC med andra villkor än de visat i detta protokoll, kontrollera därför alltid metabola märkning effektivitet (t.ex., av fluorescerande imaging).

En liknande strategi som kallas RICK (capture av den nyligen transkriberade RNA interactome med klick-kemi), som omfattar endast EU etikettera totala RNAs och använder 254-nm UV för att tvärbinda RNAs och proteiner, var nyligen rapporterade37. Särskilt, kan 254-nm UV aktivera alla fyra naturliga nukleosider, samt EU. Således kan 254-nm UV irradiation tvärbinda gratis EU och dess metaboliter (e.g., EU fosfater) med motsvarande bindande proteiner, som bör beaktas som möjliga falska positiva.

Ett spännande program av CARIC är att identifiera RBPs i bakterier vars RNAs är mestadels icke-polyadenylated. Storskaliga identifiering av RBPs kommer att ge ovärderliga resurser för att förstå den molekylära basen av postttransskriptionell bestämmelser som bakterier38.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete stöds av den nationella naturvetenskap Foundation av Kina bidrag 91753206, 21425204, och 21521003 och av nationella nyckel forsknings- och utvecklingsprojektet 2016YFA0501500.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HeLa ATCC
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) Thermo Fisher Scientific 11995065
FBS (Fetal Bovine Serum) Thermo Fisher Scientific 10099141
Penicillin & Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122
EU (5-ethynyl uridine) Wuhu Huaren Co. CAS:69075-42-9
4SU (4-thiouridine) Sigma Aldrich T4509
10×PBS (Phosphate-Buffered Saline) Thermo Fisher Scientific AM9625
UV cross-linker UVP CL-1000 Equiped with 365-nm UV lamp
DEPC (Diethyl pyrocarbonate) Sigma Aldrich D5758 To treat water. Highly toxic!
Tris·HCl, pH 7.5 Thermo Fisher Scientific 15567027
LiCl Sigma Aldrich 62476
Nonidet P-40 Biodee 74385
EDTA-free protease inhibitor cocktail Thermo Fisher Scientific 88265 One tablet for 50 mL lysis buffer.
LDS (Lithium dodecyl sulfate) Sigma Aldrich L9781
15-mL ultrafiltration tube (10 kDa cutoff) Millipore UFC901024
0.5-mL ultrafiltration tube (10 kDa cutoff) Millipore UFC501096
Streptavidin magnetic beads Thermo Fisher Scientific 88816
DMSO (Dimethyl sulfoxide) Sigma Aldrich 41639
Azide-biotin Click Chemistry Tools AZ104
Copper(II) sulfate Sigma Aldrich C1297
THPTA [Tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl)amine] Sigma Aldrich 762342
Sodium ascorbate Sigma Aldrich 11140
Azide-Cy5 Click Chemistry Tools AZ118
LDS sample buffer (4×) Thermo Fisher Scientific NP0008
10% bis-Tris gel Thermo Fisher Scientific NP0301BOX
EDTA Thermo Fisher Scientific AM9260G
RNase A Sigma Aldrich R6513
SDS (Sodium dodecyl sulfate) Thermo Fisher Scientific 15525017
NaCl Sigma Aldrich S3014
Brij-97 [Polyoxyethylene (20) oleyl ether] J&K 315442
Triethanolamine Sigma Aldrich V900257
Streptavidin agarose Thermo Fisher Scientific 20353
Urea Sigma Aldrich U5378
Sarkosyl (N-Lauroylsarcosine sodium salt) Sigma Aldrich 61743
Biotin Sigma Aldrich B4501
Sodium deoxycholate Sigma Aldrich 30970
MaxQuant Version: 1.5.5.1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Djebali, S., et al. Landscape of transcription in human cells. Nature. 489, (7414), 101-108 (2012).
  2. Gerstberger, S., Hafner, M., Tuschl, T. A census of human RNA-binding proteins. Nature Reviews Genetics. 15, (12), 829-845 (2014).
  3. Castello, A., Fischer, B., Hentze, M. W., Preiss, T. RNA-binding proteins in Mendelian disease. Trends in Genetics. 29, (5), 318-327 (2013).
  4. Nussbacher, J. K., Batra, R., Lagier-Tourenne, C., Yeo, G. W. RNA-binding proteins in neurodegeneration: Seq and you shall receive. Trends in Neuroscience. 38, (4), 226-236 (2015).
  5. Jazurek, M., Ciesiolka, A., Starega-Roslan, J., Bilinska, K., Krzyzosiak, W. J. Identifying proteins that bind to specific RNAs - focus on simple repeat expansion diseases. Nucleic Acids Research. 44, (19), 9050-9070 (2016).
  6. Hentze, M. W., Castello, A., Schwarzl, T., Preiss, T. A brave new world of RNA-binding proteins. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19, (5), 327-341 (2018).
  7. Castello, A., et al. Insights into RNA biology from an atlas of mammalian mRNA-binding proteins. Cell. 149, (6), 1393-1406 (2012).
  8. Baltz, A. G., et al. The mRNA-bound proteome and its global occupancy profile on protein-coding transcripts. Molecular Cell. 46, (5), 674-690 (2012).
  9. Beckmann, B. M., et al. The RNA-binding proteomes from yeast to man harbour conserved enigmRBPs. Nature Communications. 6, 10127-10135 (2015).
  10. Conrad, T., et al. Serial interactome capture of the human cell nucleus. Nature Communications. 7, 11212-11222 (2016).
  11. Castello, A., et al. Comprehensive identification of RNA-binding domains in human cells. Molecular Cell. 63, (4), 696-710 (2016).
