Summary
De ontwikkeling van de interferon-gamma ELISpot assay voor cavia PBMCs kunt de karakterisatie van T-cel reacties in dit zeer relevant model voor het bestuderen van besmettelijke ziekten. Wij hebben de test voor het meten van de T cel reacties gekoppeld intradermale levering van vaccin dat DNA toegepast.
Abstract
De cavia heeft een centrale rol als een relevante kleine diermodel gespeeld in de ontwikkeling van vaccins voor besmettelijke ziekten zoals tuberculose, griep, difterie en virale hemorragische koortsen. We hebben aangetoond dat plasmide-DNA (pDNA) vaccin levering in de huid robuuste humorale reacties in de cavia lokt. Het gebruik van dit dier te model immuunresponsen was echter enigszins aan banden gelegd in het verleden als gevolg van het gebrek aan beschikbare reagentia en protocollen bij het bestuderen van de T cel reacties. T-cellen spelen een centrale rol in zowel immunoprophylactic als immunotherapeutische mechanismen. Inzicht in reacties van T cellen is cruciaal voor de ontwikkeling van besmettelijke ziekten en oncologie vaccins en opvang levering apparaten. Hier beschrijven we een interferon-gamma (IFN-γ) enzyme-linked immunospot (ELISpot) assay voor cavia perifere bloed mononucleaire cellen (PBMCs). De bepaling kan onderzoekers te karakteriseren vaccin-specifieke T-cel reacties in dit belangrijke knaagdier model. De mogelijkheid om te assay geïsoleerd uit het perifere bloed cellen biedt de mogelijkheid om spoor van de immunogeniciteit in individuele dieren.
Introduction
Het protocol hier beschreven staat de detectie van interferon-gamma (IFN-γ) dat cellen na antigeen in een perifere bloed mononucleaire cellen (PBMC) bevolking geoogst van Hartley cavia's recall. Wij hebben de assay karakteriseren de kinetiek en groottes van antigeen-specifieke T cel reacties op een Influenza Vaccinatie-regime in de cavia toegepast. Wij geloven dat dit protocol zal de pre-klinische ontwikkeling van vaccinatie-programma's in deze zeer relevant diermodel aanzienlijk voortbewegen.
Ontlokte door vaccins T-cellen spelen een essentiële rol in de bescherming tegen infectieuze agentia en immunotherapeutische trajecten die zijn gekoppeld aan andere ziekten. Het belang van T-cellen heeft in meerdere vaccin onderzoeken naar voren. Immunisatie van fretten en muizen met een plasmide DNA (pDNA) codering voor H5 hemagglutinine en neuraminidase geboden bescherming van N1 van morbiditeit en mortaliteit in een influenza virus uitdaging in de afwezigheid van neutraliserende antilichamen, het belang van T-cel-immuniteit1. Naast sterke neutraliseren humorale respons, T-cellen een cruciale rol voor niet alleen een virale klaring2 , maar ook een bescherming tegen infecties met respiratoir syncytieel virus (RSV) in muizen3. Bij de mens werden bestaande CD8 + T cellen geassocieerd met verminderde ziekte ernst tijdens de H1N1 pandemie in 20094. CD4 + T cel aantallen samen met bepaalde cytokine plasma concentratie zijn gecorreleerd met de ernst van de ziekte in RSV-geïnfecteerde kinderen5.
De cavia heeft kreeg bekendheid als een laboratoriummodel voor onderzoek en ontwikkeling in de verschillende gebieden van de geneeskunde zoals overgevoeligheid van de huid, nutritionele onderzoek, studies van het auditieve systeem en, meest relevant voor dit werk, infectieziekten. Het was cruciaal voor de ontdekking van vaccins tegen tuberculose en difterie. Meer recentelijk wordt de cavia gebruikt als een model voor Influenza6 en Ebola7. Daarnaast biedt bezitten fysiologische gelijkenissen met menselijke huid8, de cavia een toegankelijk kleine diermodel voor methoden voor het afleveren van dermale drug. In tegenstelling tot het belang ervan als een laboratoriummodel blijft de beschikbaarheid van specifieke tests cavia en sondes te karakteriseren immuunresponsen beperkt9. Basis cellulaire assays zoals de IFN-γ enzyme-linked immunospot (ELISpot-assay) die routinematig in pre-klinisch en klinisch onderzoek gebruikt is bij het inventariseren van de T cel reacties zijn niet beschikbaar.
De eerste solid-phase enzyme-linked immunospot assays werden gebruikt om te bepalen van het aantal specifieke antilichaam-afscheidende cellen in een diverse B-cel-bevolking10,11. De indeling heeft gevorderd om op te sporen cellen afscheidende cytokines met inbegrip van IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, GM-CSF, TNF-alpha, TNF-bèta, granzyme B en IFN-γ. De bepaling van de ELISpot bezit hoge gevoeligheid; potentieel kan elke cytokine-producerende cel worden gedetecteerd. De limiet van detectie voor ELISpot testen is lager dan 10 plaatsen per 100.000 PBMCs12gemeld. Onlangs leverde een cavia IFN-γ specifiek antilichaam paar beschikbaar13, en dit heeft opengesteld de gelegenheid om te spreken van deze leemte in het veld.
IFN-γ wordt beschouwd als een belangrijke effector molecuul in de aanpassings immune reactie; het kan worden geproduceerd en uitgescheiden door CD4 zowel CD8 T cellen na activatie. IFN-γ heeft een breed scala aan biologische functies in het kader van een immune reactie op een virusinfectie, zoals de activering van de macrofagen en de up regulering van grote histocompatibility complex (MHC) ik en MHCII expressie. Ook bevordert B-cel differentiatie, remt de groei van T-helper-2 cel en natural killer cellen activeert. IFN-γ blokken virale replicatie in geïnfecteerde somatische cellen en upregulates uitdrukking van MHC moleculen. Dus, de productie van IFN-γ is een zeer belangrijke indicatie van de kwaliteit van de T-cel-reactie op een vaccin of pathogeen.
Een belangrijk aspect van de hier gepresenteerde IFN-γ ELISpot is het gebruik van PBMCs in plaats van splenocytes13. PBMCs kunnen worden verkregen door de verwerking van een niet-eindstandige verzamelde bloedmonster, de collectie van splenocytes overwegende dat dierlijke euthanization vóór het oogsten van de milt. Het gebruik van PBMCs kunt IFN-γ T-cel reacties op worden gecontroleerd gedurende een periode van tijd en evaluatie van de effecten op de T-cel-reacties zoals prime-boost regimes14.
Voor onderzoekers die momenteel gebruik van de cavia als een dierlijk model maken, zal de IFN-γ ELISpot-methode verruimen de wetenschappelijke gegevens die ze kunnen krijgen. De beschikbaarheid kan nu verminderen de noodzaak om studies met minder relevante dierlijke modellen voor de doel-ziekte, die eerder werden gekozen vanwege de beschikbaarheid van het reagens voor onderzoek van cellulaire reacties te verrichten. Het gebruik van PBMCs plaats milt of lymfklieren zorgt voor niet-eindstandige experimenten en continue monitoring van individuele dieren.
Hieronder geven wij een gedetailleerde beschrijving van de stappen betrokken bij het opsporen van een IFN-γ cellulaire reactie op cavia's pDNA vaccin. We schetsen van onze specifieke levering procedure en beschrijven de algemene bepaling van de ELISpot omvat bloedmonsters, bloed verwerking PBMC oogst, assay procedure en data-analyse. Een schematische voorstelling van de ELISpot-bepaling is afgebeeld in Figuur 1.
Figuur 1 : Schematisch overzicht van de cavia ELISpot protocol. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Protocol
Alle methoden die hier worden beschreven zijn goedgekeurd door de Animal Care en gebruik Comité (ACUC) van Acculab.
Opmerking: Het protocol vereist het gebruik van potentieel gevaarlijke stoffen. Gelieve te verwijzen naar de fabrikant MSDS en dragen van de juiste persoonlijke apparatuur (PPE) tijdens de gehele procedure.
1. bereiding van de cavia immunisatie site, intradermale Mantoux-injectie en CELLECTRA-3P-EP-procedure
-
Bereiding van de plaats van de behandeling op de cavia.
- Plaats van de cavia in een inductie kamer en anaesthetize op 5% Isofluraan-damp.
- Dier uit de zaal verwijderen en plaatsen van neus in positie, verstrekken van 2% Isofluraan damp te handhaven verdoving tijdens de gehele procedure.
- Gebied van ongeveer 4 cm2 op abdominale flank te scheren.
- Desinfecteer geschoren gebied met Ethanol-doekje.
-
Injectie van pDNA-formulering en electroporation procedure.
- Gebruik een insuline-injectiespuit te injecteren 100 µl formulering in de dermis door de Mantoux-techniek. Naald is ingebracht schuine omhoog in een hoek van 10 graden met het lichaam van het dier.
- Verwijderen van de naald en onmiddellijk de CELLECTRA® - 3 P-elektrodenserie invoegen in de injectie-wheal en toepassen van elektrische veld.
- Dier uit narcose verwijderen en controleren van zijn herstel.
2. niet-terminal bleed
-
De collectie van het bloed van de halsslagader van verdoofde cavia.
- Plaats cavia in de kamer van een inductie en anaesthetize dier zoals beschreven in 1.1.1
- Met een 3 ml injectiespuit met een naald 27G 1/2 inch, accentueren de halsslagader van het verdoofde dier en 3 ml bloed te verzamelen.
- Onmiddellijk overdracht bloed in K2EDTA bloed collectie buis, buis meerdere malen omkeren te mengen van bloed met anti-coagulans en plaats op het ijs.
Opmerking: Vermijden van bloedstolling is cruciaal voor succesvolle downstream processing van het bloedmonster. - Controleren van dier herstel.
3. bloed monster verwerking
-
Scheiding van PBMCs volbloed door dichtheid-verloop centrifugeren
- Verdun bloed 1:1 met Henks evenwichtig zout oplossing (HBSS).
Opmerking: Om te voorkomen dat besmetting alle werk vanaf hier op moeten worden uitgevoerd in een kast van de bioveiligheid aseptische techniek toe te passen. - Laag verdund bloed geleidelijk over 4.5 ml densiteitgradiënt-Paque Plus in een 15 ml-conische buis. Het voorkomen van verstoring van de interface. Opmerking: Om te zorgen voor een goede scheiding, densiteitgradiënt-Paque moet bij kamertemperatuur.
- Centrifugeer buizen op 800 rcf voor 30 min met rem af.
Opmerking: als alternatief, SepMate™ buizen (STEMCELL Technologies) kan worden gebruikt voor PBMC-scheiding. HBSS verdunde bloed wordt toegevoegd aan SepMate tube van 15 ml gevuld met 3,5 ml densiteitgradiënt-Paque Plus en vervolgens gecentrifugeerd bij 1200 rcf voor 10 min (rem op). Deze tijdbesparende kleurovergang centrifugeren techniek resulteert in gelijke levensvatbaarheid, cel-opbrengst en plek-vorming. - Oogst Buffy-jas laag en Verdun in R10 medium (10% (v/v) warmte-deactivated FBS en 1% (v/v) Pen/Strep in RPMI1640 medium) tot een totaal volume van 15 ml.
- Pellet cellen door centrifugeren op 450 rcf gedurende 5 minuten.
- Wassen cellen tweemaal met R10 medium.
- Resuspendeer de cellen in 1 ml R10 en celsuspensie door 70 µm cel-zeef in doorgeven aan een nieuwe buis.
- Cellen tellen en aantal levende cellen bepaald door Trypan-blauw kleuring.
- Vul cellen met R10 medium tot een concentratie van 1 x 10 ^ 6 levende cellen per ml.
- Verdun bloed 1:1 met Henks evenwichtig zout oplossing (HBSS).
4. voorbereiding van de ELISpot-platen en cel-stimulatie
-
Vacht en blok wells van een 96-Wells ELISpot PVDF-membraan plaat vóór het zaaien de PBMCs.
- Platen moeten worden vooraf behandeld gedurende 60 seconden. Ethanol voorbehandeling zal leiden tot minder aspecifieke plek-vorming en spots met verbeterde definitie.
Opmerking: Neem extra zorg aan de volledige membraan komt in aanraking met 15 µl 35% Ethanol. - Na zestig seconden toevoegen 150 µl 1 x PBS per well, en maak vervolgens leeg uit putten door het omkeren van de platen.
Opmerking: De voorbehandeling van Ethanol is zeer tijd-gevoelige. Niet Incubeer het goed-membraan langer dan 60 sec. membranen niet tijdens de volgende stappen van de procedure uitdrogen moet. - Spoel de platen driemaal met PBS van de 1 x 250 µl per putje.
- Jas met 100 µl per putje van 5 µg/ml vangen anti-cavia IFN-γ antilichaam V-E4 in PBS.
- Incubeer de platen voor ten minste 12 uur bij 4° C.
- Spoel de platen door toevoeging van 250 µl per putje PBS driemaal.
- Voeg 200 µl per putje buffer met blokkerend (10% (m/v) Sucrose en 2% (g/v) BSA in PBS) en incubeer gedurende 2 uur bij kamertemperatuur.
- Spoel de platen met 250 µl per putje PBS driemaal.
- Platen moeten worden vooraf behandeld gedurende 60 seconden. Ethanol voorbehandeling zal leiden tot minder aspecifieke plek-vorming en spots met verbeterde definitie.
-
Plaat PBMCs met antigeen-specifieke peptiden, positieve en negatieve controles.
- Verdun eiwit-peptide zwembad in R10 tot concentratie van de gewenste uiteindelijke peptide.
- Assay het monster PBMCs in triplicates.
Opmerking: Medium met stimulerende middelen aan de ELISpot platen eerst toevoegt en de schorsing PBMC tweede. - Breng 50 µl van peptide-R10 medium in aangegeven putjes.
- Voor de negatieve controle toevoegen 50 µl lege peptide formulering in R10 in aangegeven wells.
- Voor positieve controle toevoegen 5 µg/ml Concanavalin A (ConA) in R10 medium in aangegeven wells.
- Voeg 100 µl celsuspensie van PBMC toe aan alle putjes
- Incubeer de platen in bevochtigde 5% CO2 atmosfeer bij 37° Celsius voor 18 uur.
Opmerking: Plaats ELISpot platen op een zelfs oppervlak/rek in de incubator en voorkomen van verstoringen van de platen tijdens de incubatietijd.
5. detectie van Interferon-gamma positieve plekken
-
Incubatie met antilichaam en plaat ontwikkeling detectie.
Opmerking: Voor alle stappen in dit gedeelte geen aseptische techniek is vereist.- Verwijder voorzichtig platen van incubator en veilig legen wells. Spoel de platen door 250 µl per putje PBS voor drie keer toe te voegen.
- Voeg 100 µl per putje van 2 µg/ml biotinyleerd anti-cavia IFN-γ detectieantilichaam N-G3 verdund in blokkeerbuffer.
Opmerking: Filter (22 µm) antilichaam oplossing voor het verminderen van de achtergrond. - Incubeer met detectieantilichaam voor 2 uur bij kamertemperatuur.
- Gooi supernatant en wassen platen door toevoeging van 250 µl per putje PBS driemaal.
- Voeg 100 µl per putje van alkalische fosfatase (ALP)-geconjugeerd daar verdund in blokkeerbuffer.
Opmerking: Filter (22 µm) oplossing voor het verminderen van de achtergrond. - Incubeer met ALP-daar conjugaat gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
- ALP-daar oplossing negeren en spoel de platen door toevoeging van 250 µl per putje PBS twee keer, en verwijderen van overtollige PBS door de plaat omkeren en het bevlekken tegen een schone papieren handdoek.
- Spoel de platen door toevoeging van 250 µl per putje UltraPure DI water een keer, en Verwijder overtollig water door de plaat omkeren en het bevlekken tegen een schone papieren handdoek.
- Voeg 100 µl van BVIE/NBT (voorzichtig) substraat oplossing in elk putje. Let op: BVIE/NBT is zeer brandbaar en giftig als, in contact with skin inslikken, of ingeademd. Raadpleeg de MSDS voor gebruik.
- Incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur beschermd tegen licht.
- Spoel de plaat 4 keer met gedeïoniseerd water. Plaat omkeren en tik om te verwijderen overtollige water.
- Verwijderen van kunststof drainage vanaf onderkant van ELISpot platen en laat de platen te drogen.
- Kwantificeren vlekken handmatig of met behulp van een geautomatiseerde ELISpot lezer, bijvoorbeeld de CTL-Immunospot S6-afleesapparaat.
Representative Results
De resultaten die hier gepresenteerd dienen als leidraad voor de verwachte resultaten na het gebruik van dit protocol, wijzend op het belang van cruciale stappen en een bevestiging van de voordelen van beschreven optimalisaties.
Na het centrifugeren van de dichtheid-verloop, zoals beschreven in stap 3.1 van het protocol, zal de rode viskeuze vloeistof aan de onderkant van de buis bevatten de meeste van de rode bloedcellen. Zoals afgebeeld in Figuur 2isA, boven de rode bloedcellen een laag van de dichtheid-medium. Tussen een laag van duidelijk of gele plasma bovenop en de dichtheid is kleurovergang medium de witte of lichte bruine buffy coat laag, waarin de meeste witte bloedcellen en bloedplaatjes. Onvolledige scheiding zou manifesteren als de aanwezigheid van rode bloedcellen bovenop de medium dichtheid-verloop. De rode kleur van het plasma in Figuur 2 is waarschijnlijk te wijten aan hemolyse, zoals dit bloedmonster was opgeslagen in de collectie buis 1,5 h voordat deze wordt verwerkt. Figuur 2 B toont het verloop voor (links) en na (rechts) centrifugeren in PBMC-isolatie apparaat. Bloedmonster in Figuur 2B was verwerkt met minimale vertraging na de bloedinzameling, en de plasma-kleur is geel.
Het effect van het vooraf bevochtigen de membranen met ethanol (zie stap 4.1 van het protocol) op plek-ontwikkeling is afgebeeld in Figuur 3. Vlekken in vooraf behandelde wells verbeterde definitie display, en er is een vermindering van het aantal plekken in medium/DMSO negatieve controleputjes (Figuur 3A). Typische levensvatbaarheid van verwerkte cavia PBMCs varieert ongeveer 90% en is identiek voor zowel reguliere 15 mL tubes en PBMC-isolatie apparaten (Figuur 3B). Rendement van levensvatbare cellen van een bloedmonster 3 mL varieert meestal tussen de 3 x 106 en 5 x 10,6.
Dieren werden geïmmuniseerd met plasmide DNA codering de nucleoproteïne (NP) van de stam van het H1N1 Influenza A/PuertoRico8. Figuur 4 toont opsomming van de reacties van de T-cel IFN-γ gepresenteerd als spot-vormende eenheden (SFU) gegenereerd over de duur van een vaccinatie-regime. ELISpot assay met PBMCs geoogst van niet-geïmmuniseerd dieren resultaten in te verwaarlozen plek graven (geen tx). Veertien dagen na de eerste immunisatie (prime), een gemiddelde van 970 IFN-γ spots per miljoen PBMCs telde na immunogene stimulatie. Zeven dagen na de tweede immunisatie (boost), werden T-cel reacties tegen alle drie zwembaden uitgebreid, bereiken een gemiddelde van 5020 IFN-γ-SFUs/106 PBMCs. zesenveertig dagen na de tweede immunisatie (geheugen), een gemiddelde totaal 6310 IFN-γ SFUs/10 6 PBMCs werden geteld in het perifere bloed.
FIGUUR LEGENDS:
Figuur 2 : Representatief beelden van lagen na dichtheid-verloop centrifugeren. (A) bloed proeven voor (links) en na (rechts) centrifugeren in regelmatige buizen. (B) bloed proeven voor (links) en na (rechts) centrifugeren in PBMC-isolatie-apparaten. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : Optimalisatie van het protocol. (A) typische uitstraling van IFN-γ positieve plekken in een ELISpot assay plaat goed ontwikkeld volgens het protocol. In het volgende voorbeeld drievoudige putten worden weergegeven na voorbehandeling met ethanol (rechts) of zonder voorbehandeling (links). Cellen werden geïncubeerd overnachting met DMSO (boven) als controle-neen stimulus, antigeen-matched peptiden (midden), of de mitogeen ConA (onder). PBMCs afkomstig is van hetzelfde individuele dier. Wells waren beeld met behulp van een geautomatiseerd plaat-scanner. (B) vergelijking van verschillende dichtheid-verloop buizen op verwerkte cellen. 3 mL bloedmonsters uit 3 individuele cavia's werden verzameld. 1,5 mL van elk monster werden verwerkt met behulp van reguliere buizen (dichtheid kleurovergang medium) of PBMC-isolatie-apparaten. Levensvatbaarheid (links, % ± SEM) en aantal levende cellen (rechts, x 106 ± SEM) werden bepaald met behulp van een automatische cel tellen systeem en trypan-blauw uitsluiting assay. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 : Detectie van robuuste cellulaire immuunresponsen in de loop van een vaccinatie regime. Op dag 1 en 15, werd 30 µg pDNA codering van influenza A nucleoproteïne (NP) tijdens dermally afgeleverd bij abdominale flank van Hartley cavia's onmiddellijk gevolgd door huid-electroporation. IFN-γ ELISpot reactie was 14 dagen na de eerste immunisatie (prime), en 7 dagen (boost) en 46 dagen (geheugen) gemeten na de tweede immunisatie. Gemiddelde SFUs + SEM werden uitgezet voor 5 behandelde cavia's en 2 onbehandelde cavia's (geen tx). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Discussion
De cavia is een waardevolle diermodel voor de pre-klinische ontwikkeling van vaccins en intradermale levering strategieën. Het bovenstaande protocol beschrijft de methode voor het meten van antigeen-specifieke T cel reacties in dit zeer relevant model. De bepaling geeft een duidelijke opsomming van T-cellen produceren van Interferon-gamma van de perifere na stimulatie met antigeen-specifieke peptiden. De kinetiek van de immuunrespons kan worden gecontroleerd door een niet-eindstandige bloedmonsters.
We het protocol geoptimaliseerd en geïdentificeerd kritieke aspecten om optimale resultaten met behulp van deze bepaling te verkrijgen. Bijvoorbeeld, de vorming van bloedstolsels in de collectie buis zal leiden tot suboptimaal PBMC herstel en levensvatbaarheid. Cavia bloedstolsels zeer snel18. Het is van cruciaal belang voor het uitvoeren van de loting bloed snel. Au-Birck et al. bieden een uitgebreide gids voor bloeden technieken in de cavia model16. Aangezien de bloedinzameling algemene anesthesie vereist, is het aanbevolen om herziening van de geldende standaardwerkvoorschriften van dit aspect van de procedure19. Onvoldoende verdoofde cavia's zullen reageren door het bewegen van hun benen of vocalisatie na een korte snuifje van het weefsel tussen hun tenen met uw nagels of door hun oren spier en hun snorharen toekomen na knijpen hun oor te verplaatsen. De onmiddellijke overdracht van het bloed in een buis met antistollingsmiddel en meng grondig door rollen of omkeren de buis meermaals is een essentiële stap in dit protocol. Voor het hier beschreven protocol EDTA-buizen werden gebruikt, en geen andere anticoagulantia werden getest. Houd er rekening mee dat EDTA is hypertonic, buizen moeten idealiter worden gevuld meer dan half vol, en dus de buis van de juiste grootte voor het monstervolume moet worden gebruikt.
Wanneer goed uitgevoerd, wordt de dichtheid kleurovergang centrifugeren consequent resulteert in schone PBMC voorbereiding. Het medium dichtheid-verloop moet op kamertemperatuur zijn wanneer gelaagdheid van de gradiënt voor centrifugeren en remmen mag niet worden gebruikt voor het stoppen van de centrifuge, bij het gebruik van reguliere buizen. Een aanzienlijke verbetering in termen van bruikbaarheid van de PBMC-verwerking was de combinatie van de kleurovergang centrifugeren dichtheid met PBMC-isolatie-apparaten. Dit zorgt voor een afname van de centrifugeertijd. De kleurovergang centrifugeren dichtheid in PBMC-isolatie apparaten en regelmatige buizen resultaten in vergelijkbare levensvatbaarheid, levende cellen telt van verwerkte PBMCs, en ter plaatse vorming. Onafhankelijk van het type buis gebruikt voor de scheiding, de buffy coat oogst moet onmiddellijk volgen. Over een langere periode van tijd is contact met het kleurverloop medium dichtheid cytotoxisch zijn voor de PBMCs.
Nauwkeurige tellen van levensvatbare PBMCs is belangrijk om zaad consequent gelijke aantallen cellen in de putjes assay-plaat. Een manier van leven/dood discriminatie moet worden toegepast. In ons lab gebruiken we de trypan-blauw uitsluiting bepaling en een geautomatiseerde cel-item.
Ter plaatse kwaliteit, gedefinieerd als scherpe en hoge contrasterende plekken, zal leiden tot verbeterde nauwkeurigheid en consistente plek tellen, vooral bij gebruik van een geautomatiseerd tellen systeem. We hebben vastgesteld in overeenstemming met de aanbevelingen van de fabrikant, ethanol pre behandelingen van de ELISpot-platen als een cruciale stap te verminderen van het aantal achtergrond vlekken en de definitie van de plekken te verbeteren. Het gebruik van een afleesapparaat om het imago van de ELISpot assay-platen aan het einde van het protocol wordt sterk aanbevolen. Originele beelden van elk putje kunnen worden gemakkelijk en efficiënt verkregen en opgeslagen. Met behulp van een afbeelding analysesoftware digitale beelden ook voorzien in objectieve analyse en ter plaatse tellen in vergelijking met handmatig tellen van individuele exploitanten.
Een absolute noodzaak voor de ontwikkeling van de hier beschreven test was de generatie van een geschikt anti-cavia Interferon-gamma antilichaam paar. Muis monoclonal antilichamen V-E4 en N-G3 werden ontwikkeld door hybridoma-techniek met B-cell klonen van muizen die werden geïmmuniseerd met recombinant cavia-interferon gamma20. V-E4, oftewel IgG1 isotype, en N-G3, oftewel IgG2a, worden gemeld te binden zowel aan de recombinante en inheemse antigeen. V-E4 als de vangst antilichaam en biotinyleerd N-G3 toewijzen als de detectieantilichaam in hoge gevoeligheid voor zowel inheemse als recombinant eiwitten resulteerde met behoud van de laag achtergrond signaal in een sandwich-ELISA-indeling. Beide antilichamen zijn beschikbaar voor de wetenschappelijke gemeenschap door middel van een productie-overeenkomst onder leiding van het laboratorium van Dr. Hubert Schaefer, die co-auteur van deze publicatie is. Aanvragen worden ontvangen door Dr. Schaefer de lab en vervolgens vervaardigd door een commerciële partner.
Interferon-gamma is gemeld dat unstable in regelmatige buffers of media21. Schaefer et al.20 alleen een gematigde daling van terugvinding gemeld bij het gebruik van gedegradeerd IFN-y, die biologische functies, in een ELISA-formaat met behulp van antilichamen V-E4 en N-G3 verloren hadden. Nochtans, verhoging van de incubatietijd van peptide stimulatie van PBMCs meer dan 18u moet worden zorgvuldig getest.
De voordelen van het gebruik van PBMCs is besproken. De hier beschreven test weerspiegelt echter alleen antigeen-specifieke reacties van circulerende T-cellen in de periferie. Weefsel-infiltreren T-cellen of cellen die zijn geïsoleerd van de lymfatische organen zoals de milt en lymfklieren, kunnen verschillende eigenschappen22,23,24vertonen. Geen significante verschillen in cellulaire reacties werden waargenomen bij vergelijking van interferon-gamma vlekken van PBMCs en splenocytes van cavia's die werden geïmmuniseerd met de dezelfde pNP influenza vaccin14.
In dit protocol beschreven we een intradermale inenting procedure. Een belangrijke reden voor ID immunisatie is gericht op de hoge dichtheid van dendritische cellen in de huid25aanwezig. Wij en anderen hebben aangetoond dat deze cellen specifiek kunnen worden gericht door leveringsmethode26, formulering27of28van de drug-ontwerp aan te passen. Geactiveerde professionele antigeen-presenteren cellen kunnen migreren naar een zuig lymfeklier en activeren van het adaptieve immuunsysteem29,30,31,32. Dendritische cellen zijn de essentiële antigeen presentatie-celtype voor productieve cellulaire immuunresponsen priming.
Voor deze studie dieren werden geïmmuniseerd met plasmide DNA codering de nucleoproteïne van influenza H1N1 stam A/PuertoRico/8. Levering van de huid van dit pDNA vaccin (pNP) in combinatie met electroporation had aangetoond dat het uitlokken van antigeen-specifieke Humorale reacties in33van de cavia's, fretten en niet-menselijke primaten (NHPs)1,34. Bovendien, dit vaccin ontlokte robuuste T-cel reacties in muizen na levering in de opperhuid35, die kan worden toegeschreven aan de CD4 en CD8 T-cellen door het stimuleren van met peptiden die specifieke epitopes voor deze cel-bevolking vertegenwoordigen. De pNP vaccin was ook immunogene na mucosal levering zoals blijkt uit de generatie van humorale reacties in konijnen en cavia's, evenals de cellulaire en humorale reacties in muizen36. Recentelijk was onze fractie kunnen aantonen van de generatie van IFN-γT-cel reacties in het konijn na intra musculaire levering (niet-gepubliceerde gegevens).
Op dit moment kunnen niet de waargenomen Interferon-gamma plekken in de cavia ELISpot worden toegewezen aan een subset van CD4 + of CD8 + T cellen. Vooral voor het ontwerp en de ontwikkeling van immuun therapie gericht op de huid, zou het zeer nuttig om te bepalen of de waargenomen interferon-gamma meetfrequenties worden veroorzaakt door uitbreiding van een bepaalde subset of een evenwichtig antwoord van beide ter de doeltreffendheid van de vaccinatie te leiden tot cross-presentatie. Deze beperking kan worden overwonnen door negatieve cel-sorteren voor CD4 of CD8 vóór het zaaien van de cellen op de plaat, of door identificatie van MHC klasse II (voor CD4 reacties) of de MHC klasse I (voor CD8 reacties) beperkt epitopes.
De hier beschreven Interferon-gamma ELISpot bepaling met behulp van cavia PBMCs adressen de noodzaak te beoordelen van de cursus van cellulaire reacties in de laboratoriummodel cavia. Dit zal het verfijnen van de ontwikkeling van vaccins en protocollen van de levering van de huid. Wij zijn van mening dat het mogelijk voor de tewerkstelling van deze relevante diermodel maakt om te studeren ziekten met belangrijke T-cell onderdelen zoals TB37, Ebola38, HSV39en anderen. Het zal vermindering van het gebruik van minder relevant diermodellen.
Disclosures
De auteurs Katherine Schultheis, Holly M. Pugh, Bryan S. Yung, Janet Oh, Holly M. Pugh, Jacklyn Nguyen, Laurent Humeau, Kate E. Broderick en Trevor R.F. Smithare werknemers van Inovio Pharmaceuticals en als zodanig ontvangen salaris en voordelen, met inbegrip van eigendom van aandelen- en optie van de voorraad, van het bedrijf.
Acknowledgments
We bedank de leden van de Inovio farmaceutische R & D afdeling voor technische bijstand en personeel van Acculab voor uitmuntendheid veehouderij dienstverlening. Met name zouden we graag bedanken Alysha Vu en Joe Agnes voor proeflezen van het manuscript. Dit werk werd niet gefinancierd door een specifieke subsidie van financieringsinstanties in de openbare, commerciële of not-for-profit sector.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cellectra-3P | Inovio Pharmaceuticals | ID-Electroporatio device/ non-commercial, R&D-only | |
| K2EDTA blood collection tube | BD | 367844 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Gibco | 14175-079 | |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthacre | 17144003 | density gradient medium |
| SepMate tube | STEMCELL Technologies | 85415 | PBMC-isolation device |
| RPMI | Thermo Fisher | 11875-135 | |
| heat-deactivated FBS | VWR | 97068-085 | |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | |
| β-Mercaptoethanol | Gibco | 21985-023 | |
| 96-well ELISpot PVDF-membrane | Millipore | MSIPS4W10 | ELISpot assay plate |
| Ethanol | Sigma | 459844-1L | |
| UPDI | Invitrogen | 10977-015 | Ultra-Pure DI water |
| Sucrose | Sigma | S7903 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A7906 | |
| 10x PBS | HyClone | SH30378.03 | |
| Concanavalin A (ConA) | Sigma | C5275-5MG | |
| alkaline phosphatase (ALP)-conjugated streptavidin | R&D Systems Inc. | SEL002 | |
| BCIP/NBT | R&D Systems Inc. | SEL002 | |
| capture anti-guinea pig IFN-γ antibody V-E4 | GenScript | Order #:U5472CE080-3 | LOT # A217071153 |
| biotinylated detection anti-guinea pig IFN-γ antibody N-G3 | GenScript | Order #:U5472CE080-1 | LOT # A21700598 |
| CTL S6 Micro Analyzer | ImmunoSpot | #S6MIC12 | automated ELISpot plate reader |
| Vi-CELL XR | Beckman-Coulter | 731050 | automated cell counter |
| ImmunoSpot 5.1 | ImmunoSpot | assay analysis software | |
| ESCO Class II Type A2 | ESCO | Biosafety cabinet | |
| Falcon cell strainer | Corning, Inc. | VWR cat# 21008-952 | |
| Exel Comfort Point Insulin syringe | MedLab Supply | 26028 | |
| Rotanta 460R | Hettich | centrifuge | |
| Vi-CELL XR Quad Pak Reagent Kit | Beckman Coulter | 383722 | |
| Incu Safe | Panasonic-Healthcare | incubator | |
| 22 µm Filter | ThermoScientific | VWR act# 597-4520 | 22 µm Filter |
| KimWipes | Kimberly-Clark Professional | VWR cat# 21903-005 | paper towels |
References
- Laddy, D. J., et al. Heterosubtypic protection against pathogenic human and avian influenza viruses via in vivo electroporation of synthetic consensus DNA antigens. PloS One. 3 (6), 2517 (2008).
- Lee, J. Y., Chang, J. Recombinant baculovirus-based vaccine expressing M2 protein induces protective CD8+ T-cell immunity against respiratory syncytial virus infection. Journal of Microbiology. 55 (11), 900-908 (2017).
- Kinnear, E., et al. Airway T cells protect against RSV infection in the absence of antibody. Mucosal Immunology. , (2017).
- Sridhar, S., et al. Cellular immune correlates of protection against symptomatic pandemic influenza. Nature Medicine. 19 (10), 1305-1312 (2013).
- Brand, H. K., et al. CD4+ T-cell counts and interleukin-8 and CCL-5 plasma concentrations discriminate disease severity in children with RSV infection. Pediatric Research. 73 (2), 187-193 (2013).
- Bouvier, N. M. Animal models for influenza virus transmission studies: a historical perspective. Current Opinion in Virology. 13, 101-108 (2015).
- St Claire, M. C., Ragland, D. R., Bollinger, L., Jahrling, P. B. Animal Models of Ebolavirus Infection. Comparative Medicine. 67 (3), 253-262 (2017).
- Todo, H. Transdermal Permeation of Drugs in Various Animal Species. Pharmaceutics. 9 (3), 33 (2017).
- Schafer, H., Burger, R. Tools for cellular immunology and vaccine research the in the guinea pig: monoclonal antibodies to cell surface antigens and cell lines. Vaccine. 30 (40), 5804-5811 (2012).
- Czerkinsky, C. C., Nilsson, L. A., Nygren, H., Ouchterlony, O., Tarkowski, A. A solid-phase enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay for enumeration of specific antibody-secreting cells. Journal of Immunological Methods. 65 (1-2), 109-121 (1983).
- Sedgwick, J. D., Holt, P. G. A solid-phase immunoenzymatic technique for the enumeration of specific antibody-secreting cells. Journal of Immunological Methods. 57 (1-3), 301-309 (1983).
- Moodie, Z., et al. Response definition criteria for ELISPOT assays revisited. Cancer Immunology, Immunotherapy. 59 (10), 1489-1501 (2010).
- Gillis, P. A., et al. Development of a novel, guinea pig-specific IFN-gamma ELISPOT assay and characterization of guinea pig cytomegalovirus GP83-specific cellular immune responses following immunization with a modified vaccinia virus Ankara (MVA)-vectored GP83 vaccine. Vaccine. 32 (31), 3963-3970 (2014).
- Schultheis, K., et al. Characterization of guinea pig T cell responses elicited after EP-assisted delivery of DNA vaccines to the skin. Vaccine. 35 (1), 61-70 (2017).
- Mantoux Tuberculin Skin Test DVD Facilitator Guide - CDC (Part One). , Available from: https://www.cdc.gov/tb/education/Mantoux/images/mantoux.pdf (2013).
- Birck, M. M., Tveden-Nyborg, P., Lindblad, M. M., Lykkesfeldt, J. Non-Terminal Blood Sampling Techniques in Guinea Pigs. Journal of Visualized Experiments. (92), e51982 (2014).
- Strober, W. Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability. Current Protocols in Immunology. 111, 1-3 (2014).
- Lewis, J. H. Comparative hematology: studies on guinea-pigs (Cavia porcellus). Comparative Biochemistry and Physiology: Comparative Physiology. 102 (3), 507-512 (1992).
- Flecknell, P. Laboratory Animal Anaesthesia (Fourth Edition). Flecknell, P. , Academic Press. 77-108 (2016).
- Schaefer, H., Kliem, G., Kropp, B., Burger, R. Monoclonal antibodies to guinea pig interferon-gamma: tools for cytokine detection and neutralization. Journal of Immunological Methods. 328 (1-2), 106-117 (2007).
- Lipiainen, T., et al. Formulation and stability of cytokine therapeutics. Journal of Pharmaceutical Sciences. 104 (2), 307-326 (2015).
- Wang, X. Z., et al. Virus-Specific CD8 T Cells in Peripheral Tissues Are More Resistant to Apoptosis Than Those in Lymphoid Organs. Immunity. 18 (5), 631-642 (2003).
- Veron, P., et al. Deep Sequencing of T Cell Receptor in Peripheral Blood and Muscle from Adeno-Associated Virus Vector-Injected Subjects Reveals Differences in T Cell Clonality Between the Two Compartments. Molecular Therapy. 23, 210 (2015).
- Sckisel, G. D., et al. Differential phenotypes of memory CD4 and CD8 T cells in the spleen and peripheral tissues following immunostimulatory therapy. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 5 (1), 33 (2017).
- Yanofsky, V. R., Mitsui, H., Felsen, D., Carucci, J. A. Understanding Dendritic Cells and Their Role in Cutaneous Carcinoma and Cancer Immunotherapy. Clinical and Developmental Immunology. 2013, 624123 (2013).
- Amante, D. H., et al. Direct Transfection of Dendritic Cells in the Epidermis After Plasmid Delivery Enhanced by Surface Electroporation. Human Gene Therapy Methods. 25 (6), 315-316 (2014).
- Mahe, B., et al. Nanoparticle-based targeting of vaccine compounds to skin antigen-presenting cells by hair follicles and their transport in mice. Journal of Investigative Dermatology. 129 (5), 1156-1164 (2009).
- Vandermeulen, G., et al. Skin-specific promoters for genetic immunisation by DNA electroporation. Vaccine. 27 (32), 4272-4277 (2009).
- Brave, A., Nystrom, S., Roos, A. K., Applequist, S. E. Plasmid DNA vaccination using skin electroporation promotes poly-functional CD4 T-cell responses. Immunology and Cell Biology. 89 (3), 492-496 (2011).
- Romani, N., et al. Targeting skin dendritic cells to improve intradermal vaccination. Current Topics in Microbiology and Immunology. 351, 113-138 (2012).
- Smith, T. R., et al. DNA vaccination strategy targets epidermal dendritic cells, initiating their migration and induction of a host immune response. Molecular Therapy Methods & Clinical Development. 1, 14054 (2014).
- Teunissen, M. B., Haniffa, M., Collin, M. P. Insight into the immunobiology of human skin and functional specialization of skin dendritic cell subsets to innovate intradermal vaccination design. Current Topics in Microbiology and Immunology. 351, 25-76 (2012).
- Lin, F., et al. A novel prototype device for electroporation-enhanced DNA vaccine delivery simultaneously to both skin and muscle. Vaccine. 29 (39), 6771-6780 (2011).
- Laddy, D. J., et al. Electroporation of synthetic DNA antigens offers protection in nonhuman primates challenged with highly pathogenic avian influenza virus. Journal of Virology. 83 (9), 4624-4630 (2009).
- Lin, F., et al. Optimization of Electroporation-Enhanced Intradermal Delivery of DNA Vaccine Using a Minimally Invasive Surface Device. Human Gene Therapy Methods. 23 (3), 157-168 (2012).
- Kichaev, G., et al. Electroporation mediated DNA vaccination directly to a mucosal surface results in improved immune responses. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 9 (10), 2041-2048 (2013).
- Klunner, T., Bartels, T., Vordermeier, M., Burger, R., Schafer, H. Immune reactions of CD4- and CD8-positive T cell subpopulations in spleen and lymph nodes of guinea pigs after vaccination with Bacillus Calmette Guerin. Vaccine. 19 (15-16), 1968-1977 (2001).
- Shedlock, D. J., et al. Induction of Broad Cytotoxic T Cells by Protective DNA Vaccination Against Marburg and Ebola. Molecular Therapy. 21 (7), 1432-1444 (2013).
- Hensel, M. T., et al. Prophylactic Herpes Simplex Virus 2 (HSV-2) Vaccines Adjuvanted with Stable Emulsion and Toll-Like Receptor 9 Agonist Induce a Robust HSV-2-Specific Cell-Mediated Immune Response, Protect against Symptomatic Disease, and Reduce the Latent Viral Reservoir. Journal of Virology. 91 (9), 02257 (2017).
