Summary
Udviklingen af interferon-gamma ELISpot assay for marsvin PBMC tillader karakterisering af T-celle svar i denne meget relevante model til at studere infektionssygdomme. Vi har anvendt analyse til måling af T celle svar tilknyttet intradermal levering af DNA-vacciner.
Abstract
Marsvin har spillet en central rolle som relevante små dyr model for udviklingen af vacciner mod infektionssygdomme som tuberkulose, influenza, difteri og viral hæmoragisk feber. Vi har demonstreret, at plasmid-DNA (pDNA) vaccine levering ind i huden fremkalder robust humorale respons i marsvin. Brugen af dette dyr til model immunrespons var dog noget begrænset i fortiden på grund af manglen på tilgængelige reagenser og protokoller til at studere T-celle svar. T celler spiller en central rolle i både immunoprophylactic og immunterapeutisk mekanismer. Forståelse af T celle svar er afgørende for udviklingen af smitsomme sygdomme og onkologi vacciner og imødekommende levering enheder. Her beskriver vi en interferon-gamma (IFN-γ) enzym-forbundet immunospot (ELISpot) analyse for marsvin perifert blod mononukleære celler (PBMC). Analysen gør det muligt for forskere at karakterisere vaccine-specifikke T-celle respons i denne vigtige gnaver model. Evnen til at assay celler isoleret fra de perifere blod giver mulighed for at spore immunogenicitet hos det enkelte dyr.
Introduction
Protokollen beskrevet her tillader påvisning af interferon-gamma (IFN-γ) hemmelig celler efter antigen tilbagekaldelse i perifert blod mononukleære celler (PBMC) indbyggere høstet fra Hartley marsvin. Vi har anvendt assay for at karakterisere kinetik og omfanget af antigen-specifikke T-celle svar til en Influenza vaccination-regime i guinea gris. Vi mener, at denne protokol vil betydeligt fremdrive præklinisk udvikling af vaccination programmer i denne meget relevante dyremodel.
T celler fremkaldes ved vacciner spiller en væsentlig rolle i beskyttelse mod smitstoffer og immunterapeutisk veje forbundet med andre sygdomme. Betydningen af T-celler er blevet fremhævet i flere vaccine undersøgelser. Vaccination af fritter og mus med en plasmid DNA (pDNA) kodning for H5 hemagglutinin og N1 neuraminidase forudsat beskyttelse fra sygelighed og dødelighed i en influenza virus udfordring i mangel af neutraliserende antistoffer, der angiver betydningen af T-celle immunitet1. Ud over stærke neutralisere humorale respons, T-celler spiller en afgørende rolle for ikke kun viral clearance2 , men også beskyttelse mod infektion med respiratorisk syncytialvirus (RSV) i mus3. Hos mennesker var præ-eksisterende CD8 + T celler forbundet med nedsat sygdommens sværhedsgrad i løbet af H1N1-pandemien i 20094. CD4 + T celle tæller sammen med visse cytokin plasmakoncentration er korreleret med sygdommens sværhedsgrad i RSV-smittede børn5.
Marsvin har fået fremtrædende plads som en laboratoriemodel for forskning og udvikling i forskellige områder af medicin såsom sensibilisering af huden, ernæringsmæssige forskning, undersøgelser af det auditive system og mest relevante for dette arbejde, infektionssygdomme. Det var afgørende for opdagelsen af vacciner mod tuberkulose og difteri. For nylig bruges marsvin som model for Influenza6 og Ebola7. Derudover tilbyder besidder fysiologiske ligheder med menneskers hud8, marsvin en tilgængelig lille dyremodel for dermal drug leveringsmetoder. I modsætning til dens betydning som en laboratoriemodel forbliver tilgængeligheden af marsvin specifikke assays og sonder at karakterisere immunrespons begrænset9. Grundlæggende cellulære assays såsom den IFN-γ enzym-forbundet immunospot (ELISpot-assay) som bruges rutinemæssigt i prækliniske og kliniske forskning til at optælle T-celle svar har ikke været tilgængelige.
De første fast-fase enzym-forbundet immunospot assays blev anvendt til at bestemme antallet af specifikke antistof-secernerende celler i en forskelligartet B celle-befolkningen10,11. Formatet har avanceret for at finde celler udskiller cytokiner, herunder IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, GM-CSF, TNF-alfa, TNF-beta, granzyme B og IFN-γ. ELISpot analysen besidder høj følsomhed; potentielt kan hvert cytokin-producerende celle påvises. Påvisningsgrænsen for ELISpot assays er blevet rapporteret at være lavere end 10 steder pr. 100.000 PBMC12. For nylig et marsvin IFN-γ specifikt antistof par blev gjort tilgængelige13, og det har åbnet op for muligheden for at afhjælpe denne mangel i feltet.
IFN-γ er betragtes som en vigtig effektor molekyle i den adaptive immunrespons; Det kan fremstilles og udskilles af både CD4 og CD8 T celler ved aktivering. IFN-γ har en bred vifte af biologiske funktioner i forbindelse med en immunrespons på en virusinfektion, såsom aktiveringen af makrofager og forordningen op af større histocompatibility komplekse (MHC) jeg og MHCII udtryk. Det skal også fremmer B-celle differentiering, hæmmer T-hjælper-2 cellevækst og aktiverer naturlige dræberceller. IFN-γ blokerer viral replikation i inficerede somatiske celler og upregulates udtryk af MHC molekyler. Produktion af IFN-γ er således en meget vigtig indikation af kvaliteten af T-celle respons til en vaccine eller patogen.
Et vigtigt aspekt af den her præsenteres IFN-γ ELISpot er brugen af PBMC snarere end splenocytes13. PBMC kan opnås ved behandling af en ikke-terminal indsamlede blodprøve, indsamling af splenocytes kraever animalske euthanization før høsten af milten. Brugen af PBMC muliggør IFN-γ T-celle svar overvåges over en periode og evaluering af virkningerne for T-celle svar som prime-boost regimer14.
For forskere, der i øjeblikket bruger marsvin som en dyremodel, vil metoden IFN-γ ELISpot udvide viften af videnskabelige data, de kan få. Dens tilgængelighed kan nu reducere behovet for at gennemføre undersøgelser med mindre relevante dyremodeller for target sygdommen, som tidligere blev valgt på grund af reagens tilgængelighed for undersøgelse af cellulære svar. Brugen af PBMC snarere end milt eller lymfeknuder giver mulighed for ikke-terminal eksperimenter og løbende overvågning af enkelte dyr.
Nedenfor giver vi en detaljeret beskrivelse af de trin i påvisning af en IFN-γ cellulære respons i marsvin til pDNA vaccine. Vi skitsere vores særlige levering procedure og beskrive den generelle ELISpot assay omfatter udtagning af blodprøve, blod behandling, PBMC høst, ANALYSEPROCEDURE, og dataanalyse. En skematisk af ELISpot assay er afbildet i figur 1.
Figur 1 : Skematisk oversigt over marsvin ELISpot protokol. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Protocol
Alle metoder beskrevet her er blevet godkendt af Animal Care og brug udvalg (ACUC) af Acculab.
Bemærk: Protokollen kræver brug af potentielle farlige materialer. Der henvises til fabrikantens muskel-og Skeletbesvær og bære ordentlig personlige udstyr (PPE) under hele proceduren.
1. forberedelse af webstedet marsvin immunisering, intradermal Mantoux-indsprøjtning og CELLECTRA-3P-EP-procedure
-
Forberedelse af webstedet behandling på marsvin.
- Placer marsvin i en induktion kammer og anaesthetize på 5% isofluran-dampe.
- Fjerne dyr fra salen og placere næsen kegle i stilling, giver 2% isofluran damp for at opretholde anesthesia under hele proceduren.
- Barbere område af ca 4 cm2 på abdominal flanke.
- Desinficere barberede område med Ethanol-serviet.
-
Injektion af pDNA-formulering og elektroporation procedure.
- Bruge en Insulin-sprøjte til indsprøjtes 100 µl formulering i dermis af Mantoux teknik. Nål indsættes facet op på en 10 graders vinkel med dyrets krop.
- Fjern nålen og straks indsætte CELLECTRA® - 3 P elektroden array på tværs af injektion-vabler og anvende elektrisk felt.
- Fjerne dyr fra anæstesi og overvåge dens inddrivelse.
2. ikke-terminal bløder
-
Blod samling fra halsfedt bedøvet marsvin.
- Placer marsvin i en induktion kammer og anaesthetize dyr, som beskrevet i punkt 1.1.1
- Ved hjælp af en 3 ml sprøjte med en 27G 1/2 tommer nål, punktformet halsfedt det bedøvet dyr og indsamler 3 ml blod.
- Straks overføre blod i K2EDTA blod collection tube, vend røret flere gange for at blande blod med antikoagulerende og sted på is.
Bemærk: Undgå blodpropper er afgørende for vellykket downstream behandling af blodprøven. - Overvåge dyrets opsving.
3. blod prøve behandling
-
Adskillelse af PBMC fra fuldblod ved tæthed-gradient centrifugering
- Fortynde blodet 1:1 med Hank's Balanced Salt løsning (HBSS).
Bemærk: For at undgå kontaminering alle arbejde herfra bør udføres i en biosikkerhed kabinet anvender aseptisk teknik. - Lag fortyndet blod gradvist over 4.5 ml Ficoll-Paque Plus i en 15 ml-koniske rør. Undgå forstyrrelser på grænsefladen. Bemærk: For at sikre korrekt adskillelse, skal Ficoll-Paque ved stuetemperatur.
- Der centrifugeres rør på 800 genbrugsfibre i 30 min med bremse ned.
Bemærk: som et alternativ, SepMate™ rør (STEMCELL Technologies) kan bruges til PBMC-adskillelse. HBSS-udvandet blod er føjet til 15 ml SepMate rør fyldt med 3,5 ml Ficoll-Paque Plus og derefter centrifugeres på 1200 genbrugsfibre for 10 min (bremse). Denne tidsbesparende gradient centrifugering teknik resulterer i lige levedygtighed, celle-udbytte og spot-dannelse. - Høste Buffy-Coat lag og fortyndes i R10 medium (10% (v/v) varme-deaktiveret FBS og 1% (v/v) Pen/Strep i RPMI1640 medium) til et samlet volumen på 15 ml.
- Pellet celler ved centrifugering på 450 genbrugsfibre i 5 min.
- Vaske cellerne to gange med R10 medium.
- Genopslæmmes celler i 1 ml R10 og passere cellesuspension gennem 70 µm celle-si i til en ny tube.
- Tælle celler og bestemme antallet af levende celler ved Trypan-blå farvning.
- Fortynd celler med R10 medium til en koncentration af 1 x 10 ^ 6 levende celler pr. ml.
- Fortynde blodet 1:1 med Hank's Balanced Salt løsning (HBSS).
4. forberedelse af ELISpot-plader og celle-stimulation
-
Frakke og blok wells af en 96-brønd ELISpot PVDF-membran plade før såning af PBMC.
- Pladerne bør forbehandlet i 60 sekunder. Ethanol forbehandling vil resultere i mindre uspecifik spot-dannelse og steder med bedre definition.
Bemærk: Tage ekstra omhu for at sikre komplet membranen kommer i kontakt med 15 µl 35% Ethanol. - Efter 60 sekunder Tilføj 150 µl 1 x PBS pr. brønd, og Tøm derefter ud wells af invertere pladerne.
Bemærk: Ethanol forbehandling er meget tidsfølsomme. Inkuber ikke godt-membranen længere end 60 sec. membraner ikke må tørre ud i løbet af de følgende trin i proceduren. - Vaske pladerne tre gange med 250 µl 1 x PBS pr. brønd.
- Frakke med 100 µl/brønd af 5 µg/ml capture anti-guinea gris IFN-γ antistof V-E4 i PBS.
- Inkuber plader til mindst 12 timer ved 4° C.
- Pladerne skylles ved at tilføje 250 µl/brønd PBS tre gange.
- Tilføje 200 µl/brønd blokerende buffer (10% (w/v) saccharose og 2% (w/v) BSA i PBS) og der inkuberes i 2 timer ved stuetemperatur.
- Pladerne med 250 µl/brønd PBS vaskes tre gange.
- Pladerne bør forbehandlet i 60 sekunder. Ethanol forbehandling vil resultere i mindre uspecifik spot-dannelse og steder med bedre definition.
-
Plade PBMC med antigen-specifikke peptider, positive og negative kontroller.
- Fortynd protein-peptid pool i R10 ønskede endelige peptid koncentration.
- Analysen prøve PBMC i tre.
Bemærk: Først tilføje medium med centralstimulerende lægemidler til ELISpot pladerne og tilføje PBMC suspension andet. - Tilføje 50 µl af peptid-R10 medium til angivne brønde.
- For negativ kontrol Tilsæt 50 µl Tom peptid formulering i R10 i angivne brønd.
- Til positiv kontrol tilføje 5 µg/ml Concanavalin A (ConA) i R10 medium til angivne brønde.
- Tilføje 100 µl af PBMC cellesuspension til alle brønde
- Inkuber plader i befugtet 5% CO2 atmosfære ved 37° Celsius til 18 timer.
Bemærk: Sted ELISpot plader på en selv overfladen/rack i rugemaskinen og undgå forstyrrelser af pladerne under inkubationstiden.
5. påvisning af Interferon-gamma positive steder
-
Inkubering med detektion antistof og plade udvikling.
Bemærk: For alle trinnene i dette afsnit ikke aseptisk teknik er nødvendig.- Fjern forsigtigt plader fra rugemaskinen, og sikkert tømme brøndene. Pladerne skylles ved at tilføje 250 µl/brønd PBS for tre gange.
- Tilsæt 100 µl/brønd af 2 µg/ml biotinylated påvisning anti-marsvin IFN-γ antistof N-G3 fortyndet i blokerende buffer.
Bemærk: Filteret (22 µm) antistof løsning til at reducere baggrund. - Inkuber med detektor-antistof til 2 timer ved stuetemperatur.
- Kassér supernatanten og vaske pladerne ved at tilføje 250 µl/brønd PBS tre gange.
- Tilføj 100 µl/brønd af alkalisk fosfatase (ALP)-konjugeret streptavidin fortyndes i blokerende buffer.
Bemærk: Filteret (22 µm) løsning til at reducere baggrund. - Der inkuberes med ALP-Streptavidin konjugat i 1 time ved stuetemperatur.
- Kassér ALP-Streptavidin løsning pladerne skylles ved at tilføje 250 µl/brønd PBS to gange, og fjerne overskydende PBS af invertere pladen og duppe det mod et rent stykke køkkenrulle.
- Pladerne skylles ved at tilføje 250 µl/brønd ultrarent DI vand én gang, og fjerne overskydende vand af invertere pladen og duppe det mod et rent stykke køkkenrulle.
- Tilføj 100 µl af BCIP/NBT (forsigtighed) substratopløsning i hver brønd. Forsigtig: BCIP/NBT er meget brandfarlige og giftig ved indtagelse, kontakt med huden, eller indåndes. Før brug henvise til sikkerhedsdatablade.
- Ruger i 20 min. ved stuetemperatur beskyttet mod lys.
- Skyl pladen 4 gange med deioniseret vand. Vend pladen og tryk for at fjerne overskydende vand.
- Fjern plast dræning fra bunden af ELISpot plader og lad plader til tørre.
- Kvantificere steder manuelt eller ved hjælp af en automatiseret ELISpot læser, for eksempel i CTL-Immunospot S6 pladelæseren.
Representative Results
Resultaterne præsenteres her tjene som reference for forventede resultater efter anvendelse af denne protokol, understreger betydningen af afgørende trin og bekræfte fordelene ved beskrevet optimeringer.
Efter tæthed-gradient centrifugering, som beskrevet i trin 3.1 i protokollen, vil de røde tyktflydende væske i bunden af røret indeholder de fleste af de røde blodlegemer. Som vist i figur 2erA, ovenstående de røde blodlegemer et lag af tæthed-medium. Mellem et lag af klare eller gule plasma på toppen og tætheden er gradient medium hvid eller lys brun buffy coat lag, som indeholder de fleste af de hvide blodlegemer og blodplader. Ufuldstændig adskillelse ville åbenbart som tilstedeværelsen af røde blodlegemer på toppen af tæthed-gradient medium. Den røde farve af plasma i figur 2et er sandsynligvis på grund af hæmolyse, som denne blodprøve blev gemt i collection tube 1,5 time før der behandles. Figur 2 B viser gradient før (venstre) og efter (højre) centrifugering i PBMC afspærringsanordning. Blodprøve i figur 2B blev behandlet med minimal forsinkelse efter blod indsamling og plasma farve er gul.
Effekten af pre befugtning membraner med ethanol (Se trin 4.1 i protokollen) på stedet-udvikling er vist i figur 3. Steder i forbehandlet wells vise forbedrede definition, og der er en reduktion i antallet af Steder i medium/DMSO negativ kontrol wells (fig. 3A). Typiske levedygtighed af forarbejdede marsvin PBMC svinger omkring 90% og er ens for både regelmæssige 15 mL rør og PBMC-isolation enheder (fig. 3B). Udbyttet af levedygtige celler fra en 3 mL blodprøve spænder typisk mellem 3 x 106 og 5 x 106.
Dyrene blev immuniseret med plasmid DNA kodning nucleoprotein (NP) af H1N1 Influenza-stamme A/PuertoRico8. Figur 4 viser optællingen af T-celle IFN-γ svarene præsenteret som spot-dannende enheder (SFU) genereres på tværs af varigheden af en vaccination regime. ELISpot assay med PBMC høstet fra ikke-vaccineret dyr resultater i ubetydelig plet tæller (ingen tx). Fjorten dage efter den første vaccination (prime), et gennemsnit på 970 IFN-γ steder pr. million PBMC var talt op efter immunogen stimulation. Syv dage efter den anden immunisering (boost), blev T-celle svar mod alle tre pools udvidet, at nå frem til et gennemsnit på 5020 IFN-γ SFUs/106 PBMC. fyrre-seks dage efter den anden immunisering (hukommelse), en gennemsnitlige samlede 6310 IFN-γ SFUs/10 6 PBMC blev talt i perifert blod.
FIGUR LEGENDS:
Figur 2 : Repræsentant billeder af lag efter tæthed-gradient centrifugering. (A) blod prøve før (venstre) og efter (højre) centrifugering i regelmæssig rør. (B) blod prøve før (venstre) og efter (højre) centrifugering i PBMC-isolation enheder. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Optimering af protokollen. (A) typiske udseende af IFN-γ positive steder i en ELISpot assay plade godt udviklet efter protokol. Eksempel tredobbelt brønde er vist efter forbehandling med ethanol (til højre) eller uden forbehandling (til venstre). Celler blev inkuberet natten enten med DMSO (top) som nej-stimulus kontrol, antigen-matchede peptider (midten) eller mitogen ConA (nederst). PBMC stammer fra det samme enkelte dyr. Brønde blev afbildet ved hjælp af en automatiseret plade-scanner. (B) sammenligning af forskellige tæthed-gradient rør på forarbejdede celler. 3 mL af blodprøver fra 3 individuelle marsvin blev indsamlet. 1,5 mL af hver prøve blev behandlet ved hjælp af enten regelmæssige rør (tæthed gradient medium) eller PBMC-isolation enheder. Levedygtighed (venstre, % ± SEM) og antallet af levende celler (højre, x 106 ± SEM) blev bestemt ved hjælp af en automatisk celle tælle system og trypan-blå udstødelse assay. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : Påvisning af robust cellulære immunrespons i løbet af en vaccination regime. På dag 1 og 15, blev 30 µg for pDNA kodning influenza A nucleoprotein (NP) leveret intra-dermally til abdominal flanke af Hartley marsvin umiddelbart efterfulgt af hud-elektroporation. IFN-γ ELISpot svar blev målt 14 dage efter den første vaccination (prime), og 7 dage (boost) og 46 dage (hukommelse) efter den anden immunisering. Gennemsnitlig SFUs + SEM blev afbildet til 5 behandlede marsvin og 2 ubehandlet marsvin (ingen tx). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Marsvin er en værdifuld dyremodel for præklinisk udvikling af vacciner og intradermal levering strategier. Den ovennævnte protokol beskriver metoden til at måle antigen-specifikke T-celle respons i denne yderst relevant model. Analysen giver et klart optælling af perifert T-celler producerer Interferon-gamma efter stimulation med antigen-specifikke peptider. Kinetik af immunresponset kan blive overvåget af ikke-terminal blod prøveudtagning.
Vi optimeret protokollen og identificeret kritiske aspekter for at opnå optimale resultater ved hjælp af denne analyse. For eksempel, vil dannelsen af blodpropper i collection tube resultere i suboptimal PBMC opsving og levedygtighed. Marsvin blodpropper meget hurtigt18. Det er afgørende at udføre blod tegne hurtigt. AU-Birck et al. giver en omfattende guide til blødning teknikker i guinea-svin model16. Da samlingen blod kræver generel anæstesi, anbefales det at gennemgå relevante standardforskrifter, som dette aspekt af proceduren19. Utilstrækkeligt bedøvet marsvin vil reagere ved at flytte deres ben eller vocalization efter en kort knivspids af vævet mellem deres tæer med dine negle eller ved at blinke deres ører og flytte deres knurhår frem efter klemme deres øre. Øjeblikkelig overførsel af blod ind i et rør med antikoagulans og bland grundigt ved rullende eller invertere røret flere gange er et vigtigt skridt i denne protokol. Den her beskrevne protokol EDTA-rør blev brugt, og ingen andre antikoagulanter blev testet. Bemærk venligst at EDTA er hypertonisk, rør bør ideelt set være fyldt mere end halvt fuldt, og derfor passende rør størrelse sample volumen skal bruges.
Når udført korrekt, resulterer tæthed gradient centrifugering konsekvent i ren PBMC forberedelse. Densitet-gradient medium skal ved stuetemperatur, når lagdeling gradient inden centrifugering, og bremser bør ikke anvendes for at stoppe centrifugen, når ved hjælp af regelmæssig rør. En betydelig forbedring med hensyn til praktiske PBMC-behandling var kombinationen af tæthed gradient centrifugering med PBMC-isolation enheder. Dette giver mulighed for en nedsættelse af centrifugeringstiden. Tæthed gradient centrifugering i PBMC-isolation enheder og regelmæssig rør resultater i lignende levedygtighed, levende celle tæller forarbejdede PBMC og spot dannelse. Uafhængig af typen af røret bruges til adskillelse, buffy coat høsten skal følge umiddelbart. Over en længere periode er kontakt med tæthed gradient medium cytotoksiske til PBMC.
Præcis optælling af levedygtige PBMC er vigtigt at frø konsekvent lig antallet af celler i assay-plade brønde. Nogle metode til live/døde forskelsbehandling bør anvendes. I vores laboratorium bruger vi trypan-blå udstødelse analysen og en automatiseret celle-counter.
Spot kvalitet, defineret som skarp og høj kontrast steder, vil resultere i forbedret nøjagtighed og konsekvent spot optælling, især når du bruger et automatisk tælle system. I overensstemmelse med producentens anbefalinger observeret vi ethanol pre behandlinger af ELISpot pladerne til at være et afgørende skridt til at reducere antallet af baggrunden steder og forbedre definitionen af steder. Brug af en Pladelæser til billede ELISpot assay-plader i slutningen af protokollen er stærkt anbefales. Originale billeder af hver brønd kan nemt og effektivt fremstillet og opbevaret. Bruger et billede analyse software digitale billeder også muliggøre objektive analyse og spot tælle i forhold til manuel optælling af individuelle operatører.
En absolut nødvendighed for udviklingen af analysen beskrives her var generation af en egnet anti-marsvin Interferon-gamma antistof par. Musen monoklonale antistoffer V-E4 og N-G3 blev udviklet af hybridom-teknik med B-celle kloner fra mus, som blev immuniseret med rekombinant marsvin interferon gamma20. V-E4, som er IgG1 isotype, og N-G3, som er IgG2a, er rapporteret at binde begge at det rekombinante og indfødte antigen. Tildele V-E4 som fange antistof og biotinylated N-G3 som detektor-antistofs resulterede i høj følsomhed for både rekombinant og indfødte protein samtidig bevare lave baggrunden signal i en sandwich-ELISA format. Begge antistoffer er tilgængelige til det videnskabelige samfund gennem en produktion aftale ledet af laboratoriet for Dr. Hubert Schaefer, der er medforfatter af denne publikation. Anmodninger modtaget af Dr. Schaefer's lab og derefter fremstillet af en kommerciel partner.
Interferon-gamma er rapporteret at være ustabil i regelmæssig buffere eller media21. Schaefer et al.20 rapporteres kun en moderat fald i genfindingsprocenten når ved hjælp af forringet IFN-y, som havde mistet biologiske funktionalitet i en ELISA format ved hjælp af antistoffer V-E4 og N-G3. Dog bør stigende inkubationstiden peptid stimulation af PBMC over 18 h være omhyggeligt afprøvet.
Fordelene ved at bruge PBMC er blevet drøftet. Den her beskrevne analyse afspejler imidlertid kun antigen-specifikke svar af cirkulerende T-celler i periferien. Væv-infiltrerer T-celler eller celler isoleret fra lymfatiske organer som milt og lymfeknuder, kan udvise forskellige egenskaber22,23,24. Ingen væsentlige forskelle i cellulære Reaktionerne blev observeret ved sammenligning af interferon-gamma steder fra PBMC og splenocytes fra forsøgskaniner, som blev immuniseret med den samme pNP influenza vaccine14.
I denne protokol beskrev vi en intradermal vaccination procedure. En vigtigste rationale for ID immunisering er rettet mod den høje tæthed af dendritiske celler i huden25. Vi og andre har vist, at disse celler kan målrettes specifikt ved at tilpasse leveringsmetode26, formulering27eller narkotika-design28. Aktiveret professionel antigen-præsenterer celler kan overføre til en dræning lymfeknude og aktivere adaptive immunsystem29,30,31,32. Dendritiske celler er essentielle antigen præsentation celle-type til priming produktive cellulære immunrespons.
Denne undersøgelse dyr blev immuniseret med plasmid DNA kodning nucleoprotein af H1N1-influenza stamme A/PuertoRico/8. Huden levering af dette pDNA vaccine (pNP) i kombination med elektroporation havde vist sig at fremkalde antigen-specifikke humorale respons i marsvin33, fritter og ikke-menneskelige primater (primaterne)1,34. Derudover denne vaccine fremkaldte robust T-celle respons i mus efter levering i epidermis35, som kunne henføres til CD4 og CD8 T-celler ved at stimulere med peptider der repræsenterer specifikke epitoper for disse cellepopulationer. PNP vaccinen, var også immunogen efter slimhinde levering som det fremgår af generation af humorale respons i kaniner og marsvin samt cellulære og humorale respons i mus36. Senest har var vores gruppe stand til at påvise generation af IFN-γT-celle respons i kanin efter intramuskulaer levering (ikke-offentliggjorte data).
I øjeblikket, kan ikke de observerede Interferon-gamma steder i marsvin ELISpot tildeles til en CD4 + eller CD8 + T-celle delmængde. Især for design og udvikling af immun behandlingsformer rettet mod huden, ville det være meget nyttigt at afgøre hvorvidt observerede interferon-gamma enkeltfrekvenser er forårsaget af udvidelse af et særligt undersæt eller en afbalanceret reaktion af både for at evaluere effektiviteten af vaccination til at udløse cross-præsentation. Denne begrænsning kan overvindes ved negativ celle-sortering for CD4 og CD8 før såning celler på pladen eller ved identifikation af MHC klasse II (til CD4 svar) eller MHC klasse I (til CD8 svar) begrænset epitoper.
Her beskrives Interferon-gamma ELISpot analysen ved hjælp af marsvin PBMC omhandler behovet for at vurdere forløbet af cellulære svar i guinea gris laboratoriemodel. Dette vil forfine udvikling af vacciner og hud levering protokoller. Vi mener, at det giver mulighed for ansættelse af denne relevante dyremodel til at studere sygdomme med vigtige T-celle elementer såsom TB37, Ebola38, HSV39m.fl. Det vil reducere brugen af mindre relevante dyremodeller.
Disclosures
Forfatterne Katherine Schultheis, Holly M. Pugh, Bryan S. Yung, Janet Oh, Holly M. Pugh, Jacklyn Nguyen, Laurent Humeau, Kate E. Broderick og Trevor R.F. Smithare medarbejdere af Inovio lægemidler og som sådan får løn og fordele, herunder ejerskab af materiel og materiel indstilling, fra virksomheden.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke medlemmerne af Inovio Pharmaceuticals R & D afdeling for teknisk bistand og ansatte i Acculab for at levere topkvalitet dyrehold service. Vi vil navnlig gerne takke Alysha Vu og Joe Agnes til korrekturlæsning af håndskriftet. Dette arbejde blev ikke finansieret af nogen særlige tilskud fra finansielle organer i de offentlige, kommercielle eller ikke-for-profit sektorer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cellectra-3P | Inovio Pharmaceuticals | ID-Electroporatio device/ non-commercial, R&D-only | |
| K2EDTA blood collection tube | BD | 367844 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Gibco | 14175-079 | |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthacre | 17144003 | density gradient medium |
| SepMate tube | STEMCELL Technologies | 85415 | PBMC-isolation device |
| RPMI | Thermo Fisher | 11875-135 | |
| heat-deactivated FBS | VWR | 97068-085 | |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | |
| β-Mercaptoethanol | Gibco | 21985-023 | |
| 96-well ELISpot PVDF-membrane | Millipore | MSIPS4W10 | ELISpot assay plate |
| Ethanol | Sigma | 459844-1L | |
| UPDI | Invitrogen | 10977-015 | Ultra-Pure DI water |
| Sucrose | Sigma | S7903 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A7906 | |
| 10x PBS | HyClone | SH30378.03 | |
| Concanavalin A (ConA) | Sigma | C5275-5MG | |
| alkaline phosphatase (ALP)-conjugated streptavidin | R&D Systems Inc. | SEL002 | |
| BCIP/NBT | R&D Systems Inc. | SEL002 | |
| capture anti-guinea pig IFN-γ antibody V-E4 | GenScript | Order #:U5472CE080-3 | LOT # A217071153 |
| biotinylated detection anti-guinea pig IFN-γ antibody N-G3 | GenScript | Order #:U5472CE080-1 | LOT # A21700598 |
| CTL S6 Micro Analyzer | ImmunoSpot | #S6MIC12 | automated ELISpot plate reader |
| Vi-CELL XR | Beckman-Coulter | 731050 | automated cell counter |
| ImmunoSpot 5.1 | ImmunoSpot | assay analysis software | |
| ESCO Class II Type A2 | ESCO | Biosafety cabinet | |
| Falcon cell strainer | Corning, Inc. | VWR cat# 21008-952 | |
| Exel Comfort Point Insulin syringe | MedLab Supply | 26028 | |
| Rotanta 460R | Hettich | centrifuge | |
| Vi-CELL XR Quad Pak Reagent Kit | Beckman Coulter | 383722 | |
| Incu Safe | Panasonic-Healthcare | incubator | |
| 22 µm Filter | ThermoScientific | VWR act# 597-4520 | 22 µm Filter |
| KimWipes | Kimberly-Clark Professional | VWR cat# 21903-005 | paper towels |
References
- Laddy, D. J., et al. Heterosubtypic protection against pathogenic human and avian influenza viruses via in vivo electroporation of synthetic consensus DNA antigens. PloS One. 3 (6), 2517 (2008).
- Lee, J. Y., Chang, J. Recombinant baculovirus-based vaccine expressing M2 protein induces protective CD8+ T-cell immunity against respiratory syncytial virus infection. Journal of Microbiology. 55 (11), 900-908 (2017).
- Kinnear, E., et al. Airway T cells protect against RSV infection in the absence of antibody. Mucosal Immunology. , (2017).
- Sridhar, S., et al. Cellular immune correlates of protection against symptomatic pandemic influenza. Nature Medicine. 19 (10), 1305-1312 (2013).
- Brand, H. K., et al. CD4+ T-cell counts and interleukin-8 and CCL-5 plasma concentrations discriminate disease severity in children with RSV infection. Pediatric Research. 73 (2), 187-193 (2013).
- Bouvier, N. M. Animal models for influenza virus transmission studies: a historical perspective. Current Opinion in Virology. 13, 101-108 (2015).
- St Claire, M. C., Ragland, D. R., Bollinger, L., Jahrling, P. B.
- Todo, H. Transdermal Permeation of Drugs in Various Animal Species. Pharmaceutics. 9 (3), 33 (2017).
- Schafer, H., Burger, R. Tools for cellular immunology and vaccine research the in the guinea pig: monoclonal antibodies to cell surface antigens and cell lines. Vaccine. 30 (40), 5804-5811 (2012).
- Czerkinsky, C. C., Nilsson, L. A., Nygren, H., Ouchterlony, O., Tarkowski, A. A solid-phase enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay for enumeration of specific antibody-secreting cells. Journal of Immunological Methods. 65 (1-2), 109-121 (1983).
- Sedgwick, J. D., Holt, P. G. A solid-phase immunoenzymatic technique for the enumeration of specific antibody-secreting cells. Journal of Immunological Methods. 57 (1-3), 301-309 (1983).
- Moodie, Z., et al. Response definition criteria for ELISPOT assays revisited. Cancer Immunology, Immunotherapy. 59 (10), 1489-1501 (2010).
- Gillis, P. A., et al. Development of a novel, guinea pig-specific IFN-gamma ELISPOT assay and characterization of guinea pig cytomegalovirus GP83-specific cellular immune responses following immunization with a modified vaccinia virus Ankara (MVA)-vectored GP83 vaccine. Vaccine. 32 (31), 3963-3970 (2014).
- Schultheis, K., et al. Characterization of guinea pig T cell responses elicited after EP-assisted delivery of DNA vaccines to the skin. Vaccine. 35 (1), 61-70 (2017).
- Mantoux Tuberculin Skin Test DVD Facilitator Guide - CDC (Part One). , Available from: https://www.cdc.gov/tb/education/Mantoux/images/mantoux.pdf (2013).
- Birck, M. M., Tveden-Nyborg, P., Lindblad, M. M., Lykkesfeldt, J. Non-Terminal Blood Sampling Techniques in Guinea Pigs. Journal of Visualized Experiments. (92), e51982 (2014).
- Strober, W. Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability. Current Protocols in Immunology. 111, 1-3 (2014).
- Lewis, J. H. Comparative hematology: studies on guinea-pigs (Cavia porcellus). Comparative Biochemistry and Physiology: Comparative Physiology. 102 (3), 507-512 (1992).
- Flecknell, P. Laboratory Animal Anaesthesia (Fourth Edition). Flecknell, P. , Academic Press. 77-108 (2016).
- Schaefer, H., Kliem, G., Kropp, B., Burger, R. Monoclonal antibodies to guinea pig interferon-gamma: tools for cytokine detection and neutralization. Journal of Immunological Methods. 328 (1-2), 106-117 (2007).
- Lipiainen, T., et al. Formulation and stability of cytokine therapeutics. Journal of Pharmaceutical Sciences. 104 (2), 307-326 (2015).
- Wang, X. Z., et al. Virus-Specific CD8 T Cells in Peripheral Tissues Are More Resistant to Apoptosis Than Those in Lymphoid Organs. Immunity. 18 (5), 631-642 (2003).
- Veron, P., et al. Deep Sequencing of T Cell Receptor in Peripheral Blood and Muscle from Adeno-Associated Virus Vector-Injected Subjects Reveals Differences in T Cell Clonality Between the Two Compartments. Molecular Therapy. 23, 210 (2015).
- Sckisel, G. D., et al. Differential phenotypes of memory CD4 and CD8 T cells in the spleen and peripheral tissues following immunostimulatory therapy. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 5 (1), 33 (2017).
- Yanofsky, V. R., Mitsui, H., Felsen, D., Carucci, J. A. Understanding Dendritic Cells and Their Role in Cutaneous Carcinoma and Cancer Immunotherapy. Clinical and Developmental Immunology. 2013, 624123 (2013).
- Amante, D. H., et al. Direct Transfection of Dendritic Cells in the Epidermis After Plasmid Delivery Enhanced by Surface Electroporation. Human Gene Therapy Methods. 25 (6), 315-316 (2014).
- Mahe, B., et al. Nanoparticle-based targeting of vaccine compounds to skin antigen-presenting cells by hair follicles and their transport in mice. Journal of Investigative Dermatology. 129 (5), 1156-1164 (2009).
- Vandermeulen, G., et al. Skin-specific promoters for genetic immunisation by DNA electroporation. Vaccine. 27 (32), 4272-4277 (2009).
- Brave, A., Nystrom, S., Roos, A. K., Applequist, S. E. Plasmid DNA vaccination using skin electroporation promotes poly-functional CD4 T-cell responses. Immunology and Cell Biology. 89 (3), 492-496 (2011).
- Romani, N., et al. Targeting skin dendritic cells to improve intradermal vaccination. Current Topics in Microbiology and Immunology. 351, 113-138 (2012).
- Smith, T. R., et al. DNA vaccination strategy targets epidermal dendritic cells, initiating their migration and induction of a host immune response. Molecular Therapy Methods & Clinical Development. 1, 14054 (2014).
- Teunissen, M. B., Haniffa, M., Collin, M. P. Insight into the immunobiology of human skin and functional specialization of skin dendritic cell subsets to innovate intradermal vaccination design. Current Topics in Microbiology and Immunology. 351, 25-76 (2012).
- Lin, F., et al. A novel prototype device for electroporation-enhanced DNA vaccine delivery simultaneously to both skin and muscle. Vaccine. 29 (39), 6771-6780 (2011).
- Laddy, D. J., et al. Electroporation of synthetic DNA antigens offers protection in nonhuman primates challenged with highly pathogenic avian influenza virus. Journal of Virology. 83 (9), 4624-4630 (2009).
- Lin, F., et al. Optimization of Electroporation-Enhanced Intradermal Delivery of DNA Vaccine Using a Minimally Invasive Surface Device. Human Gene Therapy Methods. 23 (3), 157-168 (2012).
- Kichaev, G., et al. Electroporation mediated DNA vaccination directly to a mucosal surface results in improved immune responses. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 9 (10), 2041-2048 (2013).
- Klunner, T., Bartels, T., Vordermeier, M., Burger, R., Schafer, H. Immune reactions of CD4- and CD8-positive T cell subpopulations in spleen and lymph nodes of guinea pigs after vaccination with Bacillus Calmette Guerin. Vaccine. 19 (15-16), 1968-1977 (2001).
- Shedlock, D. J., et al. Induction of Broad Cytotoxic T Cells by Protective DNA Vaccination Against Marburg and Ebola. Molecular Therapy. 21 (7), 1432-1444 (2013).
- Hensel, M. T., et al. Prophylactic Herpes Simplex Virus 2 (HSV-2) Vaccines Adjuvanted with Stable Emulsion and Toll-Like Receptor 9 Agonist Induce a Robust HSV-2-Specific Cell-Mediated Immune Response, Protect against Symptomatic Disease, and Reduce the Latent Viral Reservoir. Journal of Virology. 91 (9), 02257 (2017).