  12. Kwon, S. C., et al. The RNA-binding protein repertoire of embryonic stem cells. Nature Structural & Molecular Biology. 20, (9), 1122-1130 (2013).
  13. Liepelt, A., et al. Identification of RNA-binding proteins in macrophages by interactome capture. Molecular & Cellular Proteomics. 15, (8), 2699-2714 (2016).
  14. Liao, Y., et al. The cardiomyocyte RNA-binding proteome: Links to intermediary metabolism and heart disease. Cell Reports. 16, (5), 1456-1469 (2016).
  15. Mitchell, S. F., Jain, S., She, M. P., Parker, R. Global analysis of yeast mRNPs. Nature Structural & Molecular Biology. 20, (1), 127-133 (2013).
  16. Matia-González, A. M., Laing, E. E., Gerber, A. P. Conserved mRNA-binding proteomes in eukaryotic organisms. Nature Structural & Molecular Biology. 22, (12), 1027-1033 (2015).
  17. Despic, V., et al. Dynamic RNA-protein interactions underlie the zebrafish maternal-to-zygotic transition. Genome Research. 27, (7), 1184-1194 (2017).
  18. Wessels, H. H., et al. The mRNA-bound proteome of the early fly embryo. Genome Research. 26, (7), 1000-1009 (2016).
  19. Sysoev, V. O., et al. Global changes of the RNA-bound proteome during the maternal-to-zygotic transition in Drosophila. Nature Communications. 7, 12128 (2016).
  20. Reichel, M., et al. In planta determination of the mRNA-binding proteome of Arabidopsis etiolated seedlings. Plant Cell. 28, (10), 2435-2452 (2016).
  21. Marondedze, C., Thomas, L., Serrano, N. L., Lilley, K. S., Gehring, C. The RNA-binding protein repertoire of Arabidopsis thaliana. Scientific Reports. 6, 29766-29778 (2016).
  22. Zhang, Z., et al. UV crosslinked mRNA-binding proteins captured from leaf mesophyll protoplasts. Plant Methods. 12, 42-53 (2016).
  23. Bunnik, E. M., et al. The mRNA-bound proteome of the human malaria parasite Plasmodium falciparum. Genome Biology. 17, 147-164 (2016).
  24. Lueong, S., Merce, C., Fischer, B., Hoheisel, J. D., Erben, E. D. Gene expression regulatory networks in Trypanosoma brucei: insights into the role of the mRNA-binding proteome. Molecular Microbiology. 100, (3), 457-471 (2016).
  25. Nandan, D., et al. Comprehensive identification of mRNA-binding proteins of Leishmania donovani by interactome capture. PLoS ONE. 12, (1), e0170068 (2017).
  26. Jankowsky, E., Harris, M. E. Specificity and nonspecificity in RNA-protein interactions. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16, (9), 533-544 (2015).
  27. Huang, R., Han, M., Meng, L., Chen, X. Transcriptome-wide discovery of coding and noncoding RNA-binding proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115, (17), E3879-E3887 (2018).
  28. Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nature Protocols. 1, (6), 2856-2860 (2006).
  29. Boersema, P. J., Raijmakers, R., Lemeer, S., Mohammed, S., Heck, A. J. R. Multiplex peptide stable isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics. Nature Protocols. 4, (4), 484-494 (2009).
  30. Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips. Nature Protocols. 2, (8), 1896-1906 (2007).
  31. Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nature Biotechnology. 26, (12), 1367-1372 (2008).
  32. Ritchie, M. E., et al. limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies. Nucleic Acids Research. 43, (7), e47 (2015).
  33. Grammel, M., Hang, H., Conrad, N. K. Chemical reporters for monitoring RNA synthesis and poly(A) tail dynamics. ChemBioChem. 13, (8), 1112-1115 (2012).
  34. Curanovic, D., et al. Global profiling of stimulus-induced polyadenylation in cells using a poly(A) trap. Nature Chemical Biology. 9, (11), 671-673 (2013).
  35. Zheng, Y. X., Beal, P. A. Synthesis and evaluation of an alkyne-modified ATP analog for enzymatic incorporation into RNA. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 26, (7), 1799-1802 (2016).
  36. Nainar, S., et al. Metabolic incorporation of azide functionality into cellular RNA. ChemBioChem. 17, (22), 2149-2152 (2016).
  37. Bao, X., et al. Capturing the interactome of newly transcribed RNA. Nature Methods. 15, (3), 213-220 (2018).
  38. Holmqvist, E., Vogel, J. RNA-binding proteins in bacteria. Nature Reviews Microbiology. Published online (2018).
Fånga och identifiering av RNA-bindande proteiner med hjälp av klick kemi-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) strategi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Huang, R., Han, M., Meng, L., Chen, X. Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) Strategy. J. Vis. Exp. (140), e58580, doi:10.3791/58580 (2018).More

Huang, R., Han, M., Meng, L., Chen, X. Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) Strategy. J. Vis. Exp. (140), e58580, doi:10.3791/58580 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter