Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

टीकाकरण के बाद गिनी पिग मॉडल में टी सेल प्रतिक्रियाओं को मापने के लिए अनुकूलित इंटरफेरॉन-गामा ELISpot परख

Published: January 20, 2019 doi: 10.3791/58595
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Inovio Pharmaceuticals, Inc, 2Mycotic and Parasitic Agents and Mycobacteria, Robert Koch Institute

Summary

गिनी पिग PBMCs के लिए इंटरफेरॉन-गामा ELISpot परख के विकास के संक्रामक रोगों का अध्ययन करने के लिए इस बेहद प्रासंगिक मॉडल में टी-सेल प्रतिक्रियाओं के लक्षण वर्णन की अनुमति देता है । हम टी सेल डीएनए टीके के intradermal वितरण के साथ जुड़े प्रतिक्रियाओं को मापने के लिए परख लागू किया है ।

Abstract

गिनी पिग ऐसे तपेदिक, इंफ्लूएंजा, डिप्थीरिया, और वायरल रक्तस्रावी बुखार के रूप में संक्रामक रोगों के लिए टीके के विकास में एक प्रासंगिक छोटे जानवर मॉडल के रूप में एक निर्णायक भूमिका निभाई है । हम प्रदर्शन किया है कि प्लाज्मिड-डीएनए (pDNA) त्वचा में वैक्सीन वितरण गिनी पिग में मजबूत विनोदी प्रतिक्रियाएं बटोरता है । हालांकि, इस जानवर का उपयोग करने के लिए मॉडल प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को कुछ हद तक सीमित था के कारण उपलब्ध एजेंट और प्रोटोकॉल की कमी के लिए टी सेल प्रतिक्रियाओं का अध्ययन । टी कोशिकाओं immunoprophylactic और immunotherapeutic दोनों तंत्र में एक निर्णायक भूमिका निभाते हैं । टी सेल प्रतिक्रियाओं को समझना संक्रामक रोग और कैंसर विज्ञान टीकों के विकास के लिए महत्वपूर्ण है और वितरण उपकरणों मिलनसार । यहां हम गिनी पिग परिधीय रक्त ELISpot कोशिकाओं (mononuclear) के लिए एक इंटरफेरॉन-गामा (IFN-γ) एंजाइम से जुड़े immunospot (PBMCs) परख का वर्णन करते हैं । परख इस महत्वपूर्ण कुतर मॉडल में वैक्सीन-विशिष्ट टी-सेल प्रतिक्रियाओं की विशेषता के लिए शोधकर्ताओं को सक्षम बनाता है । परख परिधीय रक्त से अलग कोशिकाओं को करने की क्षमता को व्यक्तिगत पशुओं में immunogenicity ट्रैक अवसर प्रदान करता है ।

Introduction

प्रोटोकॉल यहां वर्णित इंटरफेरॉन-गामा (IFN-γ) का पता लगाने परमिट एक परिधीय रक्त mononuclear कोशिका (PBMC) Hartley गिनी सूअरों से काटा गया antigen याद करने के बाद कोशिकाओं स्रावित । हम परख के लिए आवेदन किया है कैनेटीक्स और प्रतिजन के परिमाण-विशिष्ट टी सेल प्रतिक्रियाओं के लिए एक इंफ्लूएंजा टीकाकरण गिनी पिग में आहार । हमारा मानना है कि इस प्रोटोकॉल काफी इस उच्च प्रासंगिक पशु मॉडल में टीकाकरण कार्यक्रमों के पूर्व नैदानिक विकास प्रेरित करेंगे ।

टी टीके द्वारा बटोरी गई कोशिकाओं संक्रामक एजेंटों और immunotherapeutic अंय रोगों के साथ जुड़े रास्ते के खिलाफ संरक्षण में एक आवश्यक भूमिका निभाते हैं । टी कोशिकाओं के महत्व को कई वैक्सीन अध्ययन में डाला गया है । एक प्लाज्मिड डीएनए के साथ ferrets और चूहों का प्रतिरक्षण (pDNA) H5 hemagglutinin और N1 neuraminidase के लिए एंकोडिंग एक इंफ्लूएंजा वायरस चुनौती में रुग्णता और मृत्यु से एंटीबॉडी बेअसर के अभाव में सुरक्षा प्रदान की, के महत्व का संकेत टी सेल उन्मुक्ति1. मजबूत विनोदी प्रतिक्रिया को बेअसर करने के अलावा, टी कोशिकाओं न केवल वायरल मंजूरी2 के लिए एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, लेकिन यह भी चूहों में श्वसन syncytial वायरस (RSV) के साथ संक्रमण से सुरक्षा3. मनुष्यों में, पूर्व मौजूदा सीडी 8 + टी कोशिकाओं २००९4में H1N1 महामारी के दौरान कम रोग गंभीरता के साथ जुड़े थे । CD4 + टी कोशिका एक साथ कुछ cytokine प्लाज्मा एकाग्रता के साथ गिना जाता है RSV-संक्रमित बच्चों में रोग गंभीरता के साथ संबंधित हैं5.

गिनी पिग इस तरह के त्वचा संवेदीकरण के रूप में चिकित्सा के विभिंन क्षेत्रों में अनुसंधान और विकास के लिए एक प्रयोगशाला मॉडल के रूप में प्रसिद्धि प्राप्त की है, पोषण अनुसंधान, श्रवण प्रणाली के अध्ययन और, इस काम के लिए सबसे अधिक प्रासंगिक, संक्रामक रोगों । यह तपेदिक और डिप्थीरिया के खिलाफ टीके की खोज के लिए महत्वपूर्ण था । हाल ही में गिनी पिग इंफ्लूएंजा6 और Ebola7के लिए एक मॉडल के रूप में प्रयोग किया जाता है । इसके अलावा, मानव त्वचा के लिए शारीरिक समानताएं रखने8, गिनी पिग चमड़े की दवा वितरण विधियों के लिए एक सुलभ छोटे जानवर मॉडल प्रदान करता है । एक प्रयोगशाला मॉडल के रूप में अपने महत्व के विपरीत, गिनी पिग विशिष्ट परख और जांच की उपलब्धता के लिए प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं विशेषताएं9सीमित रहता है । ऐसे IFN के रूप में बुनियादी सेलुलर परख-γ एंजाइम से जुड़े immunospot (ELISpot-परख) है कि नियमित रूप से पूर्व में प्रयोग किया जाता है नैदानिक और नैदानिक अनुसंधान टी सेल प्रतिक्रियाओं की गणना करने के लिए उपलब्ध नहीं किया गया है ।

पहली ठोस चरण एंजाइम से जुड़े immunospot परख के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी की संख्या में एक विविध बी सेल में गुप्त कोशिकाओं-जनसंख्या10,11निर्धारित किया गया । प्रारूप साइटोकिंस के आईएल-1, आईएल-2, आईएल-4, आईएल-5, आईएल-6, आईएल-10, जीएम-सीएसएफ, TNF-अल्फा, TNF-बीटा, granzyme बी, और IFN-γ सहित स्रावित कोशिकाओं का पता लगाने के लिए उन्नत किया है । ELISpot परख उच्च संवेदनशीलता के पास; संभावित रूप से प्रत्येक cytokine-उत्पादक सेल का पता लगाया जा सकता है । ELISpot परख के लिए पता लगाने की सीमा १००,००० PBMCs12प्रति 10 स्थानों से कम होना बताया गया है । हाल ही में एक गिनी-पिग IFN-γ विशिष्ट एंटीबॉडी जोड़ी13उपलब्ध कराया गया था, और इस क्षेत्र में इस कमी को हल करने का अवसर खुल गया है ।

IFN-γ अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में एक महत्वपूर्ण प्रभाव अणु माना जाता है; यह उत्पादन किया जा सकता है और सक्रियण पर दोनों CD4 और सीडी 8 टी कोशिकाओं द्वारा स्रावित । IFN-γ एक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के संदर्भ में जैविक कार्यों की एक विस्तृत श्रृंखला है एक वायरस संक्रमण के लिए, मैक्रोफेज के सक्रियकरण और प्रमुख histocompatibility परिसर (MHC) मैं और MHCII अभिव्यक्ति के ऊपर विनियमन के रूप में । यह भी बी सेल भेदभाव को बढ़ावा देता है, टी सहायक-2 सेल विकास को रोकता है, और प्राकृतिक हत्यारा कोशिकाओं को सक्रिय करता है । IFN-γ ब्लॉक संक्रमित दैहिक कोशिकाओं में वायरल प्रतिकृति और MHC अणुओं की अभिव्यक्ति को नियंत्रित करता है । इस प्रकार, IFN-γ का उत्पादन एक टीका या रोगज़नक़ के लिए टी सेल प्रतिक्रिया की गुणवत्ता का एक बहुत ही महत्वपूर्ण संकेत है ।

यहाँ प्रस्तुत IFN का एक महत्वपूर्ण पहलू है-γ ELISpot१३splenocytes के बजाए PBMCs का प्रयोग है. PBMCs एक गैर टर्मिनल एकत्र रक्त नमूना प्रसंस्करण द्वारा प्राप्त किया जा सकता है, जबकि splenocytes के संग्रह तिल्ली की कटाई से पहले पशु euthanization की आवश्यकता है । PBMCs का उपयोग सक्षम बनाता है IFN-γ टी-सेल प्रतिक्रियाओं के समय की अवधि पर नजर रखने के लिए और प्रधानमंत्री के रूप में टी-सेल प्रतिक्रियाओं पर प्रभाव का मूल्यांकन-बढ़ावा14.

शोधकर्ताओं जो वर्तमान में एक पशु मॉडल के रूप में गिनी पिग का उपयोग कर रहे है के लिए, IFN-γ ELISpot विधि वैज्ञानिक डेटा वे प्राप्त कर सकते है की सीमा को व्यापक होगा । इसकी उपलब्धता अब लक्ष्य रोग है, जो पहले सेलुलर प्रतिक्रियाओं की परीक्षा के लिए एजेंट की उपलब्धता के कारण चुना गया के लिए कम प्रासंगिक पशु मॉडलों के साथ अध्ययन करने की आवश्यकता को कम कर सकते हैं । तिल्ली या लिम्फ नोड्स के बजाय PBMCs का उपयोग गैर टर्मिनल प्रयोगों और व्यक्तिगत जानवरों की सतत निगरानी के लिए अनुमति देता है ।

नीचे हम एक IFN का पता लगाने में शामिल कदम का एक विस्तृत विवरण प्रदान-गिनी सूअर में γ सेलुलर प्रतिक्रिया pDNA वैक्सीन के लिए । हम अपने विशिष्ट वितरण प्रक्रिया रूपरेखा और सामांय ELISpot परख शामिल रक्त नमूना, रक्त प्रसंस्करण, PBMC फसल, परख प्रक्रिया, और डेटा विश्लेषण । ELISpot परख के एक योजनाबद्ध चित्र 1में दर्शाया गया है ।

Figure 1
चित्रा 1 : गिनी पिग ELISpot प्रोटोकॉल का योजनाबद्ध अवलोकन । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Protocol

यहां बताए गए सभी तरीकों को Acculab की एनिमल केयर एंड फीमेल कमेटी (ACUC) ने मंजूरी दे दी है ।

नोट: प्रोटोकॉल संभावित खतरनाक सामग्री के उपयोग की आवश्यकता है । कृपया निर्माता के MSDS को देखें और प्रक्रिया के दौरान उचित व्यक्तिगत उपकरण (पीपीई) पहनें ।

1. गिनी-पिग प्रतिरक्षण स्थल, intradermal Mantoux-इंजेक्शन और CELLECTRA-3P-EP-प्रक्रिया की तैयारी

  1. गिनी पिग पर उपचार स्थल की तैयारी ।
    1. एक प्रेरण कक्ष में गिनी पिग प्लेस और 5% Isoflurane-वाष्प पर anaesthetize ।
    2. स्थिति में कक्ष और जगह नाक शंकु से पशु निकालें, 2% Isoflurane भाप प्रदान करने के लिए प्रक्रिया भर में संज्ञाहरण बनाए रखने के लिए ।
    3. पेट के पार्श्व पर लगभग 4 सेमी2 की दाढ़ी क्षेत्र ।
    4. इथेनॉल-झाड़ू के साथ संक्रमित मुंडा क्षेत्र.
  2. pDNA के इंजेक्शन-तैयार करने और electroporation प्रक्रिया ।
    1. Mantoux तकनीक द्वारा dermis में १०० µ एल तैयार करने के लिए एक इंसुलिन-सिरिंज का प्रयोग करें । सुई बेवल डाला है जानवर के शरीर के साथ एक 10 डिग्री के कोण पर ।
    2. सुई निकालें और तुरंत CELLECTRA ®-3P इलेक्ट्रोड सरणी इंजेक्शन-wheal भर में डालें और बिजली के क्षेत्र लागू होते हैं ।
    3. संज्ञाहरण से पशु निकालें और इसकी वसूली की निगरानी ।

2. गैर टर्मिनल भरो

  1. anaesthetized गिनी पिग की jugular नस से रक्त संग्रह ।
    1. एक प्रेरण कक्ष में गिनी पिग प्लेस और anaesthetize पशु के रूप में 1.1.1 में वर्णित
    2. एक 27G 1/2inch सुई के साथ एक 3 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग करना, anaesthetized जानवर की jugular नस में विराम और रक्त के 3 मिलीलीटर इकट्ठा ।
    3. तुरंत K2EDTA रक्त संग्रह ट्यूब, पलटन ट्यूब में रक्त विरोधी कौयगुलांट और बर्फ पर जगह के साथ रक्त मिश्रण करने के लिए कई बार स्थानांतरण ।
      नोट: रक्त के थक्के से बचाव के सफल बहाव के प्रसंस्करण के लिए रक्त के नमूने के लिए महत्वपूर्ण है ।
    4. पशुओं की वसूली पर नजर रखें ।

3. रक्त नमूना प्रसंस्करण

  1. घनत्व-ढाल केंद्रापसारक द्वारा पूरे रक्त से PBMCs की जुदाई
    1. है हांक संतुलित नमक समाधान (HBSS) के साथ रक्त 1:1 पतला ।
      नोट: संदूषण से बचने के लिए यहां से सभी काम पर एक अपूतित तकनीक लागू करने के लिए एक सुरक्षा के मंत्रिमंडल में किया जाना चाहिए ।
    2. एक 15 मिलीलीटर-शंकु ट्यूब में ४.५ मिलीलीटर Ficoll-Paque प्लस से अधिक धीरे खून पतला परत । इंटरफेस की अशांति से बचें । नोट: उचित जुदाई सुनिश्चित करने के लिए, Ficoll-Paque कमरे के तापमान पर होना चाहिए ।
    3. बंद के साथ 30 मिनट के लिए ८०० आरसीएफ पर ट्यूब केंद्रापसारक ।
      नोट: एक विकल्प के रूप में, SepMate ™ ट्यूबों (STEMCELL टेक्नोलॉजीज) PBMC-जुदाई के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । HBSS-पतला रक्त ३.५ मिलीलीटर Ficoll-Paque प्लस से भरा 15 मिलीलीटर SepMate ट्यूब में जोड़ा जाता है और फिर 10 मिनट के लिए १२०० आरसीएफ में केंद्रापसारक (पर ब्रेक) । इस समय समान व्यवहार्यता में ढाल केंद्रापसारक तकनीक परिणाम की बचत, कोशिका उपज और जगह-गठन ।
    4. हार्वेस्ट Buffy-कोट परत और R10 मध्यम में पतला (10% (v/v) ताप-निष्क्रिय FBS और 1% (v/v) पेन/Strep में RPMI1640 मीडियम) की कुल मात्रा को 15 मि.
    5. 5 मिनट के लिए ४५० आरसीएफ पर केंद्रापसारक द्वारा गोली कोशिकाओं ।
    6. R10 माध्यम से दो बार कोशिकाओं को धो लें ।
    7. 1 मिलीलीटर R10 और पास सेल-निलंबन के माध्यम से ७० µm सेल-एक नई ट्यूब में छलनी में कोशिकाओं को फिर से निलंबित ।
    8. कोशिकाओं गिनती और Trypan द्वारा जीवित कोशिकाओं की संख्या निर्धारित-ब्लू धुंधला ।
    9. R10 माध्यम के साथ कोशिकाओं को पतला 1x10 की एकाग्रता के लिए ^ 6 जी कोशिकाओं प्रति मिलीलीटर ।

4. ELISpot-प्लेट्स और सेल-उत्तेजना की तैयारी

  1. कोट और एक ९६ के ब्लॉक कुओं-अच्छी तरह से ELISpot PVDF-झिल्ली प्लेट PBMCs बोने से पहले ।
    1. प्लेटें ६० सेकंड के लिए पूर्व इलाज किया जाना चाहिए । इथेनॉल पूर्व उपचार कम विशिष्ट स्थान-गठन और बेहतर परिभाषा के साथ स्पॉट में परिणाम होगा ।
      नोट: अतिरिक्त ध्यान रखना सुनिश्चित करने के लिए पूरा झिल्ली 15 µ एल ३५% इथेनॉल के साथ संपर्क में आता है ।
    2. ६० सेकंड के बाद अच्छी तरह से प्रति १५० µ एल 1x पंजाबियों जोड़ने के लिए, और फिर प्लेटों औंधा द्वारा कुओं को खाली ।
      नोट: इथेनॉल पूर्व उपचार बहुत समय के प्रति संवेदनशील है । अच्छी तरह से-झिल्ली नहीं गर्मी ६० sec. झिल्ली की प्रक्रिया के बाद निंनलिखित चरणों के दौरान बाहर शुष्क नहीं होना चाहिए ।
    3. धो प्लेटें अच्छी तरह से प्रति २५० µ एल 1x पंजाबियों के साथ तीन बार ।
    4. कोट के साथ १०० µ l/5 µ g/एमएल के अच्छी तरह से कब्जा विरोधी गिनी पिग IFN-γ एंटीबॉडी वी-E4 में पंजाबियों.
    5. 4 डिग्री सेल्सियस से कम 12 बजे के लिए मशीन प्लेटें
    6. २५० µ l/अच्छी तरह से पंजाब तीन बार जोड़कर प्लेटें धो लें ।
    7. जोड़ें २०० µ एल/अच्छी तरह से अवरुद्ध बफर (10% (डब्ल्यू/वी) सुक्रोज और 2% (डब्ल्यू/वी) BSA में) और कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए मशीन ।
    8. २५० µ एल के साथ प्लेटें धो/
  2. प्लेट PBMCs antigen-विशिष्ट पेप्टाइड्स, सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण के साथ ।
    1. R10 में प्रोटीन पेप्टाइड पूल वांछित अंतिम पेप्टाइड एकाग्रता को पतला ।
    2. परख triplicates में नमूना PBMCs ।
      नोट: पहले ELISpot प्लेटों के लिए उत्तेजक के साथ मध्यम जोड़ें और PBMC निलंबन दूसरा जोड़ें ।
    3. संकेत कुओं के लिए पेप्टाइड-R10 माध्यम के ५० µ एल जोड़ें ।
    4. नकारात्मक नियंत्रण के लिए जोड़ें ५० µ एल R10 में खाली पेप्टाइड निर्माण संकेत कुओं में ।
    5. सकारात्मक नियंत्रण के लिए संकेत कुओं में R10 माध्यम में 5 µ जी/एमएल Concanavalin ए (ConA) जोड़ें ।
    6. PBMC सेल के १०० µ l को जोड़ें-सभी कुओं को सस्पेंशन
    7. 18 घंटे के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर humidified 5% सीओ 2 वायुमंडल में मशीन प्लेट ।
      नोट: एक भी सतह पर प्लेस ELISpot प्लेटें/मशीन में रैक और मशीन समय के दौरान प्लेटों के किसी भी अशांति से बचें ।

5. इंटरफेरॉन-गामा सकारात्मक धब्बे का पता लगाने

  1. पता लगाने एंटीबॉडी और थाली विकास के साथ मशीन ।
    नोट: इस खंड में सभी चरणों के लिए कोई अपूतित तकनीक की आवश्यकता है ।
    1. ध्यान से मशीन से प्लेटें हटाने, और सुरक्षित रूप से खाली कुओं । तीन बार के लिए २५० µ एल/अच्छी तरह से पंजाबियों जोड़कर प्लेटें धो लें ।
    2. जोड़ें १०० µ एल के/अच्छी तरह से 2 µ जी/एमएल biotinylated डिटेक्शन विरोधी गिनी पिग IFN-γ एंटीबॉडी एन G3 अवरुद्ध बफर में पतला ।
      नोट: पृष्ठभूमि को कम करने के लिए फ़िल्टर (22 µm) एंटीबॉडी समाधान ।
    3. कमरे के तापमान पर 2 बजे के लिए पता लगाने एंटीबॉडी के साथ मशीन ।
    4. supernatant को छोड़ दें और २५० µ l/अच्छी तरह से पंजाब तीन बार जोड़कर प्लेटें धो लें ।
    5. जोड़ें १०० µ एल/अच्छी तरह से alkaline फॉस्फेट (ALP)-संयुग्मित streptavidin बफर अवरुद्ध में पतला ।
      नोट: पृष्ठभूमि को कम करने के लिए फ़िल्टर (22 µm) समाधान.
    6. कमरे के तापमान पर 1 hr के लिए ALP-Streptavidin संयुग्मी के साथ मशीन ।
    7. ALP-Streptavidin समाधान छोड़ें और प्लेटों को जोड़कर धो लें २५० µ l/खैर पंजाब दो बार, और प्लेट को पलटने से अतिरिक्त पंजाबियों को हटाने और एक साफ कागज तौलिया के खिलाफ सोख्ता ।
    8. २५० µ को जोड़कर प्लेटें धोएं l/अच्छी तरह से UltraPure DI पानी एक बार, और प्लेट को पलटने से अतिरिक्त पानी निकालें और इसे एक साफ कागज तौलिया के खिलाफ सोख्ता ।
    9. Add १०० µ l of BCIP/एनबीटी (सावधानी) सब्सट्रेट समाधान में एक अच्छी तरह से. चेतावनी: BCIP/एनबीटी अत्यधिक ज्वलनशील और विषाक्त अगर निगल लिया, त्वचा के साथ संपर्क में है, या साँस । उपयोग करने से पहले MSDS को देखें ।
    10. प्रकाश से सुरक्षित कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए मशीन ।
    11. थाली कुल्ला पानी के साथ 4 बार । प्लेट पलटना और अतिरिक्त पानी को हटाने के लिए टैप करें ।
    12. ELISpot प्लेटों के नीचे से प्लास्टिक की निकासी निकालें और प्लेटें सूखी अनुमति देते हैं ।
    13. धब्बों को मैंयुअल रूप से या एक स्वचालित ELISpot रीडर का उपयोग करके, उदाहरण के लिए CTL-Immunospot S6 प्लेट रीडर ।

Representative Results

यहां प्रस्तुत परिणामों की उंमीद परिणामों के लिए एक संदर्भ के रूप में इस प्रोटोकॉल के उपयोग के बाद सेवा, महत्वपूर्ण कदम के महत्व पर बल और वर्णित अनुकूलन के लाभों की पुष्टि ।

के बाद घनत्व-ढाल केंद्रापसारक, प्रोटोकॉल के चरण ३.१ में वर्णित के रूप में, ट्यूब के तल पर लाल चिपचिपा तरल लाल रक्त कोशिकाओं के सबसे अधिक हो जाएगा । जैसा चित्र 2एमें दिखाया गया है, लाल रक्त कोशिकाओं के ऊपर घनत्व-मध्यम की एक परत है । शीर्ष पर स्पष्ट या पीले प्लाज्मा की एक परत और घनत्व ढाल माध्यम के बीच सफेद या हल्के भूरे रंग के buffy कोट परत है, जो सफेद रक्त कोशिकाओं और प्लेटलेटों की सबसे शामिल है । अपूर्ण जुदाई घनत्व के शीर्ष पर लाल रक्त कोशिकाओं की उपस्थिति-ढाल माध्यम के रूप में प्रकट होता है । चित्रा 2एक में प्लाज्मा के लाल रंगाई सबसे शायद hemolysis के कारण है, के रूप में इस रक्त का नमूना संग्रह ट्यूब १.५ एच में संग्रहीत किया गया था पहले संसाधित किया जा रहा है । चित्रा 2 बी से पहले ढाल दिखाता है (बाएं) और के बाद (दाएं) PBMC-अलगाव डिवाइस में केंद्रापसारक । चित्रा 2बी में रक्त का नमूना रक्त संग्रह के बाद न्यूनतम देरी के साथ संसाधित किया गया था, और प्लाज्मा रंगाई पीला है.

इथेनॉल के साथ झिल्ली को पूर्व गीला करने का प्रभाव (प्रोटोकॉल के चरण ४.१ देखें) मौके पर विकास चित्रा 3में दिखाया गया है । पूर्व उपचारित कुओं में धब्बे बेहतर परिभाषा प्रदर्शित करते हैं, और मध्यम/DMSO नकारात्मक नियंत्रण वेल्स (चित्रा 3ए) में धब्बों की संख्या में कमी है । प्रसंस्कृत गिनी पिग PBMCs की विशिष्ट व्यवहार्यता ९०% के आसपास पर्वतमाला और दोनों नियमित रूप से 15 मिलीलीटर ट्यूबों और PBMC-अलगाव उपकरणों (चित्रा 3बी) के लिए समान है । एक 3 मिलीलीटर रक्त के नमूने से व्यवहार्य कोशिकाओं की उपज आमतौर पर 3 x 106 और 5 x 106के बीच पर्वतमाला ।

पशु प्लाज्मिड डीएनए के साथ प्रतिरक्षित थे nucleoprotein (NP) H1N1 इंफ्लूएंजा तनाव ए/PuertoRico8 के । चित्रा 4 टी-सेल IFN की गणना दिखाता है-γ एक टीकाकरण आहार की अवधि के पार उत्पंन स्थान बनाने इकाइयों (SFU) के रूप में प्रस्तुत प्रतिक्रियाओं । गैर प्रतिरक्षित पशुओं से काटा PBMCs के साथ ELISpot परख नगण्य स्थान गिनती (कोई tx) में परिणाम है । प्रथम प्रतिरक्षण (प्राइम) के चौदह दिन बाद, औसतन ९७० IFN-γ धब्बे प्रति लाख PBMCs immunogenic उत्तेजना के बाद गिने जाते थे. सात दिन द्वितीय प्रतिरक्षण (बूस्ट) के बाद, सभी तीन पूल के विरुद्ध टी-सेल प्रतिक्रियाओं का विस्तार किया गया, ५०२० IFN-γ SFUs/106 PBMCs के एक औसत तक पहुंचने के ४६ दिन बाद द्वितीय प्रतिरक्षण (मेमोरी) के औसत कुल ६३१० IFN-γ SFUs 10/ 6 PBMCs परिधीय रक्त में गिने जाते थे ।

चित्र लेजेंड:

Figure 2
चित्रा 2 : घनत्व के बाद परतों के प्रतिनिधि छवियां-ढाल केंद्रापसारक । (एक) रक्त के नमूने से पहले (बाएं) और के बाद (सही) नियमित ट्यूबों में केंद्रापसारक । (ख) रक्त के नमूने से पहले (बाएं) और बाद (दाएं) PBMC-अलगाव उपकरणों में केंद्रापसारक । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3 : प्रोटोकॉल का अनुकूलन । (एक) IFN की विशिष्ट उपस्थिति-एक ELISpot परख प्लेट में γ सकारात्मक धब्बे अच्छी तरह से प्रोटोकॉल के अनुसार विकसित की है । उदाहरण तपसिल कुओं के बाद इथेनॉल के साथ पूर्व उपचार (सही) या पूर्व उपचार के बिना (बाएं) दिखाया जाता है । कक्ष या तो DMSO (ऊपर) के साथ कोई उत्तेजना नियंत्रण, प्रतिजन मिलान पेप्टाइड्स (मध्य), या mitogen ConA (नीचे) के रूप में रात भर की मशीन थे । PBMCs एक ही व्यक्ति जानवर से उत्पंन । वेल्स एक स्वचालित प्लेट-स्कैनर का उपयोग कर छवि थे । (ख) प्रसंस्कृत कोशिकाओं पर विभिन्न घनत्व-ढाल ट्यूबों की तुलना. 3 व्यक्तिगत गिनी सूअरों से रक्त के नमूनों की 3 मिलीलीटर एकत्र किए गए । प्रत्येक नमूने के १.५ मिलीलीटर या तो नियमित ट्यूबों (घनत्व ढाल माध्यम) या PBMC-अलगाव उपकरणों का उपयोग कर संसाधित किया गया । व्यवहार्यता (छोड़ दिया,% ± sem) और जीवित कोशिकाओं की संख्या (ठीक है, x 106 ± SEM) एक स्वचालित सेल गिनती प्रणाली और trypan-नीले अपवर्जन परख का उपयोग कर निर्धारित किया गया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 : एक टीकाकरण आहार के पाठ्यक्रम पर मजबूत सेलुलर प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं का पता लगाने । दिनों पर 1 और 15, pDNA एंकोडिंग इंफ्लूएंजा के 30 µ जी एक nucleoprotein (एनपी) दिया था इंट्रा-चमड़े का Hartley गिनी सूअरों के पेट के पार्श्व में तुरंत त्वचा के बाद electroporation । IFN-γ ELISpot रिस्पांस पहले प्रतिरक्षण (प्रधानमंत्री) के 14 दिनों के बाद मापा गया था, और दूसरे प्रतिरक्षण के बाद 7 दिन (बूस्ट) और ४६ दिन (मेमोरी). मतलब SFUs + SEM 5 इलाज गिनी सूअर और 2 अनुपचारित गिनी सूअर (कोई tx) के लिए साजिश रची गई । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Discussion

गिनी पिग टीके और intradermal वितरण रणनीतियों के पूर्व नैदानिक विकास के लिए एक मूल्यवान पशु मॉडल है । उपर्युक्त प्रोटोकॉल पद्धति का वर्णन antigen-विशिष्ट टी सेल प्रतिक्रियाओं को मापने के लिए इस बेहद प्रासंगिक मॉडल में । परख परिधीय टी के एक स्पष्ट गणन-antigen-विशिष्ट पेप्टाइड्स के साथ उत्तेजना पर इंटरफेरॉन-गामा कोशिकाओं का उत्पादन प्रदान करता है । इम्यून रिस्पांस के कैनेटीक्स से नॉन-टर्मिनल ब्लड सैंपलिंग पर नजर रखी जा सकती है ।

हम प्रोटोकॉल अनुकूलित और महत्वपूर्ण पहलुओं की पहचान के लिए इस परख का उपयोग कर इष्टतम परिणाम प्राप्त करते हैं । उदाहरण के लिए, संग्रह ट्यूब में रक्त के थक्के के गठन के लिए इष्टतम PBMC वसूली और व्यवहार्यता में परिणाम होगा । गिनी पिग रक्त के थक्के बहुत तेजी से18। यह रक्त जल्दी आकर्षित प्रदर्शन करने के लिए महत्वपूर्ण है । Au-Birck एट अल । गिनी-पिग मॉडल16में खून बह रहा तकनीक के लिए एक व्यापक गाइड प्रदान करें । चूंकि रक्त संग्रह सामान्य संज्ञाहरण की आवश्यकता है, यह प्रक्रिया19के इस पहलू के लागू मानक संचालन प्रक्रियाओं की समीक्षा करने के लिए सिफारिश की है. अपर्याप्त anaesthetized गिनी सूअरों अपने पैर या वोकलिज़ेशन अपने नाखूनों के साथ अपने पैर की उंगलियों के बीच ऊतक की एक संक्षिप्त चुटकी के बाद या उनके कान बच निकलने और उनके कान चुटकी के बाद आगे अपनी मूंछ चलती द्वारा प्रतिक्रिया होगी । थक्कारोधी के साथ एक ट्यूब में रक्त के तत्काल हस्तांतरण और रोलिंग या ट्यूब कई बार पलटने से अच्छी तरह से मिश्रण इस प्रोटोकॉल में एक आवश्यक कदम है । के लिए यहां वर्णित प्रोटोकॉल EDTA-ट्यूबों का इस्तेमाल किया गया है, और कोई अंय anticoagulants परीक्षण किया गया । कृपया ध्यान दें कि EDTA hypertonic है, ट्यूबों आदर्श आधे से अधिक भरा होना चाहिए, और इसलिए नमूना मात्रा के लिए उपयुक्त ट्यूब आकार का इस्तेमाल किया जाना चाहिए ।

जब सही ढंग से प्रदर्शन किया, घनत्व ढाल केंद्रापसारक लगातार साफ PBMC तैयारी में परिणाम । घनत्व ढाल मध्यम कमरे के तापमान पर होना चाहिए जब केंद्रापसारक से पहले ढाल layering, और ब्रेक जब नियमित ट्यूबों का उपयोग कर रहे है रोकने के लिए इस्तेमाल नहीं किया जाना चाहिए । PBMC-प्रोसेसिंग की व्यावहारिकता के मामले में एक महत्वपूर्ण सुधार PBMC-अलगाव उपकरणों के साथ घनत्व ढाल केंद्रापसारक के संयोजन था । यह केंद्रापसारक समय में कमी के लिए अनुमति देता है । PBMC में घनत्व ढाल केंद्रापसारक-अलगाव उपकरणों और नियमित रूप से ट्यूबों समान व्यवहार्यता में परिणाम, प्रसंस्कृत PBMCs के लाइव सेल मायने रखता है, और स्थान गठन । अलग के लिए इस्तेमाल किया ट्यूब के प्रकार से स्वतंत्र, buffy कोट फसल तुरंत का पालन करना चाहिए । घनत्व ढाल माध्यम के साथ समय की एक विस्तारित अवधि से अधिक संपर्क PBMCs को साइटोटोक्सिक है ।

व्यवहार्य PBMCs की सटीक गिनती परख-प्लेट कुओं में लगातार कोशिकाओं के बराबर संख्या बीज के लिए महत्वपूर्ण है । जीवित/मृत भेदभाव की कुछ विधि लागू की जानी चाहिए । हमारी प्रयोगशाला में, हम trypan-नीले अपवर्जन परख और एक स्वचालित सेल-काउंटर का उपयोग करें ।

स्पॉट गुणवत्ता, तेज धार और उच्च विषम धब्बे के रूप में परिभाषित, बेहतर सटीकता और सुसंगत जगह गिनती में परिणाम होगा, विशेष रूप से जब एक स्वचालित गिनती प्रणाली का उपयोग कर । निर्माता की सिफारिशों के साथ लाइन में, हम इथेनॉल पूर्व ELISpot प्लेटों के उपचार के लिए एक महत्वपूर्ण पृष्ठभूमि स्थानों की संख्या को कम करने और स्पॉट की परिभाषा में सुधार कदम हो मनाया । एक प्लेट रीडर के उपयोग के लिए छवि ELISpot परख प्रोटोकॉल के अंत में प्लेटें अत्यधिक की सिफारिश की है । प्रत्येक अच्छी तरह से मूल छवियों को आसानी से और कुशलता से प्राप्त की और संग्रहीत किया जा सकता है । एक छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर डिजिटल छवियों का उपयोग भी उद्देश्य विश्लेषण और स्थान की गिनती के लिए अनुमति मैनुअल व्यक्तिगत ऑपरेटरों द्वारा गिनती की तुलना में ।

परख के विकास के लिए एक परम आवश्यकता यहां वर्णित एक उपयुक्त विरोधी गिनी पिग इंटरफेरॉन-गामा एंटीबॉडी जोड़ी की पीढ़ी थी । माउस मोनोक्लोनल एंटीबॉडी वी E4 और एन G3 hybridoma-तकनीक द्वारा बी के साथ विकसित किए गए थे-सेल क्लोन चूहों से जो रिकॉमबिनेंट गिनी-पिग इंटरफेरॉन गामा20के साथ प्रतिरक्षित थे । वी-E4, जो IgG1 isotype है, और N-G3, जो IgG2a है, दोनों को रिकॉमबिनेंट और नेटिव antigen से बाइंड करने की सूचना है । एंटीबॉडी और biotinylated N-G3 के रूप में पता लगाने के रूप में V E4 निर्दिष्ट एंटीबॉडी दोनों रिकॉमबिनेंट और देशी प्रोटीन के लिए उच्च संवेदनशीलता के परिणामस्वरूप, जबकि एक सैंडविच-एलिसा प्रारूप में कम पृष्ठभूमि संकेत को बनाए रखना । दोनों एंटीबॉडी एक विनिर्माण समझौते के माध्यम से वैज्ञानिक समुदाय के लिए उपलब्ध है डॉ Hubert शेफ़र, जो इस प्रकाशन के सह लेखक है की प्रयोगशाला के नेतृत्व में । अनुरोध Dr. शेफ़र लैब द्वारा प्राप्त किया जाएगा और फिर एक वाणिज्यिक भागीदार द्वारा निर्मित ।

इंटरफेरॉन-गामा नियमित बफ़र्स या मीडिया21में अस्थिर होने की सूचना है । शेफ़र एट अल.20 केवल वसूली की दर के एक उदारवादी कमी की रिपोर्ट जब नीचा IFN-y, जो जैविक कार्यक्षमता खो दिया था का उपयोग कर एक एलिसा प्रारूप में एंटीबॉडी वी-E4 और एन G3 का उपयोग कर । हालांकि, 18 ज पर PBMCs के पेप्टाइड उत्तेजना की गर्मी समय बढ़ाने सावधानी से परीक्षण किया जाना चाहिए ।

PBMCs का उपयोग करने के फायदों पर चर्चा की गई है । हालांकि, यहां वर्णित परख केवल प्रतिजन-परिधि में टी कोशिकाओं घूम के विशिष्ट प्रतिक्रियाओं को दर्शाता है । ऊतक घुसपैठ टी-कोशिकाओं या लसीका अंगों से पृथक कोशिकाओं, तिल्ली और लिम्फ नोड्स के रूप में, विभिन्न गुण प्रदर्शित कर सकते हैं22,23,24. सेलुलर प्रतिक्रियाओं में कोई महत्वपूर्ण अंतर इंटरफेरॉन की तुलना पर मनाया गया-PBMCs और गिनी सूअरों से splenocytes से गामा धब्बे है कि एक ही pNP इंफ्लूएंजा वैक्सीन14के साथ प्रतिरक्षित थे ।

इस प्रोटोकॉल में, हम एक intradermal टीकाकरण प्रक्रिया का वर्णन किया । आईडी प्रतिरक्षण के लिए एक प्रमुख औचित्य त्वचा25में मौजूद वृक्ष कोशिकाओं के उच्च घनत्व को लक्षित कर रहा है । हम और दूसरों को पता चला है कि इन कोशिकाओं को विशेष रूप से अनुकूल वितरण द्वारा लक्षित किया जा सकता है-विधि26, तैयार27, या ड्रग डिजाइन28। सक्रिय व्यावसायिक प्रतिजन-पेश कोशिकाओं एक draining लिम्फ नोड के लिए स्थानांतरित कर सकते हैं और अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली को सक्रिय29,30,31,३२. वृक्ष कोशिकाओं आवश्यक प्रतिजन प्रस्तुति सेल-उत्पादक सेलुलर प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं भड़काने के लिए प्रकार हैं ।

इस अध्ययन के लिए पशुओं प्लाज्मिड डीएनए के साथ प्रतिरक्षित थे इंफ्लूएंजा H1N1 तनाव एक/PuertoRico के nucleoprotein एंकोडिंग/ electroporation के साथ संयोजन में इस pDNA टीका (pNP) की त्वचा की डिलीवरी प्रतिजन-गिनी सूअरों में विशिष्ट विनोदी प्रतिक्रियाओं३३, ferrets, और गैर मानव रहनुमाओं (NHPs)1,३४में लाना दिखाया गया था । इसके अतिरिक्त, इस टीके एपिडर्मिस३५, जो इन सेल के लिए विशिष्ट epitopes का प्रतिनिधित्व पेप्टाइड्स के साथ उत्तेजक द्वारा CD4 और सीडी 8 टी कोशिकाओं के लिए जिंमेदार ठहराया जा सकता है में प्रसव के बाद चूहों में मजबूत टी-सेल प्रतिक्रियाओं में पाया-आबादी । pNP वैक्सीन भी श्लैष्मिक प्रसव के बाद immunogenic था खरगोशों और गिनी सूअरों में विनोदी प्रतिक्रियाओं की पीढ़ी द्वारा प्रदर्शन के रूप में, साथ ही साथ सेलुलर और हास्य प्रतिक्रियाओं में चूहों३६। हाल ही में, हमारे समूह IFN-γT-सेल प्रतिक्रियाओं के अंतर-पेशी डिलीवरी (अप्रकाशित डेटा) के बाद खरगोश में प्रदर्शन करने में सक्षम था ।

वर्तमान में, गिनी पिग ELISpot में मनाया इंटरफेरॉन-गामा स्पॉट एक CD4 + या सीडी 8 + टी सेल सबसेट के लिए आवंटित नहीं किया जा सकता है । विशेष रूप से डिजाइन और प्रतिरक्षा उपचार त्वचा को लक्षित करने के विकास के लिए, यह बहुत उपयोगी होगा निर्धारित करने के लिए कि क्या इंटरफेरॉन-गामा स्थान आवृत्तियों एक विशेष सबसेट के विस्तार या दोनों के क्रम में एक संतुलित प्रतिक्रिया के कारण होते हैं क्रॉस-प्रेजेंटेशन को ट्रिगर करने के लिए टीकाकरण की प्रभावशीलता का मूल्यांकन करें । इस सीमा को CD4 या प्लेट पर कोशिकाओं को बोने से पहले या MHC वर्ग द्वितीय (CD4 प्रतिक्रियाओं के लिए) या MHC वर्ग मैं (सीडी 8 प्रतिक्रियाओं के लिए) प्रतिबंधित epitopes की पहचान के द्वारा सीडी 8 के लिए नकारात्मक कोशिका छंटाई से दूर किया जा सकता है ।

यहां वर्णित इंटरफेरॉन-गामा ELISpot परख गिनी पिग PBMCs का उपयोग करने के लिए गिनी पिग प्रयोगशाला मॉडल में सेलुलर प्रतिक्रियाओं के पाठ्यक्रम का आकलन करने की आवश्यकता पते । यह टीकों और त्वचा वितरण प्रोटोकॉल के विकास को परिष्कृत करेगा । हमें विश्वास है कि यह इस तरह के टीबी३७, Ebola३८, एचएसवी३९, और दूसरों के रूप में महत्वपूर्ण टी सेल घटकों के साथ रोगों का अध्ययन करने के लिए इस प्रासंगिक पशु मॉडल के रोजगार के लिए अनुमति देता है । यह कम प्रासंगिक पशु मॉडल का उपयोग कम हो जाएगा ।

Disclosures

लेखक कैथरीन Schultheis, होली एम Pugh, ब्रायन एस युंग, जेनेट ओह, होली एम. Pugh, Jacklyn गुयेन, लौरेंत Humeau, केट ई. Broderick, और ट्रेवर R.F. Smithare और Inovio फार्मास्यूटिकल्स के कर्मचारियों के रूप में ऐसे वेतन और लाभ प्राप्त करने के स्वामित्व सहित, स्टॉक और स्टॉक विकल्प, कंपनी से ।

Acknowledgments

हम उत्कृष्टता पशुपालन सेवा प्रदान करने के लिए Acculab की तकनीकी सहायता और स्टाफ के लिए Inovio फार्मास्यूटिकल्स आर & डी विभाग के सदस्यों को धन्यवाद देना चाहूंगा । विशेष रूप से हम पांडुलिपि को ठीक करने के लिए Alysha नजरों से देख और जो एग्नेस शुक्रिया अदा करना चाहूंगा । यह काम वित्त पोषण एजेंसियों से किसी भी विशिष्ट अनुदान द्वारा वित्त पोषित नहीं था सार्वजनिक, वाणिज्यिक, या नहीं के लिए लाभ क्षेत्रों ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cellectra-3P Inovio Pharmaceuticals ID-Electroporatio device/ non-commercial, R&D-only
K2EDTA blood collection tube BD 367844
Hank’s Balanced Salt Solution Gibco  14175-079
Ficoll-Paque Plus GE Healthacre  17144003 density gradient medium
SepMate tube STEMCELL Technologies 85415 PBMC-isolation device
RPMI  Thermo Fisher 11875-135
heat-deactivated FBS  VWR 97068-085
Pen/Strep  Gibco  15140-122
 β-Mercaptoethanol Gibco  21985-023
96-well ELISpot PVDF-membrane  Millipore MSIPS4W10 ELISpot assay plate
Ethanol  Sigma 459844-1L
UPDI Invitrogen 10977-015 Ultra-Pure DI water
Sucrose  Sigma S7903
Bovine Serum Albumin Sigma A7906
10x PBS HyClone SH30378.03
Concanavalin A (ConA)  Sigma C5275-5MG
alkaline phosphatase (ALP)-conjugated streptavidin  R&D Systems Inc.  SEL002
BCIP/NBT  R&D Systems Inc.  SEL002
capture anti-guinea pig IFN-γ antibody V-E4 GenScript Order #:U5472CE080-3 LOT # A217071153
biotinylated detection anti-guinea pig IFN-γ antibody N-G3  GenScript Order #:U5472CE080-1 LOT # A21700598
CTL S6 Micro Analyzer ImmunoSpot #S6MIC12 automated ELISpot plate reader
Vi-CELL XR Beckman-Coulter 731050 automated cell counter
ImmunoSpot 5.1 ImmunoSpot assay analysis software
ESCO Class II Type A2 ESCO Biosafety cabinet
Falcon cell strainer Corning, Inc. VWR cat# 21008-952
Exel Comfort Point Insulin syringe MedLab Supply  26028
Rotanta 460R Hettich centrifuge
Vi-CELL XR Quad Pak Reagent Kit Beckman Coulter 383722
Incu Safe Panasonic-Healthcare incubator
22 µm Filter ThermoScientific  VWR act# 597-4520 22 µm Filter
KimWipes Kimberly-Clark Professional  VWR cat# 21903-005  paper towels

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Laddy, D. J., et al. Heterosubtypic protection against pathogenic human and avian influenza viruses via in vivo electroporation of synthetic consensus DNA antigens. PloS One. 3 (6), 2517 (2008).
  2. Lee, J. Y., Chang, J. Recombinant baculovirus-based vaccine expressing M2 protein induces protective CD8+ T-cell immunity against respiratory syncytial virus infection. Journal of Microbiology. 55 (11), 900-908 (2017).
  3. Kinnear, E., et al. Airway T cells protect against RSV infection in the absence of antibody. Mucosal Immunology. , (2017).
  4. Sridhar, S., et al. Cellular immune correlates of protection against symptomatic pandemic influenza. Nature Medicine. 19 (10), 1305-1312 (2013).
  5. Brand, H. K., et al. CD4+ T-cell counts and interleukin-8 and CCL-5 plasma concentrations discriminate disease severity in children with RSV infection. Pediatric Research. 73 (2), 187-193 (2013).
  6. Bouvier, N. M. Animal models for influenza virus transmission studies: a historical perspective. Current Opinion in Virology. 13, 101-108 (2015).
  7. St Claire, M. C., Ragland, D. R., Bollinger, L., Jahrling, P. B. Animal Models of Ebolavirus Infection. Comparative Medicine. 67 (3), 253-262 (2017).
  8. Todo, H. Transdermal Permeation of Drugs in Various Animal Species. Pharmaceutics. 9 (3), 33 (2017).
  9. Schafer, H., Burger, R. Tools for cellular immunology and vaccine research the in the guinea pig: monoclonal antibodies to cell surface antigens and cell lines. Vaccine. 30 (40), 5804-5811 (2012).
  10. Czerkinsky, C. C., Nilsson, L. A., Nygren, H., Ouchterlony, O., Tarkowski, A. A solid-phase enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay for enumeration of specific antibody-secreting cells. Journal of Immunological Methods. 65 (1-2), 109-121 (1983).
  11. Sedgwick, J. D., Holt, P. G. A solid-phase immunoenzymatic technique for the enumeration of specific antibody-secreting cells. Journal of Immunological Methods. 57 (1-3), 301-309 (1983).
  12. Moodie, Z., et al. Response definition criteria for ELISPOT assays revisited. Cancer Immunology, Immunotherapy. 59 (10), 1489-1501 (2010).
  13. Gillis, P. A., et al. Development of a novel, guinea pig-specific IFN-gamma ELISPOT assay and characterization of guinea pig cytomegalovirus GP83-specific cellular immune responses following immunization with a modified vaccinia virus Ankara (MVA)-vectored GP83 vaccine. Vaccine. 32 (31), 3963-3970 (2014).
  14. Schultheis, K., et al. Characterization of guinea pig T cell responses elicited after EP-assisted delivery of DNA vaccines to the skin. Vaccine. 35 (1), 61-70 (2017).
  15. Mantoux Tuberculin Skin Test DVD Facilitator Guide - CDC (Part One). , Available from: https://www.cdc.gov/tb/education/Mantoux/images/mantoux.pdf (2013).
  16. Birck, M. M., Tveden-Nyborg, P., Lindblad, M. M., Lykkesfeldt, J. Non-Terminal Blood Sampling Techniques in Guinea Pigs. Journal of Visualized Experiments. (92), e51982 (2014).
  17. Strober, W. Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability. Current Protocols in Immunology. 111, 1-3 (2014).
  18. Lewis, J. H. Comparative hematology: studies on guinea-pigs (Cavia porcellus). Comparative Biochemistry and Physiology: Comparative Physiology. 102 (3), 507-512 (1992).
  19. Flecknell, P. Laboratory Animal Anaesthesia (Fourth Edition). Flecknell, P. , Academic Press. 77-108 (2016).
  20. Schaefer, H., Kliem, G., Kropp, B., Burger, R. Monoclonal antibodies to guinea pig interferon-gamma: tools for cytokine detection and neutralization. Journal of Immunological Methods. 328 (1-2), 106-117 (2007).
  21. Lipiainen, T., et al. Formulation and stability of cytokine therapeutics. Journal of Pharmaceutical Sciences. 104 (2), 307-326 (2015).
  22. Wang, X. Z., et al. Virus-Specific CD8 T Cells in Peripheral Tissues Are More Resistant to Apoptosis Than Those in Lymphoid Organs. Immunity. 18 (5), 631-642 (2003).
  23. Veron, P., et al. Deep Sequencing of T Cell Receptor in Peripheral Blood and Muscle from Adeno-Associated Virus Vector-Injected Subjects Reveals Differences in T Cell Clonality Between the Two Compartments. Molecular Therapy. 23, 210 (2015).
  24. Sckisel, G. D., et al. Differential phenotypes of memory CD4 and CD8 T cells in the spleen and peripheral tissues following immunostimulatory therapy. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 5 (1), 33 (2017).
  25. Yanofsky, V. R., Mitsui, H., Felsen, D., Carucci, J. A. Understanding Dendritic Cells and Their Role in Cutaneous Carcinoma and Cancer Immunotherapy. Clinical and Developmental Immunology. 2013, 624123 (2013).
  26. Amante, D. H., et al. Direct Transfection of Dendritic Cells in the Epidermis After Plasmid Delivery Enhanced by Surface Electroporation. Human Gene Therapy Methods. 25 (6), 315-316 (2014).
  27. Mahe, B., et al. Nanoparticle-based targeting of vaccine compounds to skin antigen-presenting cells by hair follicles and their transport in mice. Journal of Investigative Dermatology. 129 (5), 1156-1164 (2009).
  28. Vandermeulen, G., et al. Skin-specific promoters for genetic immunisation by DNA electroporation. Vaccine. 27 (32), 4272-4277 (2009).
  29. Brave, A., Nystrom, S., Roos, A. K., Applequist, S. E. Plasmid DNA vaccination using skin electroporation promotes poly-functional CD4 T-cell responses. Immunology and Cell Biology. 89 (3), 492-496 (2011).
  30. Romani, N., et al. Targeting skin dendritic cells to improve intradermal vaccination. Current Topics in Microbiology and Immunology. 351, 113-138 (2012).
  31. Smith, T. R., et al. DNA vaccination strategy targets epidermal dendritic cells, initiating their migration and induction of a host immune response. Molecular Therapy Methods & Clinical Development. 1, 14054 (2014).
  32. Teunissen, M. B., Haniffa, M., Collin, M. P. Insight into the immunobiology of human skin and functional specialization of skin dendritic cell subsets to innovate intradermal vaccination design. Current Topics in Microbiology and Immunology. 351, 25-76 (2012).
  33. Lin, F., et al. A novel prototype device for electroporation-enhanced DNA vaccine delivery simultaneously to both skin and muscle. Vaccine. 29 (39), 6771-6780 (2011).
  34. Laddy, D. J., et al. Electroporation of synthetic DNA antigens offers protection in nonhuman primates challenged with highly pathogenic avian influenza virus. Journal of Virology. 83 (9), 4624-4630 (2009).
  35. Lin, F., et al. Optimization of Electroporation-Enhanced Intradermal Delivery of DNA Vaccine Using a Minimally Invasive Surface Device. Human Gene Therapy Methods. 23 (3), 157-168 (2012).
  36. Kichaev, G., et al. Electroporation mediated DNA vaccination directly to a mucosal surface results in improved immune responses. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 9 (10), 2041-2048 (2013).
  37. Klunner, T., Bartels, T., Vordermeier, M., Burger, R., Schafer, H. Immune reactions of CD4- and CD8-positive T cell subpopulations in spleen and lymph nodes of guinea pigs after vaccination with Bacillus Calmette Guerin. Vaccine. 19 (15-16), 1968-1977 (2001).
  38. Shedlock, D. J., et al. Induction of Broad Cytotoxic T Cells by Protective DNA Vaccination Against Marburg and Ebola. Molecular Therapy. 21 (7), 1432-1444 (2013).
  39. Hensel, M. T., et al. Prophylactic Herpes Simplex Virus 2 (HSV-2) Vaccines Adjuvanted with Stable Emulsion and Toll-Like Receptor 9 Agonist Induce a Robust HSV-2-Specific Cell-Mediated Immune Response, Protect against Symptomatic Disease, and Reduce the Latent Viral Reservoir. Journal of Virology. 91 (9), 02257 (2017).

Tags

इम्यूनोलॉजी और संक्रमण मुद्दा १४३ एंजाइम से जुड़े प्रतिरक्षा स्थल परख गिनी सूअर टी लिम्फोसाइटों टीकाकरण इंटरफेरॉन-गामा प्रशासन त्वचा के नीचे
टीकाकरण के बाद गिनी पिग मॉडल में टी सेल प्रतिक्रियाओं को मापने के लिए अनुकूलित इंटरफेरॉन-गामा ELISpot परख
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Schultheis, K., Schaefer, H., Pugh,… More

Schultheis, K., Schaefer, H., Pugh, H. M., Yung, B. S., Oh, J., Nguyen, J., Humeau, L., Broderick, K. E., Smith, T. R. F. Optimized Interferon-gamma ELISpot Assay to Measure T Cell Responses in the Guinea Pig Model after Vaccination. J. Vis. Exp. (143), e58595, doi:10.3791/58595 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter