Summary
يسمح وضع مقايسة السبت انترفيرون-غاما خنزير غينيا ببمكس وصف الاستجابات تي خلية في هذا النموذج أهمية كبيرة لدراسة الأمراض المعدية. لقد قدمنا طلبا المقايسة لقياس ردود الخلية T المرتبطة بتسليم الأدمة من لقاحات الحمض النووي.
Abstract
خنزير غينيا قد لعبت دوراً محوريا كنموذج حيوانات صغيرة ذات صلة في تطوير اللقاحات المضادة للأمراض المعدية مثل السل والإنفلونزا والدفتريا والحمى النزفية الفيروسية. لقد أظهرنا أن بلازميد الحمض النووي (بدنا) للقاح داخل الجلد يتسبب استجابات خلطيه قوية في خنزير غينيا. ومع ذلك، استخدام هذا الحيوان للاستجابات المناعية نموذج كانت محدودة نوعا ما في الماضي بسبب نقص الكواشف المتوفرة والبروتوكولات لدراسة ردود الخلية T. خلايا T تلعب دوراً محوريا في مناعية والآليات إيمونوثيرابيوتيك. من الضروري فهم ردود الخلية T لتطوير الأمراض المعدية والأورام اللقاحات واستيعاب تسليم الأجهزة. هنا يصف لنا مقايسة انترفيرون-غاما (IFN-γ) المرتبط بالانزيم إيمونوسبوت (اليسبوت) خنزير غينيا الدم المحيطية وحيدات النوى خلايا (ببمكس). المقايسة تمكن الباحثين لوصف استجابات تي خلية الخاصة باللقاحات في هذا النموذج القوارض الهامة. القدرة على الاعتداء الخلايا المعزولة من الدم المحيطي يوفر الفرصة لتعقب الاستمناع في الحيوانات الفردية.
Introduction
يسمح البروتوكول الموصوفة هنا الكشف عن انترفيرون-غاما الخلايا المبيضي (IFN-γ) بعد استدعاء مستضد في جمهرة خلايا وحيدات النوى (PBMC) دم المحيطي حصادها من خنازير غينيا هارتلي. لقد قدمنا طلبا المقايسة تميز بحركية ومقادير من استجابات محددة مستضد تي خلية لنظام التطعيم ضد إنفلونزا في خنزير غينيا. ونحن نعتقد أن هذا البروتوكول سيدفع إلى حد كبير تطوير برامج التطعيم في هذا النموذج الحيواني العالية ذات الصلة قبل الإكلينيكية.
الخلايا T باللقاحات تلعب دوراً أساسيا في الحماية ضد العوامل المعدية ومسارات إيمونوثيرابيوتيك المرتبطة بالأمراض الأخرى. برز أهمية خلايا تي في دراسات متعددة من اللقاحات. التحصين فرت والفئران مع بلازميد الحمض النووي (بدنا) ترميز هيماغلوتينين H5 و N1 النورامينيداز توفر الحماية من المراضة والوفيات في تحد فيروس إنفلونزا في غياب تحييد الأجسام المضادة، مما يشير إلى أهمية خلية t الحصانة1. بالإضافة إلى قوي تحييد استجابة خلطيه، خلايا تي تلعب دوراً حاسما لإزالة الفيروسية2 ليس فقط، بل أيضا الحماية من العدوى بالفيروس المخلوي التنفسي (RSV) في الفئران3. في البشر، وكانت خلايا CD8 + "تي" موجودة مسبقاً المقترنة مع شدة المرض انخفضت خلال H1N1 وباء في 20094. عدد خلايا CD4 + T جنبا إلى جنب مع تركيز البلازما سيتوكين معينة ترتبط بشدة المرض في الأطفال المصابين RSV5.
خنزير غينيا برزت كنموذج مختبر للبحث والتطوير في مختلف مجالات الطب مثل التحسس الجلدي، البحوث التغذوية، ودراسات للنظام السمعي، والأكثر ملاءمة لهذا العمل، والأمراض المعدية. كان حاسما بالنسبة لاكتشاف اللقاحات ضد السل والدفتيريا. في الآونة الأخيرة يستخدم خنزير غينيا كنموذج للأنفلونزا6 و7من فيروس إيبولا. وعلاوة على ذلك، تمتلك التشابه الفسيولوجي لجلد الإنسان8، خنزير غينيا يقدم نموذجا حيوانات صغيرة موجوداً لطرق إيصال المخدرات عن طريق الجلد. على النقيض من أهميته كنموذج مختبر، لا يزال توافر خنزير غينيا فحوصات محددة وتحقيقات لتحديد خصائص الاستجابات المناعية محدودة9. فحوصات الخلوية الأساسية مثل إيمونوسبوت المرتبط بالانزيم IFN-γ (السبت-المقايسة) التي تستخدم بشكل روتيني في البحوث السريرية وقبل السريرية لتعداد ردود الخلية T لم تكن متاحة.
واستخدمت لتحديد عدد الخلايا إفراز الأجسام المضادة المحددة في10،متنوعة من سكان خلية ب11فحوصات إيمونوسبوت المرتبط بالانزيم الصلبة-المرحلة الأولى. صيغة متقدمة للكشف عن خلايا إفراز السيتوكينات بما في ذلك IL-1، إيل-2، إيل-4، وايل-5، وايل-6، وايل-10، GM-CSF، تنف ألفا وبيتا تنف، جرانزيمي ب و IFN-γ. والرزن السبت تمتلك حساسية عالية؛ يحتمل أن يمكن الكشف عن كل خلية إنتاج سيتوكين. الحد الأقصى للكشف لفحوصات السبت أبلغ أقل من 10 بقع كل 100,000 ببمكس12. مؤخرا قدم زوج جسم معين IFN-γ خنزير غينيا المتاحة13، وهذا قد فتحت الفرصة لمعالجة هذا القصور في هذا المجال.
ويعتبر IFN-γ جزيء المستجيب هاما في الاستجابة المناعية التكيفية؛ يمكن إنتاجها ويفرز من خلايا CD4 و CD8 تي عند التنشيط. قد IFN-γ واسعة النطاق البيولوجي وظائف في سياق استجابة مناعية للإصابة بعدوى فيروس، مثل تفعيل الضامة وحتى تنظيم histocompatibility الرئيسية المعقدة (MHC) أنا والتعبير مهسيي. كما يعزز التمايز ب-الخلية، ويحول دون نمو الخلايا T-مساعد-2 وينشط الخلايا القاتلة الطبيعية. IFN-γ كتل الفيروسية النسخ المتماثل في الخلايا الجسمية المصابة والتعبير أوبريجولاتيس من جزيئات MHC. وهكذا، إنتاج IFN-γ دلالة هامة جداً لنوعية استجابة خلايا T للقاح أو الممرض.
جانبا مهما من ELISpot IFN-γ المعروضة هنا هو استخدام ببمكس بدلاً من سبلينوسيتيس13. يمكن الحصول على ببمكس بتجهيز عينة دم التي تم جمعها غير الطرفية، بينما يتطلب جمع سبلينوسيتيس يوثانيزيشن الحيوانية قبل الحصاد للطحال. يمكن استخدام ببمكس IFN-γ تي خلية الاستجابات التي يتعين رصدها على مدى فترة من الزمن، وتقييم الآثار على الردود تي خلية مثل نظم رئيس الوزراء-دفعة14.
للباحثين الذين يستخدمون حاليا خنزير غينيا كنموذج حيوان، الأسلوب IFN-γ السبت سوف يوسع نطاق البيانات العلمية التي يمكن الحصول. قد تقلل توافره الآن ضرورة لإجراء دراسات مع أقل أهمية من نماذج حيوانية للأمراض المستهدفة، التي اختيرت سابقا بسبب توافر كاشف لفحص الاستجابات الخلوية. يسمح استخدام ببمكس بدلاً من الطحال أو الغدد الليمفاوية للتجارب غير الطرفية والرصد المستمر للحيوانات الفردية.
فيما يلي نقدم وصفاً مفصلاً للخطوات التي تنطوي عليها في الكشف عن استجابة خلوية IFN-γ في خنازير غينيا إلى لقاح بدنا. نحن مخطط لدينا إجراءات التسليم المحددة ووصف المقايسة السبت العام يشمل أخذ عينات من الدم وتجهيز الدم والحصاد PBMC، وإجراء فحص وتحليل البيانات. ويرد في الشكل 1تخطيطي للمقايسة السبت.
الشكل 1 : نظرة عامة التخطيطي خنزير غينيا السبت البروتوكول. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Protocol
عليها جميع الأساليب الموصوفة هنا "العناية بالحيوان" واستخدام اللجنة (أكوك) من أككولاب.
ملاحظة: يتطلب البروتوكول استخدام المواد الخطرة المحتملة. الرجاء الرجوع إلى مسدس الشركة المصنعة وارتداء المعدات الشخصية المناسبة (معدات الوقاية الشخصية) طوال فترة الإجراءات.
1. إعداد موقع التحصين خنزير غينيا، الأدمة حقن مانتو وسيليكترا-ف 3-الجيش الشعبي-الإجراء
-
إعداد موقع العلاج على خنزير غينيا.
- خنزير غينيا في دائرة للاستقراء وتسكين 5% إيسوفلوراني-بخار.
- إزالة الحيوان من الدائرة ووضع مخروط الآنف في المكان، توفير البخار Isoflurane 2% للمحافظة على التخدير طوال فترة الإجراءات.
- حلق المنطقة من حوالي 4 سم2 في الجناح البطن.
- تطهير منطقة حلق مع مسحه الإيثانول.
-
الحقن الداخلي صياغة بدنا وانهانسر.
- استخدام الأنسولين-حقنه حقن 100 ميليلتر صياغة في الأدمة بتقنية مانتو. يتم إدخال إبرة مجسم مشطوف الحواف أعلى زاوية درجة 10 مع جسم الحيوان.
- إزالة الإبرة وفورا إدراج الصفيف القطب CELLECTRA®-3 ف عبر الحقن-الآفة الشروية وتطبيق حقل كهربائي.
- إزالة الحيوان من التخدير ورصد انتعاشها.
2-عدم محطة التسييل
-
جمع الدم من حبل الوريد لفظاعتها خنزير غينيا.
- خنزير غينيا في دائرة للاستقراء وتخدير الحيوان كما هو موضح في 1.1.1
- استخدام 3 مل حقنه بإبرة 27 1/2 بوصة، نقط حبل الوريد للحيوان أنايسثيتيزيد وجمع 3 مل دم.
- نقل الدم إلى أنبوب جمع الدم K2EDTA على الفور، وعكس الأنبوبة عدة مرات لخلط الدم مع المضادة تخثر ومكان على الجليد.
ملاحظة: تجنب تخثر الدم أمر حاسم لنجاح التجهيز النهائي من عينة الدم. - رصد الانتعاش للحيوان.
3. تجهيز عينات الدم
-
فصل ببمكس عن الدم كله بالطرد المركزي الكثافة--التدرج
- تمييع الدم 1:1 مع موازنة الملح الحل (حبس هانك).
ملاحظة: لتفادي التلوث التي نعمل جميعا من الآن فصاعدا ينبغي إجراء في خزانة السلامة الأحيائية تطبيق الأسلوب العقيم. - طبقة تمييع الدم تدريجيا أكثر من 4.5 مل فيكل-باكو "بالإضافة إلى" في أنبوب 15 مل مخروطية. تجنب حدوث اضطراب الواجهة. ملاحظة: لضمان الفصل السليم، يجب أن تكون فيكول-باقوي في درجة حرارة الغرفة.
- الطرد المركزي أنابيب في 800 إطار التعاون الإقليمي لمدة 30 دقيقة مع الفرامل قبالة.
ملاحظة: كبديل، أنابيب SepMate™ (ستيمسيل تكنولوجيز) يمكن أن تستخدم لفصل ببمك. الدم المخفف هبس إضافة إلى أنبوب سيبماتي 15 مل مليئة 3.5 مل فيكول-باقوي "بالإضافة إلى" وثم فصل في إطار التعاون الإقليمي 1200 لمدة 10 دقائق (الفرامل على). يؤدي هذا الأسلوب توفير الوقت التدرج الطرد المركزي صلاحية متساوية وخلية الغلة وتشكيل بقعة. - حصاد طبقة بافي-معطف وتمييع في المتوسط R10 (10% (v/v) الحرارة--إلغاء تنشيط FBS و 1% (v/v) القلم/بكتيريا في المتوسط RPMI1640) إلى إجمالي حجم 15 مل.
- بيليه الخلايا التي سينتريفوجينج في إطار التعاون الإقليمي 450 لمدة 5 دقائق.
- تغسل الخلايا مرتين مع المتوسطة R10.
- تعليق إعادة الخلايا في 1 مل R10 وتمرير تعليق خلية من خلال 70 ميكرومتر الخلية-مصفاة في أنبوب جديد.
- حساب عدد الخلايا وتحديد عدد الخلايا الحية تلطيخ تريبان الأزرق.
- تمييع الخلايا مع المتوسطة R10 بتركيز 1 × 10 ^ 6 خلايا حية كل مل.
- تمييع الدم 1:1 مع موازنة الملح الحل (حبس هانك).
4-إعداد لوحات السبت وتحفيز الخلية
-
الآبار ومعطف وكتلة من صفيحة ELISpot PVDF-غشاء 96-جيدا قبل البذر في ببمكس.
- ينبغي أن تكون لوحات ما قبل المعالجة لمدة 60 ثانية. سيؤدي إلى الإيثانول قبل العلاج غير محدد أقل بقعة لتشكيل والبقع مع تعريف محسنة.
ملاحظة: اتخاذ المزيد من الحيطة لضمان الغشاء الكامل الذي يأتي في اتصال مع 15% 35 ميليلتر الإيثانول. - بعد مرور 60 ثانية إضافة 150 PBS 1 x ميليلتر في البئر، ثم قم بإفراغ من الآبار بعكس اللوحات.
ملاحظة: يتم بالمعالجة المسبقة الإيثانول حساسة جداً للوقت. عدم احتضان الغشاء جيدا أطول من 60 ثانية الأغشية لا يجب أن تجف خلال الخطوات التالية للإجراء. - غسل الأطباق ثلاث مرات مع 250 برنامج تلفزيوني 1 x ميليلتر كل بئر.
- معطف مع 100 ميليلتر/جيدا من خنزير غينيا المضادة التقاط ميكروغرام/مل 5 جسم IFN-γ الخامس-هاء-4 في برنامج تلفزيوني.
- احتضان لوحات لمالا يقل عن 12 ساعة في 4 درجات مئوية.
- غسل الأطباق بإضافة 250 ميليلتر/كذلك برنامج تلفزيوني ثلاث مرات.
- إضافة 200 ميليلتر/كذلك حظر المخزن المؤقت (10% (w/v) السكروز و 2% (w/v) جيش صرب البوسنة في برنامج تلفزيوني)، واحتضان لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة.
- غسل الأطباق مع 250 ميليلتر/كذلك برنامج تلفزيوني ثلاث مرات.
- ينبغي أن تكون لوحات ما قبل المعالجة لمدة 60 ثانية. سيؤدي إلى الإيثانول قبل العلاج غير محدد أقل بقعة لتشكيل والبقع مع تعريف محسنة.
-
لوحة ببمكس مع محددة مستضد الببتيدات، عناصر إيجابية وأخرى سلبية.
- تمييع تجمع البروتين الببتيد في R10 لتركيز الببتيد النهائية المرجوة.
- الاعتداء ببمكس عينة في تريبليكاتيس.
ملاحظة: إضافة المتوسطة مع المنشطات إلى لوحات ELISpot أولاً وإضافة تعليق ببمك الثانية. - إضافة 50 ميليلتر من الببتيد-R10 المتوسطة إلى الآبار المشار إليه.
- لمراقبة سلبية إضافة 50 ميليلتر الببتيد فارغة صياغة في R10 في آبار المشار إليه.
- لمراقبة إيجابية إضافة 5 ميكروغرام/مل كونكانافالين A (كونا) في المتوسط R10 في آبار المشار إليه.
- إضافة 100 ميليلتر من ببمك الخلية-تعليق لجميع الآبار
- احتضان لوحات هوميديفيد الغلاف الجوي 5% CO2 في 37 درجة مئوية ل 18 ساعة.
ملاحظة: السبت مكان اللوحات على سطح/رف حتى في الحاضنة وتجنب أي اضطراب في اللوحات خلال فترة الحضانة.
5-كشف النقاط الإيجابية انترفيرون-غاما
-
الحضانة مع الكشف عن وضع جسم ولوحة.
ملاحظة: جميع الخطوات في هذا المقطع مطلوب لا تقنية العقيم.- بعناية إزالة لوحات من الحاضنة، وإفراغ آبار بأمان. غسل الأطباق بإضافة 250 ميليلتر/كذلك برنامج تلفزيوني لثلاث مرات.
- إضافة من 2 ميكروغرام/مل بيوتينيلاتيد الكشف عن خنزير غينيا لمكافحة IFN-γ جسم المخفف G3 ن 100 ميليلتر/جيدا في المخزن المؤقت لحظر.
ملاحظة: عامل تصفية (22 ميكرومتر) جسم الحل للحد من الخلفية. - احتضان مع الكشف عن الأجسام المضادة ل 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
- تجاهل لوحات طافية واغسل بإضافة 250 ميليلتر/كذلك برنامج تلفزيوني ثلاث مرات.
- إضافة 100 ميليلتر/بئر الفوسفاتيز القلوية (حزب العمال الأسترالي)-streptavidin مترافق المخفف في المخزن المؤقت لحظر.
ملاحظة: عامل تصفية (22 ميكرومتر) الحل للحد من الخلفية. - احتضان مع المتقارن الب ستريبتافيدين عن 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
- تجاهل حل الب ستريبتافيدين وغسل الأطباق بإضافة 250 ميليلتر/كذلك برنامج تلفزيوني مرتين، وإزالة الزائدة برنامج تلفزيوني بعكس اللوحة النشاف أنه ضد منشفة ورقية نظيفة.
- غسل الأطباق بإضافة 250 ميليلتر/بئر "دي عالي النقاوة" الماء مرة واحدة، وإزالة المياه الزائدة بعكس اللوحة النشاف أنه ضد منشفة ورقية نظيفة.
- إضافة 100 ميليلتر من بسب/NBT (تحذير) الركيزة الحل في كل بئر. تنبيه: بسيب/NBT عالية قابلة للاشتعال والسامة إذا ابتلع، على اتصال بالجلد، أو استنشاقه. قبل استخدام الرجوع إلى مسدس.
- احتضان لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة محمية من الضوء.
- شطف لوحة 4 مرات مع المياه. عكس اللوحة واضغط على إزالة المياه الزائدة.
- إزالة الصرف البلاستيك من أسفل لوحات السبت والسماح بلوحات لتجف.
- تحديد حجم البقع يدوياً أو باستخدام قارئ ELISpot الآلي، على سبيل المثال للقارئ لوحة S6 CTL-إيمونوسبوت.
Representative Results
بمثابة مرجع للنتائج المتوقعة بعد استخدام هذا البروتوكول، وإذ تشدد على أهمية اتخاذ خطوات حاسمة ويؤكد مزايا أمثلية وصف النتائج المعروضة هنا.
بعد الطرد المركزي الكثافة--التدرج، كما هو موضح في الخطوة 3، 1 من البروتوكول، السائل اللزج الأحمر في الجزء السفلي من الأنبوب سوف تحتوي على أكثر من خلايا الدم الحمراء. كما هو مبين في الشكل 2أ، فوق خلايا الدم الحمراء طبقة من الكثافة المتوسطة. بين طبقة البلازما واضحة أو الأصفر في الأعلى والكثافة متوسطة الانحدار هو الطبقة البيضاء أو الخفيفة معطف بافي براون، الذي يحتوي على أكثر من خلايا الدم البيضاء والصفائح الدموية. أن المجاهرة بفصل غير مكتملة كوجود خلايا الدم الحمراء على رأس المتوسطة الكثافة--التدرج. التلوين الأحمر للبلازما في الشكل 2A على الأرجح بسبب انحلال الدم، كما تم تخزين هذا عينة الدم في أنبوب جمع 1.5 ح قبل أن يتم معالجتها. الشكل 2 ب يبين التدرج قبل (يسار) وبعد الطرد المركزي (يمين) في جهاز ببمك والعزل. تمت معالجة عينة الدم في الشكل 2ب بأقل قدر من التأخير بعد جمع الدم، والتلوين البلازما الأصفر.
أثر قبل ترطيب الأغشية مع الإيثانول (راجع الخطوة 4، 1 من البروتوكول) في بقعة-التنمية ويرد في الشكل 3. بقع في الآبار المعالجة قبل عرض تعريف محسنة، وهناك انخفاض في عدد المواقع في آبار مراقبة سلبية متوسطة/[دمس] (الشكل 3أ). الجدوى النموذجية خنزير غينيا المجهزة ببمكس يتراوح بين حوالي 90% ومشابهة للأنابيب العادية 15 مل وأجهزة ببمك والعزل (الشكل 3ب). عائد خلايا قابلة للحياة من عينة دم مل 3 عادة ما يتراوح بين 3 × 106 و 5 × 106.
تم تحصين الحيوانات مع بلازميد الحمض النووي ترميز البروتين النووي (NP) من سلالة الإنفلونزا H1N1 A/PuertoRico8. ويبين الشكل 4 تي خلية IFN-γ الردود المقدمة بتعداد بقعة تشكيل وحدات (SFU) التي تم إنشاؤها عبر مدة نظام التطعيم. اليسبوت المقايسة مع ببمكس تحصد من نتائج عدم تحصين الحيوانات في التهم بقعة ضئيلة (تكساس لا). أربعة عشر يوما بعد التحصين الأول (رئيس الوزراء)، أحصى 970 IFN-γ البقع كل ببمكس مليون في متوسط بعد التحفيز مكسبه. سبعة أيام بعد التطعيم الثانية (دفعة)، تي خلية الردود ضد كل التجمعات الثلاثة تم توسيع نطاق، التوصل إلى متوسط سفوس/10 IFN-γ 50206 ببمكس-ستة وأربعون يوما بعد التحصين الثاني (الذاكرة)، إجمالي متوسط من 6310 سفوس IFN-γ/10 6 أحصى ببمكس في الدم المحيطي.
أساطير الرقم:
الشكل 2 : صور الممثلة للطبقات بعد الطرد المركزي الكثافة--التدرج- عينة الدم (A) قبل (يسار) وبعد (يمين) الطرد المركزي في الأنابيب العادية. عينة الدم (ب) قبل (يسار) وبعد (يمين) الطرد المركزي في أجهزة ببمك والعزل. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 : تحسين البروتوكول. (أ) مظهر نموذجي IFN-γ البقع الإيجابية في صفيحة الإنزيم ELISpot جيدا توضع وفقا للبروتوكول. المثال ثلاث آبار وترد بعد المعالجة المسبقة مع الإيثانول (يمين) أو بدون معالجة مسبقة (يسار). كانت الخلايا المحتضنة بين عشية وضحاها أما مع [دمس] (أعلى) كحافز لا تحكم، الببتيدات المتطابقة مستضد (الأوسط)، أو mitogen كونا (أسفل). ببمكس نشأ من نفس الحيوان الفردية. الآبار تم تصويرها باستخدام الماسح ضوئي لوحة الآلي. (ب) مقارنة بين مختلف الأنابيب الكثافة--التدرج في الخلايا المجهزة. وقد جمعت 3 مل عينات دم من خنازير غينيا الفردية 3. 1.5 مل كل عينة تم معالجتها باستخدام الأنابيب العادية (الكثافة المتوسطة الانحدار) أو أجهزة ببمك والعزل. وتحددت البقاء (اليسار، % ± SEM) وعدد الخلايا الحية (حق، x 106 ± SEM) استخدام خلية تلقائي عد النظام والمقايسة الاستبعاد تريبان الأزرق. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4 : الكشف عن الاستجابات المناعية الخلوية قوية على مدى نظام التطعيم. في أيام 1 و 15، تم تسليم 30 ميكروغرام من بدنا ترميز إنفلونزا A البروتين النووي (NP) داخل منظمة للجناح البطن من خنازير غينيا هارتلي متبوعاً مباشرة بالجلد-انهانسر. وتم قياس الاستجابة ELISpot IFN-γ 14 يوما بعد التحصين الأول (رئيس الوزراء)، و 7 أيام (دفعة) و 46 يوما (الذاكرة) بعد التحصين الثاني. تم رسم يعني سفوس + SEM 5 خنازير غينيا المعالجة وخنازير غينيا 2 غير المعالجة (لا تكساس). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Discussion
خنزير غينيا نموذج حيوان قيمة لتطوير لقاحات واستراتيجيات تقديم الأدمة قبل الإكلينيكية. البروتوكول أعلاه يصف منهجية لقياس ردود محددة مستضد تي خلية في هذا النموذج أهمية بالغة. يوفر الفحص تعداد واضحة لإنتاج خلايا تي الطرفية انترفيرون-غاما على التحفيز مع الببتيدات حدة مستضد. يمكن رصد الحركية الاستجابة المناعية بأخذ عينات من الدم غير الطرفية.
نحن الأمثل البروتوكول، والتعرف على الجوانب الهامة للحصول على أفضل النتائج باستخدام هذا الفحص. على سبيل المثال، سيؤدي إلى تكوين جلطات الدم في أنبوب جمع الأمثل PBMC الانتعاش وقدرتها على البقاء. خنزير غينيا الدم يتخثر بسرعة18. من الأهمية بمكان القيام بسحب الدم بسرعة. الاتحاد الأفريقي-بيرك et al. توفير دليل شامل لنزيف التقنيات في نموذج خنزير غينيا16. نظراً لجمع الدم يتطلب التخدير العام، يوصي باستعراض إجراءات التشغيل الموحدة المطبقة لهذا الجانب من الإجراء19. سيكون رد فعل غير كاف فظاعتها خنازير غينيا بتحريك الساقين أو حناجرهم بعد رشة موجزة من الأنسجة بين أصابع قدميه مع الأظافر أو الجفل آذانهم والمضي قدما بها شعرات بعد معسر آذانهم. النقل الفوري للدم في أنبوب مع تخثر الدم، ومزيج دقيق من المتداول أو عكس الأنبوبة عدة مرات خطوة أساسية في هذا البروتوكول. للبروتوكول هو موضح هنا استخدمت أنابيب يدتا، وتم اختبار لا التخثر الأخرى. يرجى ملاحظة أن يدتا مكثف، وأنابيب ينبغي من الناحية المثالية ملء أكثر من نصف كاملة، وبالتالي حجم أنبوب مناسب لحجم العينة ويجب أن تستخدم.
عند تنفيذ بشكل صحيح، نتائج الكثافة المتدرجة الطرد المركزي استمرار تحضيرا ببمك نظيفة. يجب أن يكون متوسط الكثافة--التدرج في درجة حرارة الغرفة عند طبقات التدرج قبل الطرد المركزي، ولا ينبغي أن تستخدم الفرامل للتوقف في أجهزة الطرد المركزي عند استخدام أنابيب العادية. وكان تحسنا كبيرا من حيث التطبيق العملي ببمك-تجهيز المزيج من الكثافة الطرد المركزي التدرج مع الأجهزة ببمك والعزل. وهذا يسمح لتخفيض وقت الطرد المركزي. الكثافة المتدرجة استخدام الطرد المركزي في أجهزة ببمك والعزل ونتائج الأنابيب العادية في صلاحية مماثلة، تعول خلية يعيش ببمكس المجهزة، وتشكيل بقعة. مستقلة نوع الأنابيب المستخدمة للفصل، ينبغي أن يتبع الحصاد معطف بافي فورا. على مدى فترة ممتدة من الوقت والاتصال مع كثافة متوسطة الانحدار السامة للخلايا ببمكس.
العد دقيقة من ببمكس قابلة للحياة من المهم أن البذور دائماً تساوي عدد الخلايا في الآبار المقايسة-لوحة. وينبغي تطبيق بعض الأساليب من التمييز يعيش الميت. في المختبر، ولدينا نحن نستخدم المقايسة الاستبعاد تريبان الأزرق وخلية-عداد الآلي.
سيؤدي إلى نوعية بقعة، عرف البقع يتناقض ذات حواف حادة وعالية، في تحسين دقة والعد الموضعية متسقة، خاصة عند استخدام نظام الفرز الآلي. وتمشيا مع توصيات الشركة المصنعة، لاحظنا الإيثانول المعالجات المسبقة من ألواح السبت أن تكون خطوة حاسمة الحد من عدد النقاط الأساسية وتحسين تعريف البقع. ينصح بشدة استخدام قارئ لوحة لصورة المقايسة-لوحات السبت في نهاية البروتوكول. يمكن الصور الأصلية لكل بئر بسهولة وكفاءة الحصول عليها وتخزينها. استخدام برنامج تحليل صور الصور الرقمية كما تسمح بتحليل موضوعي والعد الموضعية مقارنة بالعد اليدوي من العوامل الفردية.
ضرورة مطلقة لتطوير التحليل الموضحة هنا كان جيل خنزير غينيا لمكافحة مناسبة انترفيرون-غاما جسم الزوج. وضعت الماوس مونوكلونل الخامس-هاء-4 و N-G3 هيبريدوما-تقنية استنساخ خلايا ب من الفئران التي تم تحصين مع خنزير غينيا المؤتلف انترفيرون غاما20. الخامس-هاء-4، و IgG1 ايستب، ونون-G3، وهو IgG2a، ترد لربط كل من مستضد المؤتلف وأصلي. تعيين الخامس-هاء-4 كجسم الالتقاط وبيوتينيلاتيد ن-G3 حيث أسفرت جسم الكشف عن حساسية عالية للبروتين المؤتلف والأم على السواء مع الاحتفاظ بإشارة خلفية منخفضة في شكل ساندويتش أليسا. كل الأجسام المضادة المتاحة للمجتمع العلمي من خلال اتفاق تصنيع يقودها مختبر الدكتور هوبرت شايفر، الذي هو المؤلف المشارك لهذا المنشور. سوف تلقي مختبر الدكتور شيفر الطلبات وثم تصنيعها من قبل شريك تجاري.
انترفيرون-غاما يقال أن تكون غير مستقرة في المخازن أو وسائل الإعلام العادية21. شايفر et al.20 ذكرت فقط انخفاض معتدل لمعدل الاسترداد عند استخدام المتدهورة IFN-y، التي فقدت الوظيفة البيولوجية، في شكل أليسا استخدام الأجسام المضادة الخامس-هاء-4 ونون-G3. ومع ذلك، زيادة فترة الحضانة من التحفيز الببتيد من ببمكس ما يزيد على 18 ح ينبغي بعناية اختبار.
وقد نوقشت مزايا استخدام ببمكس. ومع ذلك، يعكس المقايسة الموصوفة هنا فقط استجابات محددة مستضد تعميم خلايا تي في المحيط. التسلل إلى أنسجة خلايا تي أو الخلايا المعزولة من أجهزة اللمفاوي، مثل الطحال والغدد الليمفاوية، قد يحمل خصائص مختلفة22،،من2324. لم توجد فروق مهمة في الاستجابات الخلوية لوحظت عند المقارنة بين البقع انترفيرون-غاما من ببمكس وسبلينوسيتيس من خنازير غينيا التي تم تحصين ب لقاح الإنفلونزا pNP نفسه14.
في هذا البروتوكول، وصفت لنا إجراء تطعيم داخل الأدمة. تستهدف الأساس منطقي الرئيسي للتحصين معرف كثافة عالية من الخلايا الجذعية موجودة في الجلد25. نحن وآخرون أظهرت أن هذه الخلايا يمكن أن يكون تحديداً بتكييف أسلوب تسليم26أو27من صياغة تصميم الأدوية28. تنشيط خلايا مستضد تقديم المهنية قد تهاجر إلى عقده الليمفاوية تجفيف وتنشيط الجهاز المناعي التكيفي29،30،،من3132. الخلايا الجذعية هي عرض الخلية-نوع مستضد الأساسية فتيلة الاستجابات المناعية الخلوية المنتجة.
لهذه الدراسة تم تحصين الحيوانات مع بلازميد الحمض النووي ترميز البروتين النووي للأنفلونزا H1N1 سلالة A/بويرتوريكو/8. قد ثبت التسليم الجلد من هذا اللقاح بدنا (pNP) في تركيبة مع انهانسر الحصول على ردود محددة مستضد خلطيه في خنازير غينيا33، فرت، والمقدمات غير البشرية (NHPs)1،34. بالإضافة إلى ذلك، أثارت هذا اللقاح ردود تي خلية قوية في الفئران بعد الولادة إلى35البشرة التي يمكن أن تعزى إلى خلايا CD4 والخلايا التائية CD8 بحفز مع الببتيدات تمثل [ابيتوبس] محددة لهذه الخلية-السكان. وكان اللقاح pNP مكسبه بعد الولادة المخاطية كما يتبين من توليد استجابات خلطيه في الأرانب وخنازير غينيا، فضلا عن الاستجابات الخلوية وخلطيه في الفئران36أيضا. في الآونة الأخيرة، كان لدينا مجموعة قادرة على إثبات توليد استجابات IFN-γT-خلية في الأرنب بعد الولادة داخل العضلات (بيانات غير منشورة).
وحاليا، لا يمكن تخصيص البقع انترفيرون-غاما لوحظت في خنزير غينيا السبت لمجموعة فرعية CD8 + تي خلية أو خلايا CD4 +. خاصة بالنسبة لتصميم وتطوير العلاجات المناعية تستهدف الجلد، سيكون من المفيد جداً لتحديد ما إذا كانت انترفيرون-غاما لوحظت الترددات الموضعية هي الناجمة عن التوسع في مجموعة فرعية معينة واحدة أو استجابة متوازنة على حد سواء من أجل تقييم فعالية التطعيم لتشغيل العرض التقديمي عبر. قد يمكن التغلب على هذا القيد بسلبية فرز الخلايا CD4 أو CD8 قبل البذر الخلايا على اللوحة أو بواسطة تحديد فئة MHC الثاني (للردود CD4) أو الطبقة MHC أنا (للردود CD8) مقيدة [ابيتوبس].
والرزن انترفيرون-غاما السبت وصف هنا باستخدام ببمكس خنزير غينيا يتناول الحاجة إلى تقييم مسار للاستجابات الخلوية في الطراز المختبر خنزير غينيا. وهذا صقل تطوير لقاحات والجلد بروتوكولات التسليم. ونحن نعتقد أنه يسمح لتوظيف هذا النموذج الحيواني ذات الصلة لدراسة مكونات تي خلية هامة مثل السل37،38من فيروس إيبولا، HSV39، وغيرها من الأمراض. فإنه سيتم تقليل استخدام نماذج حيوانية أقل أهمية.
