Summary
Utvecklingen av interferon-gamma ELISpot analysen för marsvin PBMC tillåter karakterisering av T-cell svar i denna mycket relevant modell för att studera infektionssjukdomar. Vi har tillämpat analysen för att mäta T-cell svar är associerad med intradermala leverans av DNA-vaccin.
Abstract
Marsvin har spelat en nyckelroll som en relevant små djurmodell i utvecklingen av vacciner mot infektionssjukdomar såsom tuberkulos, influensa, difteri och viral hemorragisk feber. Vi har visat att plasmid-DNA (pDNA) vaccin leverans i huden framkallar robust humorala svar i marsvin. Användningen av detta djur till modell immunsvar begränsades dock något tidigare på grund av bristen på tillgängliga reagenser och protokoll att studera T-cell svar. T-celler spelar en nyckelroll i både immunprofylaktiska och immunoterapeutisk mekanismer. Förstå T-cell svar är avgörande för utvecklingen av infektionssjukdomar och onkologi vacciner och tillmötesgående leverans enheter. Här beskriver vi interferon-gamma (IFN-γ) enzymkopplad immunospot (ELISpot) test för marsvin perifera mononukleära blodceller (PBMC). Analysen gör det möjligt för forskare att karakterisera vaccin-specifika T-cell svar i denna viktiga gnagare modell. Möjligheten till assay celler isolerade från perifert blod ger möjlighet att spåra Immunogenicitet hos enskilda djur.
Introduction
Protokollet beskrivs här möjliggör upptäckt av interferon-gamma (IFN-γ) utsöndrar celler efter antigen minns i en perifera mononukleära celler (PBMC) population skördas från Hartley marsvin. Vi har tillämpat analysen för att karakterisera kinetik och magnituder av antigen-specifika T-cell svar på en influensa vaccinering-regim i marsvin. Vi anser att detta protokoll kommer att kraftigt driva den prekliniska utvecklingen av vaccination program i denna mycket relevant djurmodell.
T-celler som framkallas av vacciner har en viktig roll i skyddet mot smittämnen och immunoterapeutisk vägar förknippas med andra sjukdomar. Betydelsen av T-celler har belysts i flera studier som vaccin. Immunisering av illrar och möss med en plasmid-DNA (pDNA) kodning för H5 hemagglutinin och N1 neuraminidas som tillhandahålls skydd från sjuklighet och dödlighet i en influensa virus utmaning i avsaknad av neutraliserande antikroppar, som visar vikten av T-cell immunitet1. Utöver starka neutraliserande humorala svar, T-celler spelar en avgörande roll för inte bara viral clearance2 utan även skydd mot infektion med respiratoriska syncytial virus (RSV) i möss3. I människor var redan existerande CD8 + T-celler associerade med minskad sjukdomens svårighetsgrad under H1N1 pandemin 20094. CD4 + T-cellsantal tillsammans med vissa cytokin plasmakoncentrationen är korrelerade med sjukdomens svårighetsgrad i RSV-infekterade barn5.
Marsvin har fick sitt genombrott som laboratorium modell för forskning och utveckling inom olika områden av läkemedel såsom hudsensibilisering, näringsforskning, studier av hörselsystemet och, mest relevanta för detta arbete, infektionssjukdomar. Det var avgörande för upptäckten av vaccin mot tuberkulos och difteri. Mer nyligen används marsvin som en modell för influensa6 och Ebola7. Dessutom erbjuder besitter fysiologiska likheter med mänsklig hud8, marsvin en lättillgänglig liten djurmodell för dermal drog leveransmetoder. I motsats till dess betydelse som laboratorium modell förblir tillgången på marsvin specifika analyser och sonder att karakterisera immunsvar begränsad9. Grundläggande cellulära analyser såsom den IFN-γ enzymkopplad immunospot (ELISpot-assay) som används rutinmässigt i prekliniska och kliniska forskning att räkna upp T-cell svar har inte varit tillgängliga.
De första fasta fas enzymkopplad immunospot analyserna användes för att bestämma antalet specifika antikropp-utsöndrar celler i en skiftande B cell-befolkning10,11. Formatet har avancerat för att identifiera celler som utsöndrar cytokiner inklusive IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, GM-CSF, TNF-alfa, TNF-beta, granzym B och IFN-γ. ELISpot analysen besitter hög känslighet; potentiellt kan varje cytokin-producerande cell upptäckas. Detektionsgränsen för ELISpot analyser har rapporterats vara lägre än 10 ställen per 100.000 PBMC12. Nyligen ett marsvin IFN-γ specifika antikroppen par gjordes tillgängliga13, och detta har öppnat upp möjlighet att åtgärda denna brist i fältet.