Disclosures
الكتاب العاملين كاثرين سشولتهيس، هولي م بف، يونغ س. بريان، يا جانيت، هولي م بف، جاكلين نغوين، حمو لوران، برودريك هاء كيت وتريفور R.F. سميثاري إينوفيو المستحضرات الصيدلانية، وعلى هذا النحو الحصول على المرتبات والاستحقاقات، بما في ذلك ملكية الأسهم وخيارات الأسهم، من الشركة.
Acknowledgments
ونود أن نشكر أعضاء إينوفيو المستحضرات الصيدلانية والتطوير إدارة د للمساعدة التقنية والموظفين من أككولاب لتوفير خدمة تربية التميز. خاصة نود أن نشكر فو اليشع وجو أغنيس لتصحيح التجارب المطبعية المخطوط. تم تمويل هذا العمل ليس بأي منحة محددة من وكالات التمويل في القطاعات العامة، التجاري، أو عدم الربح.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cellectra-3P | Inovio Pharmaceuticals | ID-Electroporatio device/ non-commercial, R&D-only | |
| K2EDTA blood collection tube | BD | 367844 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Gibco | 14175-079 | |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthacre | 17144003 | density gradient medium |
| SepMate tube | STEMCELL Technologies | 85415 | PBMC-isolation device |
| RPMI | Thermo Fisher | 11875-135 | |
| heat-deactivated FBS | VWR | 97068-085 | |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | |
| β-Mercaptoethanol | Gibco | 21985-023 | |
| 96-well ELISpot PVDF-membrane | Millipore | MSIPS4W10 | ELISpot assay plate |
| Ethanol | Sigma | 459844-1L | |
| UPDI | Invitrogen | 10977-015 | Ultra-Pure DI water |
| Sucrose | Sigma | S7903 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A7906 | |
| 10x PBS | HyClone | SH30378.03 | |
| Concanavalin A (ConA) | Sigma | C5275-5MG | |
| alkaline phosphatase (ALP)-conjugated streptavidin | R&D Systems Inc. | SEL002 | |
| BCIP/NBT | R&D Systems Inc. | SEL002 | |
| capture anti-guinea pig IFN-γ antibody V-E4 | GenScript | Order #:U5472CE080-3 | LOT # A217071153 |
| biotinylated detection anti-guinea pig IFN-γ antibody N-G3 | GenScript | Order #:U5472CE080-1 | LOT # A21700598 |
| CTL S6 Micro Analyzer | ImmunoSpot | #S6MIC12 | automated ELISpot plate reader |
| Vi-CELL XR | Beckman-Coulter | 731050 | automated cell counter |
| ImmunoSpot 5.1 | ImmunoSpot | assay analysis software | |
| ESCO Class II Type A2 | ESCO | Biosafety cabinet | |
| Falcon cell strainer | Corning, Inc. | VWR cat# 21008-952 | |
| Exel Comfort Point Insulin syringe | MedLab Supply | 26028 | |
| Rotanta 460R | Hettich | centrifuge | |
| Vi-CELL XR Quad Pak Reagent Kit | Beckman Coulter | 383722 | |
| Incu Safe | Panasonic-Healthcare | incubator | |
| 22 µm Filter | ThermoScientific | VWR act# 597-4520 | 22 µm Filter |
| KimWipes | Kimberly-Clark Professional | VWR cat# 21903-005 | paper towels |
References
- Laddy, D. J., et al. Heterosubtypic protection against pathogenic human and avian influenza viruses via in vivo electroporation of synthetic consensus DNA antigens. PloS One. 3 (6), 2517 (2008).
- Lee, J. Y., Chang, J. Recombinant baculovirus-based vaccine expressing M2 protein induces protective CD8+ T-cell immunity against respiratory syncytial virus infection. Journal of Microbiology. 55 (11), 900-908 (2017).
- Kinnear, E., et al. Airway T cells protect against RSV infection in the absence of antibody. Mucosal Immunology. , (2017).
- Sridhar, S., et al. Cellular immune correlates of protection against symptomatic pandemic influenza. Nature Medicine. 19 (10), 1305-1312 (2013).
- Brand, H. K., et al. CD4+ T-cell counts and interleukin-8 and CCL-5 plasma concentrations discriminate disease severity in children with RSV infection. Pediatric Research. 73 (2), 187-193 (2013).
- Bouvier, N. M. Animal models for influenza virus transmission studies: a historical perspective. Current Opinion in Virology. 13, 101-108 (2015).
- St Claire, M. C., Ragland, D. R., Bollinger, L., Jahrling, P. B. Animal Models of Ebolavirus Infection. Comparative Medicine. 67 (3), 253-262 (2017).
- Todo, H. Transdermal Permeation of Drugs in Various Animal Species. Pharmaceutics. 9 (3), 33 (2017).
- Schafer, H., Burger, R. Tools for cellular immunology and vaccine research the in the guinea pig: monoclonal antibodies to cell surface antigens and cell lines. Vaccine. 30 (40), 5804-5811 (2012).
- Czerkinsky, C. C., Nilsson, L. A., Nygren, H., Ouchterlony, O., Tarkowski, A. A solid-phase enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay for enumeration of specific antibody-secreting cells. Journal of Immunological Methods. 65 (1-2), 109-121 (1983).
- Sedgwick, J. D., Holt, P. G. A solid-phase immunoenzymatic technique for the enumeration of specific antibody-secreting cells. Journal of Immunological Methods. 57 (1-3), 301-309 (1983).
- Moodie, Z., et al. Response definition criteria for ELISPOT assays revisited. Cancer Immunology, Immunotherapy. 59 (10), 1489-1501 (2010).
- Gillis, P. A., et al. Development of a novel, guinea pig-specific IFN-gamma ELISPOT assay and characterization of guinea pig cytomegalovirus GP83-specific cellular immune responses following immunization with a modified vaccinia virus Ankara (MVA)-vectored GP83 vaccine. Vaccine. 32 (31), 3963-3970 (2014).
- Schultheis, K., et al. Characterization of guinea pig T cell responses elicited after EP-assisted delivery of DNA vaccines to the skin. Vaccine. 35 (1), 61-70 (2017).
- Mantoux Tuberculin Skin Test DVD Facilitator Guide - CDC (Part One). , Available from: https://www.cdc.gov/tb/education/Mantoux/images/mantoux.pdf (2013).
- Birck, M. M., Tveden-Nyborg, P., Lindblad, M. M., Lykkesfeldt, J. Non-Terminal Blood Sampling Techniques in Guinea Pigs. Journal of Visualized Experiments. (92), e51982 (2014).
- Strober, W. Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability. Current Protocols in Immunology. 111, 1-3 (2014).
- Lewis, J. H. Comparative hematology: studies on guinea-pigs (Cavia porcellus). Comparative Biochemistry and Physiology: Comparative Physiology. 102 (3), 507-512 (1992).
- Flecknell, P. Laboratory Animal Anaesthesia (Fourth Edition). Flecknell, P. , Academic Press. 77-108 (2016).
- Schaefer, H., Kliem, G., Kropp, B., Burger, R. Monoclonal antibodies to guinea pig interferon-gamma: tools for cytokine detection and neutralization. Journal of Immunological Methods. 328 (1-2), 106-117 (2007).
- Lipiainen, T., et al. Formulation and stability of cytokine therapeutics. Journal of Pharmaceutical Sciences. 104 (2), 307-326 (2015).
- Wang, X. Z., et al. Virus-Specific CD8 T Cells in Peripheral Tissues Are More Resistant to Apoptosis Than Those in Lymphoid Organs. Immunity. 18 (5), 631-642 (2003).
- Veron, P., et al. Deep Sequencing of T Cell Receptor in Peripheral Blood and Muscle from Adeno-Associated Virus Vector-Injected Subjects Reveals Differences in T Cell Clonality Between the Two Compartments. Molecular Therapy. 23, 210 (2015).
- Sckisel, G. D., et al. Differential phenotypes of memory CD4 and CD8 T cells in the spleen and peripheral tissues following immunostimulatory therapy. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 5 (1), 33 (2017).
- Yanofsky, V. R., Mitsui, H., Felsen, D., Carucci, J. A. Understanding Dendritic Cells and Their Role in Cutaneous Carcinoma and Cancer Immunotherapy. Clinical and Developmental Immunology. 2013, 624123 (2013).
- Amante, D. H., et al. Direct Transfection of Dendritic Cells in the Epidermis After Plasmid Delivery Enhanced by Surface Electroporation. Human Gene Therapy Methods. 25 (6), 315-316 (2014).
- Mahe, B., et al. Nanoparticle-based targeting of vaccine compounds to skin antigen-presenting cells by hair follicles and their transport in mice. Journal of Investigative Dermatology. 129 (5), 1156-1164 (2009).
- Vandermeulen, G., et al. Skin-specific promoters for genetic immunisation by DNA electroporation. Vaccine. 27 (32), 4272-4277 (2009).
- Brave, A., Nystrom, S., Roos, A. K., Applequist, S. E. Plasmid DNA vaccination using skin electroporation promotes poly-functional CD4 T-cell responses. Immunology and Cell Biology. 89 (3), 492-496 (2011).
- Romani, N., et al. Targeting skin dendritic cells to improve intradermal vaccination. Current Topics in Microbiology and Immunology. 351, 113-138 (2012).
- Smith, T. R., et al. DNA vaccination strategy targets epidermal dendritic cells, initiating their migration and induction of a host immune response. Molecular Therapy Methods & Clinical Development. 1, 14054 (2014).
- Teunissen, M. B., Haniffa, M., Collin, M. P. Insight into the immunobiology of human skin and functional specialization of skin dendritic cell subsets to innovate intradermal vaccination design. Current Topics in Microbiology and Immunology. 351, 25-76 (2012).
- Lin, F., et al. A novel prototype device for electroporation-enhanced DNA vaccine delivery simultaneously to both skin and muscle. Vaccine. 29 (39), 6771-6780 (2011).
- Laddy, D. J., et al. Electroporation of synthetic DNA antigens offers protection in nonhuman primates challenged with highly pathogenic avian influenza virus. Journal of Virology. 83 (9), 4624-4630 (2009).
- Lin, F., et al. Optimization of Electroporation-Enhanced Intradermal Delivery of DNA Vaccine Using a Minimally Invasive Surface Device. Human Gene Therapy Methods. 23 (3), 157-168 (2012).
- Kichaev, G., et al. Electroporation mediated DNA vaccination directly to a mucosal surface results in improved immune responses. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 9 (10), 2041-2048 (2013).
- Klunner, T., Bartels, T., Vordermeier, M., Burger, R., Schafer, H. Immune reactions of CD4- and CD8-positive T cell subpopulations in spleen and lymph nodes of guinea pigs after vaccination with Bacillus Calmette Guerin. Vaccine. 19 (15-16), 1968-1977 (2001).
- Shedlock, D. J., et al. Induction of Broad Cytotoxic T Cells by Protective DNA Vaccination Against Marburg and Ebola. Molecular Therapy. 21 (7), 1432-1444 (2013).
- Hensel, M. T., et al. Prophylactic Herpes Simplex Virus 2 (HSV-2) Vaccines Adjuvanted with Stable Emulsion and Toll-Like Receptor 9 Agonist Induce a Robust HSV-2-Specific Cell-Mediated Immune Response, Protect against Symptomatic Disease, and Reduce the Latent Viral Reservoir. Journal of Virology. 91 (9), 02257 (2017).