IFN-γ anses vara en viktig effektor molekyl i det adaptiva immunsvaret; Det kan produceras och utsöndras av både CD4 och CD8 T-celler vid aktivering. IFN-γ har ett brett utbud av biologiska funktioner i samband med ett immunsvar mot en virusinfektion, till exempel aktivering av makrofager och upp regleringen av stora histocompatibility komplex (MHC) jag och MHCII uttrycket. Den också främjar B-cell differentiering, hämmar T-helper-2 celltillväxt och aktiverar naturliga mördarceller. IFN-γ blockerar virusreplikation i infekterade kroppsceller och uppreglerar uttrycket av MHC molekyler. Produktion av IFN-γ är således en mycket viktig indikation på kvaliteten av T-cellssvar till ett vaccin eller patogen.
En viktig aspekt av det här presenterade IFN-γ ELISpot är användningen av PBMC snarare än splenocytes13. PBMC kan erhållas genom bearbetning av en icke-terminal insamlade blodprov, insamling av splenocytes kräver djur dödshjälp före skörd av mjälte. Användningen av PBMC ger IFN-γ T-cell svar övervakas över en tidsperiod och utvärdering av effekter på T-cell svar såsom prime-boost regimer14.
För forskare som för närvarande använder marsvin som en djurmodell, kommer metoden IFN-γ ELISpot bredda utbudet av vetenskapliga data som de kan få. Dess tillgänglighet kan nu minska nödvändigheten att genomföra studier med mindre relevanta djurmodeller för målet sjukdomen, som valdes tidigare på grund av reagens tillgänglighet för granskning av cellulära svar. Användning av PBMC snarare än mjälte eller lymfkörtlar tillåter icke-terminal experiment och kontinuerlig övervakning av enskilda djur.
Nedan ger vi en detaljerad beskrivning av de olika stegen i upptäckten av ett IFN-γ cellulära svaret hos marsvin pDNA vaccinet. Vi beskriver vårt specifika leverans förfarande och beskriva allmänna ELISpot analysen omfattar blodprovstagning, blod bearbetning, PBMC skörd, analysförfarande och dataanalys. En schematisk ELISpot analysens avbildas i figur 1.
Figur 1 : Schematisk översikt av marsvin ELISpot protokollet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Protocol
Alla metoderna som beskrivs här har godkänts av djur vård och användning kommittén (ACUC) av Acculab.
Obs: Protokollet kräver användningen av potentiellt farliga material. Vänligen hänvisa till tillverkarens MSDS och bära lämplig personlig utrustning (PPE) under hela förfarandet.
1. beredning av webbplatsen marsvin-immunisering, intrakutant Mantoux-injektion och CELLECTRA-3P-EP-förfarande
-
Beredning av behandlingsområdet på marsvin.
- Marsvin i en induktion kammare och bedöva på 5% isofluran-vapor.
- Ta bort djur från kammaren och placera näskotten i position, som ger 2% isofluran ånga för att underhålla anestesi under hela förfarandet.
- Raka området cirka 4 cm2 på buken flank.
- Desinficera rakade området med etanol-tuss.
-
Injektion av pDNA-formulering och elektroporation förfarande.
- Använd en Insulin-spruta för att injicera 100 µl formulering i dermis av Mantoux tekniken. Nålen sätts avfasning upp i 10 graders vinkel med djurets kropp.
- Ta bort nålen och omedelbart infoga CELLECTRA® - 3 P elektrod matrisen över den injektion-strimmigt och applicera elektriska fält.
- Ta bort djur från anestesi och bevaka dess återhämtning.
2. icke-terminal blöda
-
Blodinsamling från halsvenen bedövat marsvin.
- Marsvin i en induktion kammare och bedöva djuret som beskrivs i 1.1.1
- Med en 3 ml spruta med en 27G 1/2 tums kanyl, punktera halsvenen av bedövat djur och samla 3 ml blod.
- Omedelbart överföra blod i K2EDTA bloduppsamlingsrör, Invertera tube flera gånger för att blanda blod med antikoagulantia och plats på is.
Obs: Undvikande av blodpropp är avgörande för framgångsrik nedströms behandling av blodprovet. - Övervaka djurets återhämtning.
3. blod prov bearbetning
-
Separation av PBMC från helblod täthetlutning centrifugering
- Späd blod 1:1 med Hank's Balanced Salt lösning (HBSS).
Obs: För att undvika kontaminering allt arbete från och med nu bör utföras i ett biosäkerhet skåp använda aseptisk teknik. - Lager utspädd blod gradvis under 4,5 ml Ficoll-Paque Plus i en 15 ml-koniska rör. Undvika störningar av gränssnittet. Obs: För att säkerställa ordentlig separation, Ficoll-Paque måste vara vid rumstemperatur.
- Centrifugera rören vid 800 rcf för 30 min med broms.
Obs: som ett alternativ, SepMate™ rör (STEMCELL teknik) kan användas för PBMC-avskiljande. HBSS utspädda blod tillförs 15 ml SepMate tube fylld med 3,5 ml Ficoll-Paque Plus och sedan centrifugeras vid 1200 rcf i 10 min (bromsar). Denna tidsbesparande gradient centrifugering teknik resulterar i lika livskraft, cell-avkastning och spot-formation. - Skörda Buffy-Coat lager och späd i R10 medium (10% (v/v) värme-avaktiveras FBS och 1% (v/v) penna/Strep i RPMI1640 medium) till en total volym på 15 ml.
- Pellet celler genom centrifugering vid 450 rcf för 5 min.
- Tvätta cellerna två gånger med R10 medium.
- Resuspendera cellerna i 1 ml R10 och cell-suspension genom 70 µm cell-SIL i till en ny tub.
- Räkna celler och fastställa antalet levande celler av Trypan-blå färgning.
- Späd cellerna med R10 medium till en koncentration av 1 x 10 ^ 6 levande celler per ml.
- Späd blod 1:1 med Hank's Balanced Salt lösning (HBSS).
4. beredning av ELISpot-plattor och cell-stimulering
-
Päls och block brunnar i en plattan med 96 brunnar ELISpot PVDF-membran innan sådd PBMC.
- Plattor bör förbehandlas i 60 sekunder. Före behandling med etanol kommer att resultera i mindre ospecifika spot-formation och ställen med förbättrad definition.
Obs: Extra försiktig att säkerställa fullständig membranet kommer i kontakt med 15 µl 35% etanol. - Efter 60 sekunder Tillsätt 150 µl 1 x PBS per brunn, och töm sedan ut brunnar genom att invertera plattorna.
Obs: Etanol förbehandling är mycket känsliga. Inte Inkubera väl-membranet längre än 60 sekunder membran inte måste torkar ut under de följande stegen i förfarandet. - Tvätta plattorna tre gånger med 250 µl 1 x PBS per brunn.
- Päls med 100 µl per brunn av 5 µg/ml fånga anti marsvin IFN-γ antikropp V-E4 i PBS.
- Inkubera plattorna för minst 12 timmar vid 4° C.
- Tvätta plattorna genom att lägga till 250 µl per brunn PBS tre gånger.
- Tillsätt 200 µl per brunn blockerande buffert (10% sackaros (w/v) och 2% (w/v) BSA i PBS) och Inkubera under 2 timmar i rumstemperatur.
- Tvätta plattorna med 250 µl per brunn PBS tre gånger.
- Plattor bör förbehandlas i 60 sekunder. Före behandling med etanol kommer att resultera i mindre ospecifika spot-formation och ställen med förbättrad definition.
-
Plattan PBMC med antigen-specifika peptider, positiva och negativa kontroller.
- Späd protein-peptid pool i R10 till önskad slutliga peptid koncentration.
- Analysen av provet PBMC i exemplar.
Obs: Lägg medium med stimulantia till ELISpot pläterar först och PBMC suspensionen näst. - Tillsätt 50 µl av peptid-R10 medium indikerade brunnar.
- Tillsätt 50 µl tom peptid formulering i R10 i indikerade brunnar för negativ kontroll.
- För positiv kontroll lägga till 5 µg/ml Concanavalin A (ConA) i R10 medium i angivna brunnar.
- Tillsätt 100 µl av PBMC-cellsuspension alla brunnar
- Inkubera plattorna i befuktade 5% CO2 atmosfär vid 37° Celsius för 18 timmar.
Obs: Plats ELISpot tallrikar på en jämn yta/rack i inkubatorn och undvika störningar på plattorna under inkubationstiden.
5. identifiering av Interferon-gamma positiva fläckar
-
Inkubation med identifiering av antikroppar och plattan utveckling.
Obs: För alla steg i det här avsnittet ingen aseptisk teknik krävs.- Ta försiktigt bort plattorna från inkubator och säkert tomma brunnar. Tvätta plattorna genom att lägga till 250 µl per brunn PBS för tre gånger.
- Tillsätt 100 µl per brunn av 2 µg/ml biotinylerade anti marsvin IFN-γ detektionsantikropp N-G3 utspädd i blockerande buffert.
Obs: Filter (22 µm) antikropp lösning att minska bakgrunden. - Inkubera med detektionsantikropp för 2 timmar i rumstemperatur.
- Kassera supernatanten och tvätta plattorna genom att lägga till 250 µl per brunn PBS tre gånger.
- Tillsätt 100 µl per brunn av alkaliskt fosfatas (ALP)-konjugerad streptividin utspädd i blockerande buffert.
Obs: Filter (22 µm) lösning att minska bakgrunden. - Inkubera med ALP-streptividin konjugat i 1 timme vid rumstemperatur.
- Kassera ALP-streptividin lösning och tvätta plattorna genom att lägga till 250 µl per brunn PBS två gånger och ta bort överflödig PBS genom invertering plattan och läska det mot en ren pappershandduk.
- Tvätta plattorna genom att lägga till 250 µl per brunn ultrarent Avjoniserat vatten en gång, och avlägsna överskottsvatten genom invertering plattan och läska det mot en ren pappershandduk.
- Tillsätt 100 µl av Beneluxkonventionen/NBT (försiktighet) substratlösningen i varje brunn. Varning: Beneluxkonventionen/NBT är mycket brandfarligt och giftigt vid förtäring, hudkontakt, eller inandas. Före användning se SDB.
- Inkubera i 20 min i rumstemperatur skyddas från ljus.
- Skölj plattan 4 gånger med avjoniserat vatten. Vänd plattan och tryck för att avlägsna överskottsvatten.
- Ta bort plast dränering från botten av ELISpot plattorna och låta plattorna torka.
- Kvantifiera ställen manuellt eller med hjälp av en automatiserad ELISpot-läsare, till exempel CTL-Immunospot S6 plattan läsaren.
Representative Results
Resultaten presenteras här tjäna som referens för förväntade resultat efter användning av detta protokoll, betona vikten av avgörande steg och bekräftar fördelarna med beskrivs optimeringar.
Efter täthetlutning centrifugering, enligt beskrivningen i steg 3.1 i protokollet, innehåller den röda trögflytande vätskan på botten av röret de flesta av de röda blodkropparna. Som visas i figur 2ärA, ovanför de röda blodkropparna ett lager av densitet-medium. Mellan ett lager av klar eller gula plasma på toppen och densiteten är gradient medium vit eller ljust brun lättcellsskikt lager, som innehåller de flesta vita blodkroppar och blodplättar. Ofullständig separation skulle manifesteras som förekomst av röda blodkroppar ovanpå täthetlutning mediet. Röda färgning av plasma i figur 2A är troligen på grund av hemolys, som detta blodprov lagrades i samling röret 1,5 h innan de behandlas. Figur 2 B visar övertoningen före (vänster) och efter (höger) centrifugering i Laboratoriestammar-isolering enhet. Blodprov i figur 2B bearbetades med minimal fördröjning efter blodinsamling och plasma färgning är gula.
Effekten av pre vätning membran med etanol (se steg 4.1 i protokollet) på plats-utveckling visas i figur 3. Ställen i förbehandlade brunnar visar förbättrad definition, och det finns en minskning av antalet ställen i medium/DMSO negativa kontrollbrunnar (figur 3A). Typiska livskraft bearbetade marsvin PBMC varierar runt 90% och är liknande för både regelbundna 15 mL rör och Laboratoriestammar-isolering enheter (figur 3B). Avkastningen av viabla celler från en 3 mL blodprov varierar vanligtvis mellan 3 x 106 och 5 x 106.
Djur vaccinerades med plasmid DNA kodning av nucleoprotein (NP) av H1N1 influensa stam A/PuertoRico8. Figur 4 visar uppräkning av T-cell IFN-γ svaren presenteras som spot-bilda enheter (SFU) genererade över varaktigheten av en vaccination regim. ELISpot assay med PBMC skördas från icke-vaccinerade djur resultat i försumbar plats räknas (ingen tx). Fjorton dagar efter den första immunisering (prime), ett genomsnitt av 970 IFN-γ ställen per miljon PBMC räknades immunogent stimulation. Sju dagar efter den andra immunisering (boost), utökades T-cell svar mot alla tre pooler, nå ett genomsnitt på 5020 IFN-γ SFUs/106 PBMC. fyrtiosex dagar efter den andra immunisering (minne), en genomsnittlig totalt 6310 IFN-γ SFUs/10 6 PBMC räknades i perifert blod.
FIGUR LEGENDS:
Figur 2 : Representativa bilder av lager efter täthetlutning centrifugering. (A) blod prov före (vänster) och efter (höger) centrifugering i vanliga rör. (B) blod prov före (vänster) och efter (höger) centrifugering i Laboratoriestammar-isolering-enheter. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Optimering av protokollet. (A) typiska utseende av IFN-γ positiva fläckar i en ELISpot assay plattan väl utvecklat enligt protokollet. Exempel tre exemplar brunnar visas efter förbehandling med etanol (höger) eller utan förbehandling (vänster). Celler inkuberades övernattning antingen med DMSO (överst) som nr-stimulus kontroll, antigen-matchade peptider (mitten), eller mitogen ConA (nederst). PBMC härstammar från samma enskilda djur. Wells var avbildas med hjälp av en automatiserad plattan-skanner. (B) jämförelse av olika täthetlutning rören på bearbetade celler. 3 mL blodprov från 3 individuella marsvin samlades. 1,5 mL av varje prov bearbetades med antingen vanlig rör (täthet lutning medium) eller Laboratoriestammar-isolering-enheter. Lönsamhet (vänster, % ± SEM) och antalet levande celler (höger, x 106 ± SEM) bestämdes med en automatisk cell räknar systemet och trypan-blå utslagning assay. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Påvisande av robust cellulära immunsvaret under loppet av en vaccination regim. Dag 1 och 15 levererades 30 µg pDNA kodning influensa A nucleoprotein (NP) inom dermally till buken flanken av Hartley marsvin följs omedelbart av huden-elektroporation. IFN-γ ELISpot svar mättes 14 dagar efter den första immunisering (prime), och 7 dagar (boost) och 46 dagar (minne) efter den andra immunisering. Genomsnittlig SFUs + SEM var ritade för 5 behandlade marsvin och 2 obehandlad marsvin (ingen tx). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Marsvin är en värdefull djurmodell för den prekliniska utvecklingen av vacciner och intrakutana leverans strategier. Det ovannämnda protokollet beskriver metoden för att mäta antigen-specifika T-cell svar i denna mycket relevant modell. Analysen ger en tydlig uppräkning av perifera T-celler producera Interferon-gamma vid stimulering med antigen-specifika peptider. Kinetiken av immunsvar kan övervakas av icke-terminal blodprovstagning.
Vi optimerad protokollet och identifierade kritiska aspekter för optimala resultat med hjälp av denna analys. Till exempel kommer att bildandet av blodproppar i samling röret resultera i suboptimala PBMC återhämtning och livskraft. Guinea pig blodproppar mycket snabbt18. Det är viktigt att utföra blodprov snabbt. Au-Birck et al. ger en heltäckande guide för blödning tekniker i marsvin model16. Eftersom samlingen blod kräver narkos, är det rekommenderat att granska tillämpliga standardrutiner för denna aspekt av förfarandet19. Otillräckligt bedövat marsvin kommer att reagera genom att flytta sina ben eller vocalization efter en kort nypa av vävnad mellan sina tår med naglarna eller genom rygga tillbaka sina öron och flytta sina morrhår framåt efter klämmande sitt öra. Omedelbar överföring av blod i ett rör med antikoagulantia och blanda grundligt av rullande eller invertera röret flera gånger är ett viktigt steg i detta protokoll. EDTA-rör användes för det här beskrivna protokollet, och inga andra antikoagulantia testades. Observera att EDTA är hyperton, rören bör helst fyllas mer än halvfullt, och därför den lämplig rörstorlek provvolymen måste användas.
När de utförs korrekt, resulterar täthet lutning centrifugering konsekvent i ren PBMC förberedelse. Täthetlutning mediet måste vara rumstempererat när skiktning övertoningen innan centrifugering och bromsarna bör inte användas för att stoppa centrifugen när du använder vanliga rör. En betydande förbättring när det gäller praktiska av PBMC-behandling var kombinationen av täthet lutning centrifugering med Laboratoriestammar-isolering-enheter. Detta möjliggör en minskning av centrifugeringstid. Densitet gradient centrifugering i Laboratoriestammar-isolering enheter och regelbundna rör resultat liknande lönsamhet, levande blodkroppar av bearbetade PBMC och plats bildandet. Oberoende av typ av slang som används för separation, lättcellsskikt skörden bör följa omedelbart. Över en längre tidsperiod är kontakt med täthet lutning medium cytotoxiska för PBMC.
Korrekt räkna av livskraftiga PBMC är viktigt att utsäde konsekvent lika många celler i assay-plattan brunnar. Någon metod av live/dead diskriminering bör tillämpas. I vårt labb använder vi trypan-blå utslagning analysen och en automatiserad cell-räknare.
Spot kvalitet, definierat som vassa och hög kontrast ställen, kommer att resultera i förbättrad noggrannhet och konsekvent plats räkna, speciellt när man använder ett automatiserat räknande system. I enlighet med tillverkarens rekommendationer observerat vi etanol före behandlingar av ELISpot plattorna vara ett avgörande steg för att minska antalet bakgrund fläckar och förbättra definitionen av fläckarna. Användning av en Plattläsare till bild ELISpot assay-plattorna i slutet av protokollet rekommenderas. Ursprungliga bilder av varje brunn kan enkelt och effektivt sätt erhållits och lagras. Använda en bild analys programvara digitala bilder också möjliggöra objektiv analys och spot räknar jämfört manuell räkning av enskilda operatörer.
En absolut nödvändighet för utvecklingen av analysen beskrivs här var generering av en lämplig anti marsvin Interferon-gamma antikropp par. Monoklonala musantikroppar V-E4 och N-G3 utvecklades av hybridom-teknik med B-cell kloner från möss som vaccinerades med rekombinant marsvin interferon gamma20. V-E4, vilket är isotypen IgG1, och N-G3, som är IgG2a, rapporteras att binda både till rekombinant och infödda antigen. Tilldela V-E4 som capture antikropp och biotinylerade N-G3 som detektionsantikropp resulterade i hög känslighet för såväl inföding som rekombinant protein bibehållen låg bakgrund signal i en sandwich-ELISA-format. Det finns både antikroppar för det vetenskapliga samfundet genom ett tillverkningsavtal som leds av laboratoriet för Dr. Hubert Schaefer, som är medförfattare till denna publikation. Önskemål kommer att tas emot av Dr. Schaefer's lab och sedan tillverkas av en kommersiell partner.
Interferon-gamma rapporteras vara instabil i vanliga buffertar eller media21. Schaefer et al.20 rapporterade endast en måttlig minskning av återvinningsgraden när använda degraderad IFN-y, som hade förlorat biologiska funktioner, i en ELISA-format med antikroppar V-E4 och N-G3. Dock bör ökar inkubationstiden av peptid stimulering av PBMC över 18 h noggrant testas.
Fördelarna med att använda PBMC har diskuterats. Här beskrivs analysen återspeglar emellertid endast antigen-specifika Svaren av cirkulerande T-celler i periferin. Vävnad-infiltrera T-celler eller celler som isolerats från lymfatiska organ, såsom mjälten och lymfkörtlarna, kan uppvisa olika egenskaper22,23,24. Inga signifikanta skillnader i cellulära svar observerades vid jämförelse av interferon-gamma fläckar från PBMC och splenocytes från marsvin som vaccinerades med samma pNP influensa vaccin14.
I detta protokoll beskrev vi ett förfarande för intradermal vaccination. En huvudsaklig bevekelsegrund för ID immunisering riktar den höga tätheten av dendritiska celler som finns i huden25. Vi och andra har visat att dessa celler kan riktas specifikt genom att anpassa leveransmetod26, formulering27eller läkemedelsdesign28. Aktiverade professionella antigen-presenterande celler kan migrera till en dränerande lymfkörtel och aktivera den adaptiva immunsystem29,30,31,32. Dendritiska celler är den väsentliga antigen presentation-celltypen för grundning produktiva cellulära immunsvaret.
För denna studie djur vaccinerades med plasmid DNA kodning av nucleoprotein influensa H1N1-stam A/PuertoRico/8. Huden leverans av detta pDNA vaccin (pNP) i kombination med elektroporation hade visat sig framkalla antigen-specifika humorala svar i guinea gris33, illrar och icke-mänskliga primater (NHPs)1,34. Dessutom framkallade detta vaccin robusta T-cell svar hos möss efter leverans till epidermis35, som kunde hänföras till CD4 och CD8 T-celler genom att stimulera med peptider som representerar specifika epitoper för dessa cell-populationer. PNP vaccinet var också immunogent efter slemhinnor leverans vilket framgår av generation av humorala svar i kaniner och marsvin, liksom cellulära och humorala svar i möss36. Vår grupp var nyligen, kan påvisa att generationen av IFN-RORγt-cell Svaren hos kanin efter intramuskulär leverans (opublicerade data).
För närvarande, kan inte de observerade Interferon-gamma-platserna i marsvin ELISpot tilldelas en CD4 + eller CD8 + T-cell delmängd. Särskilt för utformning och utveckling av immun terapier inriktning huden, skulle det vara mycket användbart för att avgöra huruvida observerade interferon-gamma frekvenser orsakas av expansion av en viss delmängd eller ett balanserat svar av båda för att utvärdera effektiviteten av vaccinationen att utlösa cross-presentation. Denna begränsning kan övervinnas av negativa cell-sortering för CD4 och CD8 före sådd cellerna på plattan eller av identifiering av MHC klass II (för CD4 svar) eller MHC klass I (för CD8 svar) begränsad epitoper.
Här beskrivs Interferon-gamma ELISpot analysen använder marsvin PBMC adresser behovet att bedöma loppet av cellulära svar i marsvin laboratorium modellen. Detta kommer att förfina utveckling av vacciner och hud leverans protokoll. Vi tror att det kan för anställning av detta relevant djurmodell för att studera sjukdomar med viktiga T-cell komponenter såsom TB37, Ebola38, HSV39och andra. Det kommer att minska användningen av mindre relevanta djurmodeller.
Disclosures
Författarna Katherine Schultheis, Holly M. Pugh, Bryan S. Yung, Janet Oh, Holly M. Pugh, Jacklyn Nguyen, Laurent Humeau, Kate E. Broderick och Trevor R.F. Smithare anställda Inovio läkemedel och som sådan får lön och förmåner, inklusive äganderätten till lager och lager alternativ, från företaget.
Acknowledgments
Vi vill tacka medlemmarna i Inovio Pharmaceuticals R & D avdelning för tekniskt bistånd och Personalen på Acculab för att ge spetskompetens djurhållning service. Särskilt vill vi tacka Alysha Vu och Joe Agnes för korrekturläsning manuskriptet. Detta arbete var inte finansieras av några specifika bidrag från finansiärer inom den offentliga, kommersiella eller icke-vinstdrivande sektorn.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cellectra-3P | Inovio Pharmaceuticals | ID-Electroporatio device/ non-commercial, R&D-only | |
| K2EDTA blood collection tube | BD | 367844 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Gibco | 14175-079 | |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthacre | 17144003 | density gradient medium |
| SepMate tube | STEMCELL Technologies | 85415 | PBMC-isolation device |
| RPMI | Thermo Fisher | 11875-135 | |
| heat-deactivated FBS | VWR | 97068-085 | |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | |
| β-Mercaptoethanol | Gibco | 21985-023 | |
| 96-well ELISpot PVDF-membrane | Millipore | MSIPS4W10 | ELISpot assay plate |
| Ethanol | Sigma | 459844-1L | |
| UPDI | Invitrogen | 10977-015 | Ultra-Pure DI water |
| Sucrose | Sigma | S7903 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A7906 | |
| 10x PBS | HyClone | SH30378.03 | |
| Concanavalin A (ConA) | Sigma | C5275-5MG | |
| alkaline phosphatase (ALP)-conjugated streptavidin | R&D Systems Inc. | SEL002 | |
| BCIP/NBT | R&D Systems Inc. | SEL002 | |
| capture anti-guinea pig IFN-γ antibody V-E4 | GenScript | Order #:U5472CE080-3 | LOT # A217071153 |
| biotinylated detection anti-guinea pig IFN-γ antibody N-G3 | GenScript | Order #:U5472CE080-1 | LOT # A21700598 |
| CTL S6 Micro Analyzer | ImmunoSpot | #S6MIC12 | automated ELISpot plate reader |
| Vi-CELL XR | Beckman-Coulter | 731050 | automated cell counter |
| ImmunoSpot 5.1 | ImmunoSpot | assay analysis software | |
| ESCO Class II Type A2 | ESCO | Biosafety cabinet | |
| Falcon cell strainer | Corning, Inc. | VWR cat# 21008-952 | |
| Exel Comfort Point Insulin syringe | MedLab Supply | 26028 | |
| Rotanta 460R | Hettich | centrifuge | |
| Vi-CELL XR Quad Pak Reagent Kit | Beckman Coulter | 383722 | |
| Incu Safe | Panasonic-Healthcare | incubator | |
| 22 µm Filter | ThermoScientific | VWR act# 597-4520 | 22 µm Filter |
| KimWipes | Kimberly-Clark Professional | VWR cat# 21903-005 | paper towels |
References
- Laddy, D. J., et al. Heterosubtypic protection against pathogenic human and avian influenza viruses via in vivo electroporation of synthetic consensus DNA antigens. PloS One. 3 (6), 2517 (2008).
- Lee, J. Y., Chang, J. Recombinant baculovirus-based vaccine expressing M2 protein induces protective CD8+ T-cell immunity against respiratory syncytial virus infection. Journal of Microbiology. 55 (11), 900-908 (2017).
- Kinnear, E., et al. Airway T cells protect against RSV infection in the absence of antibody. Mucosal Immunology. , (2017).
- Sridhar, S., et al. Cellular immune correlates of protection against symptomatic pandemic influenza. Nature Medicine. 19 (10), 1305-1312 (2013).
- Brand, H. K., et al. CD4+ T-cell counts and interleukin-8 and CCL-5 plasma concentrations discriminate disease severity in children with RSV infection. Pediatric Research. 73 (2), 187-193 (2013).
- Bouvier, N. M. Animal models for influenza virus transmission studies: a historical perspective. Current Opinion in Virology. 13, 101-108 (2015).
- St Claire, M. C., Ragland, D. R., Bollinger, L., Jahrling, P. B. Animal Models of Ebolavirus Infection. Comparative Medicine. 67 (3), 253-262 (2017).
- Todo, H. Transdermal Permeation of Drugs in Various Animal Species. Pharmaceutics. 9 (3), 33 (2017).
- Schafer, H., Burger, R. Tools for cellular immunology and vaccine research the in the guinea pig: monoclonal antibodies to cell surface antigens and cell lines. Vaccine. 30 (40), 5804-5811 (2012).
- Czerkinsky, C. C., Nilsson, L. A., Nygren, H., Ouchterlony, O., Tarkowski, A. A solid-phase enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay for enumeration of specific antibody-secreting cells. Journal of Immunological Methods. 65 (1-2), 109-121 (1983).
- Sedgwick, J. D., Holt, P. G. A solid-phase immunoenzymatic technique for the enumeration of specific antibody-secreting cells. Journal of Immunological Methods. 57 (1-3), 301-309 (1983).
- Moodie, Z., et al. Response definition criteria for ELISPOT assays revisited. Cancer Immunology, Immunotherapy. 59 (10), 1489-1501 (2010).
- Gillis, P. A., et al. Development of a novel, guinea pig-specific IFN-gamma ELISPOT assay and characterization of guinea pig cytomegalovirus GP83-specific cellular immune responses following immunization with a modified vaccinia virus Ankara (MVA)-vectored GP83 vaccine. Vaccine. 32 (31), 3963-3970 (2014).
- Schultheis, K., et al. Characterization of guinea pig T cell responses elicited after EP-assisted delivery of DNA vaccines to the skin. Vaccine. 35 (1), 61-70 (2017).
- Mantoux Tuberculin Skin Test DVD Facilitator Guide - CDC (Part One). , Available from: https://www.cdc.gov/tb/education/Mantoux/images/mantoux.pdf (2013).
- Birck, M. M., Tveden-Nyborg, P., Lindblad, M. M., Lykkesfeldt, J. Non-Terminal Blood Sampling Techniques in Guinea Pigs. Journal of Visualized Experiments. (92), e51982 (2014).
- Strober, W. Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability. Current Protocols in Immunology. 111, 1-3 (2014).
- Lewis, J. H. Comparative hematology: studies on guinea-pigs (Cavia porcellus). Comparative Biochemistry and Physiology: Comparative Physiology. 102 (3), 507-512 (1992).
- Flecknell, P. Laboratory Animal Anaesthesia (Fourth Edition). Flecknell, P. , Academic Press. 77-108 (2016).
- Schaefer, H., Kliem, G., Kropp, B., Burger, R. Monoclonal antibodies to guinea pig interferon-gamma: tools for cytokine detection and neutralization. Journal of Immunological Methods. 328 (1-2), 106-117 (2007).
- Lipiainen, T., et al. Formulation and stability of cytokine therapeutics. Journal of Pharmaceutical Sciences. 104 (2), 307-326 (2015).
- Wang, X. Z., et al. Virus-Specific CD8 T Cells in Peripheral Tissues Are More Resistant to Apoptosis Than Those in Lymphoid Organs. Immunity. 18 (5), 631-642 (2003).
- Veron, P., et al. Deep Sequencing of T Cell Receptor in Peripheral Blood and Muscle from Adeno-Associated Virus Vector-Injected Subjects Reveals Differences in T Cell Clonality Between the Two Compartments. Molecular Therapy. 23, 210 (2015).
- Sckisel, G. D., et al. Differential phenotypes of memory CD4 and CD8 T cells in the spleen and peripheral tissues following immunostimulatory therapy. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 5 (1), 33 (2017).
- Yanofsky, V. R., Mitsui, H., Felsen, D., Carucci, J. A. Understanding Dendritic Cells and Their Role in Cutaneous Carcinoma and Cancer Immunotherapy. Clinical and Developmental Immunology. 2013, 624123 (2013).
- Amante, D. H., et al. Direct Transfection of Dendritic Cells in the Epidermis After Plasmid Delivery Enhanced by Surface Electroporation. Human Gene Therapy Methods. 25 (6), 315-316 (2014).
- Mahe, B., et al. Nanoparticle-based targeting of vaccine compounds to skin antigen-presenting cells by hair follicles and their transport in mice. Journal of Investigative Dermatology. 129 (5), 1156-1164 (2009).
- Vandermeulen, G., et al. Skin-specific promoters for genetic immunisation by DNA electroporation. Vaccine. 27 (32), 4272-4277 (2009).
- Brave, A., Nystrom, S., Roos, A. K., Applequist, S. E. Plasmid DNA vaccination using skin electroporation promotes poly-functional CD4 T-cell responses. Immunology and Cell Biology. 89 (3), 492-496 (2011).
- Romani, N., et al. Targeting skin dendritic cells to improve intradermal vaccination. Current Topics in Microbiology and Immunology. 351, 113-138 (2012).
- Smith, T. R., et al. DNA vaccination strategy targets epidermal dendritic cells, initiating their migration and induction of a host immune response. Molecular Therapy Methods & Clinical Development. 1, 14054 (2014).
- Teunissen, M. B., Haniffa, M., Collin, M. P. Insight into the immunobiology of human skin and functional specialization of skin dendritic cell subsets to innovate intradermal vaccination design. Current Topics in Microbiology and Immunology. 351, 25-76 (2012).
- Lin, F., et al. A novel prototype device for electroporation-enhanced DNA vaccine delivery simultaneously to both skin and muscle. Vaccine. 29 (39), 6771-6780 (2011).
- Laddy, D. J., et al. Electroporation of synthetic DNA antigens offers protection in nonhuman primates challenged with highly pathogenic avian influenza virus. Journal of Virology. 83 (9), 4624-4630 (2009).
- Lin, F., et al. Optimization of Electroporation-Enhanced Intradermal Delivery of DNA Vaccine Using a Minimally Invasive Surface Device. Human Gene Therapy Methods. 23 (3), 157-168 (2012).
- Kichaev, G., et al. Electroporation mediated DNA vaccination directly to a mucosal surface results in improved immune responses. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 9 (10), 2041-2048 (2013).
- Klunner, T., Bartels, T., Vordermeier, M., Burger, R., Schafer, H. Immune reactions of CD4- and CD8-positive T cell subpopulations in spleen and lymph nodes of guinea pigs after vaccination with Bacillus Calmette Guerin. Vaccine. 19 (15-16), 1968-1977 (2001).
- Shedlock, D. J., et al. Induction of Broad Cytotoxic T Cells by Protective DNA Vaccination Against Marburg and Ebola. Molecular Therapy. 21 (7), 1432-1444 (2013).
- Hensel, M. T., et al. Prophylactic Herpes Simplex Virus 2 (HSV-2) Vaccines Adjuvanted with Stable Emulsion and Toll-Like Receptor 9 Agonist Induce a Robust HSV-2-Specific Cell-Mediated Immune Response, Protect against Symptomatic Disease, and Reduce the Latent Viral Reservoir. Journal of Virology. 91 (9), 02257 (2017).
